CN117757650B - 一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用，属于酿酒技术领域。本发明首次采用杂交育种的方式获得了一株能够低产高级醇和/或高产乙酸乙酯的酿酒酵母QL‑001，采用本发明提供的菌株进行酒产品制备时，酒液中异丁醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低16.21％、12.64％；异戊醇含量分别降低19.86％、15.9％；活性戊醇含量分别降低27.76％、39.77％，乙酸乙酯含量分别提升15.9％、56.7％。本发明提供的酿酒酵母QL‑001具有降低高级醇含量以及提升香气物质乙酸乙酯含量的优点，且性能稳定。
Description
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母及其在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用。
背景技术
高级醇(Higher alcohols)俗称杂醇油(Fusel alcohol)，是指具有三个碳以上的一元醇类，在酒精饮料中的含量一般为酒精含量的(0.5～0.7)％，是葡萄酒发酵过程中的主要副产物，主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇。
乙酸乙酯，葡萄酒中的一种重要的香气物质，具有水果气息，乙酸乙酯的产生大多由于酵母利用葡萄糖发酵而成。在葡萄酒的酿造过程中，葡萄酒的特征性香味以及有益于人体健康的物质含量尤为重要。葡萄酒的特征性香气主要来源于原料香、发酵香、陈酿香。
专利文献CN110373341A(申请号201910669531.2)公开了一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法。通过敲除啤酒酵母中的BIO3基因和BIO5基因。最终发酵液高级醇总量分别降低了16.85％和23.55％。专利文献CN110205257A(申请号201910561987.7)公开了一株低产高级醇的酿酒酵母及其在小曲米酒酿造中的应用。通过WL培养基分离与显微镜下观察，最终通过筛选得到一株具有降低异丁醇、异戊醇的菌株。可见，低产异丁醇、异戊醇的酵母深受酿酒界喜爱。
杂交优势是自然界的一种常见的生物现象，广泛存在于动物、植物、真菌界中，自然界中的杂交个体往往具有较亲本更加耐受的特性，如耐高渗透压、耐高温、耐高pH、耐高酒精等特性。本领域目前尚缺乏利用杂交育种的方式获得低产异丁醇、异戊醇的新菌株的有关研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用杂交育种的方式获得的低产高级醇和/或高产乙酸乙酯的新菌株酿酒酵母QL-001及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种酿酒酵母QL-001，所述酿酒酵母QL-001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29339。
本发明还提供了上述酿酒酵母QL-001在酿酒中的应用。
本发明还提供了上述酿酒酵母QL-001在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用。
优选的，所述酒包括葡萄酒。
优选的，所述高级醇包括异丁醇、异戊醇或活性戊醇。
本发明还提供了一种降低酒产品中高级醇含量和/或提高酒产品中乙酸乙酯含量的方法，包括如下步骤：将上述的酿酒酵母QL-001接种于发酵原料中进行发酵。
优选的，所述发酵原料包括葡萄。
优选的，所述发酵为先进行有氧发酵，再进行厌氧发酵。
优选的，所述有氧发酵的温度为25℃-28℃，时间为24h；所述厌氧发酵的温度为18℃-20℃，时间为6d。
本发明还提供了一种含有低含量高级醇和/或高含量乙酸乙酯的酒产品，所述酒产品是以上述酿酒酵母QL-001为发酵菌发酵而成。
本发明的有益效果：
本发明首次采用杂交育种的方式获得了一株能够低产高级醇和/或高产乙酸乙酯的酿酒酵母QL-001，采用本发明提供的菌株进行酒产品制备时，酒液中异丁醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低16.2％、12.64％；异戊醇含量分别降低19.86％、15.9％；活性戊醇含量分别降低27.76％、39.77％，乙酸乙酯含量分别提升15.8％、56.7％。本发明提供的酿酒酵母QL-001具有降低高级醇含量以及提升香气物质乙酸乙酯含量的优点，且性能稳定。
附图说明
图1为EC1118、QA23单倍体菌株验证结果；
图2为新品种QL-001三引物法验证结果；
图3为模拟葡萄汁不同组别物质含量对比结果；
图4为亲本菌株EC1118的发酵液GC-MS总离子流图结果；
图5为亲本菌株QA23的发酵液GC-MS总离子流图结果；
图6为新菌株QL-001的发酵液GC-MS总离子流图结果；
图7为葡萄汁不同组别高级醇含量对比结果；
图8为葡萄汁不同组别乙酸乙酯含量结果。
保藏说明
酿酒酵母QL-001的分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.29339，保藏日期为2023年12月18日。
具体实施方式
本发明提供了一种酿酒酵母QL-001，所述酿酒酵母QL-001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29339。
本发明所述酿酒酵母QL-001是由酵母菌EC1118和QA23进行杂交育种获得的，具体的，挑取酵母菌EC1118和QA23的单菌落于改良版MC产孢培养基中培养产孢，当产孢率达到85％便可挑取单菌落进行破壁处理，然后加入蜗牛酶培养，挑选小菌落进行三引物法验证，得到酵母菌EC1118、QA23单倍体菌株；将EC1118单倍体菌株与QA23单倍体菌株挑点混合于YPD液体培养基进行培养，然后取菌液涂布于YPD固体培养基培养，之后挑取单菌落于产孢培养基进行培养，显微镜下观察产孢情况，如产孢成功，则进行三引物法验证，最终得到新品种酿酒酵母QL-001。本发明通过对杂交育种过程中的产孢培养基进行改良，最终达到降低高级醇，增加香气物质的目的。
本发明还提供了上述酿酒酵母QL-001在酿酒中的应用。本发明还提供了上述酿酒酵母QL-001在生产低高级醇和/或高乙酸乙酯酒产品中的应用。
在本发明中，所述酒优选的包括葡萄酒，所述高级醇优选的包括异丁醇、异戊醇或活性戊醇。
本发明还提供了一种降低酒产品中高级醇含量和/或提高酒产品中乙酸乙酯含量的方法，包括如下步骤：将上述的酿酒酵母QL-001接种于发酵原料中进行发酵。
在本发明中，所述发酵原料优选的包括葡萄，更优选的包括葡萄汁。所述发酵优选的为先进行有氧发酵，再进行厌氧发酵，所述有氧发酵的温度优选为25℃-28℃，更优选为26℃-27℃，所述有氧发酵的时间优选为24h；所述厌氧发酵的温度优选为18℃-20℃，更优选为19℃，所述厌氧发酵的时间优选为6d。
本发明还提供了一种含有低含量高级醇和/或高含量乙酸乙酯的酒产品，所述酒产品是以上述酿酒酵母QL-001为发酵菌发酵而成。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
酿酒酵母的杂交育种
1、单倍体制备
(1)酵母活化
取10mL离心管并加入5mLYPD液体培养基(1％酵母浸粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，挑取原始菌株EC1118、QA23酵母干粉溶于离心管中，于30℃培养30min，将活化后的菌株平板划线于YPD固体培养基(1％酵母浸粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉)并于28℃培养48h，挑取菌落较大的单菌落。
(2)单倍体获取
将二倍体酵母接种于YPD液体培养基(同步骤(1))中进行培养，24h后涂布于YPD固体培养基(同步骤(1))并培养48h，挑取单菌落于改良版MC产孢培养基(葡萄糖0.1％、氯化钾2.2％、醋酸钠0.5％)，利用改良版MC产孢培养基诱导产孢，8d后在显微镜下观察产孢数目，计算产孢率。
当产孢率达到85％便挑取单菌落进行破壁处理，刮取适量已形成子囊的菌泥，悬浮于0.5mL生理盐水中，调节细胞浓度至OD＝0.5，取0.1mL于离心管中，加入3％的蜗牛酶0.5mL，置于摇床30℃，180rpm，培养12h。将培养后的菌液稀释后涂布于YPD固体培养基(同步骤(1))培养48h。
通过观察菌落大小初步确定菌落小的为单倍体，再通过三引物法验证：采用酵母基因组提取试剂盒提取菌落基因组，以引物：F：5’-ATGCACATCAAGTCAGTTATGG-3’(SEQ IDNO.1)、Ra：5’-GCACATAATATGGGACTACTTCG-3’(SEQ ID NO.2)和Rα：5’-ACTCCACTTCAAGTCAGGGTTTG-3’(SEQ ID NO.3)进行PCR扩增，PCR条件为：95℃3min，95℃15s，55℃30s，72℃15s，31个循环，72℃5min，4℃保存，PCR扩增体系：20μL，F 2μL，Rα2μL，Ra2μL，2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)10μL，ddH2O 4μL，结果如图1所示(图1中括号内的数字为筛选时的菌落编号，无实际意义)，得到EC1118(α、a型)、QA23(α型)单倍体菌株(单条带的为单倍体，544bp为a型，440bp为α型)。将单倍体菌株进行传代培养，将其第5代菌株在改良版MC产孢培养基上培养8天，镜检观察未产生孢子则为单倍体稳定菌株，进行-80℃菌种保藏。
2、杂交育种
本实验采用的是孢子杂交中的群体杂交，将上述获得的EC1118的a型单倍体菌株与QA23的α型单倍体菌株挑点混合于YPD液体培养基(同上述步骤(1))进行培养24h，取菌液涂布于YPD固体培养基(同上述步骤(1))培养2天，之后挑取单菌落于改良版MC产孢培养基进行8天培养，显微镜下观察产孢情况，如产孢成功，则进行三引物法验证(具体方法同上述步骤(2))，结果如图2所示，出现两条亮带(二倍体)，最终得到杂交新品种酿酒酵母QL-001。
3、模拟葡萄汁发酵
模拟葡萄汁发酵实验
将初步得到的新菌株酿酒酵母QL-001挑取单菌落进行扩大培养，挑取一环单菌落于50mLYPD液体培养基(同上述步骤(1))中进行培养24h，取2mL于-80℃保菌。取5个250mL锥形瓶，各加100mL模拟葡萄汁(10g/L酵母浸粉、220g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、300mg/L(磷酸氢二铵:精氨酸:谷氨酸:Nacl:维生素＝4:2:2:1:1，此处所说的比例为质量比))，四个为平行试验组，移液枪取100μL菌液于100mL模拟葡萄汁中25℃进行24h有氧发酵，20℃进行6d厌氧发酵。另外将原始菌株EC1118、QA23酵母作为对照组进行模拟葡萄汁进行发酵，具体方法同上，最终取8mL发酵液进行GC-MS顶空固相微萃取测定高级醇以及香气物质含量，测定方法：
在20mL的螺口瓶中加入1.5g NacL，取8mL发酵液于螺口瓶中，超声15min。加入内标10μL，再次超声10min，进行GC-MS顶空固相微萃取。
检测方法为：
GC条件：色谱柱为RTX-WAX毛细管色谱柱(30m×0.25μm×0.25mm)；载气为高纯氦气；不分流进样，进样口温度250℃；柱温采用程序升温：程序升温为40℃保持3min,以2℃/min升至130℃，以10℃/min升温至220℃，保持4min。
MS条件：色谱-质谱接口温度250℃，离子源温度230℃；电离模式：电子轰击源(EI)，轰击能量70eV，以4-甲基-2-戊醇为内标物。
最终去除误差样本求平均值作图，结果如表1和图3所示
表1挥发性物质含量(mg/L)
实施例2
葡萄汁的制备：选择品质优良的烟台蓬莱霞多丽葡萄(无坏果、成熟度好)进行除梗破碎。对葡萄醪进行压滤，除去葡萄汁中的葡萄籽、葡萄皮。测定葡萄汁的含糖量，并加白砂糖调节糖含量达到220g/L，调节pH＝3.5。
将亲本菌株EC1118和QA23与新菌株QL-001分别进行同步发酵。分别用移液枪取100μL菌液(OD＝0.8)于100mL葡萄汁中25℃进行24h有氧发酵，再以20℃进行6d厌氧发酵，取8mL发酵液进行GC-MS顶空固相微萃取，测定高级醇以及香气物质含量，具体检测方法同实施例1，最终去除误差样本求平均值作图，对比三者发酵终产物的高级醇及香气物质含量。结果如表2、表3和图4-图8所示。
表2高级醇含量(mg/L)
| 菌株 | 异丁醇(mg/L) | 异戊醇(mg/L) | 活性戊醇(mg/L) | 苯乙醇(mg/L) | 总含量(mg/L) |
| EC1118 | 16.66 | 125.06 | 49.56 | 96.68 | 288.08 |
| QA23 | 15.98 | 119.18 | 59.44 | 80.58 | 275.20 |
| QL-001 | 13.96 | 100.22 | 35.80 | 78.16 | 228.18 |
由表2和图4-图7可以看出，杂交菌株QL-001发酵后酒液中异丁醇含量较亲本菌株EC1118、QA23明显降低，分别降低16.21％、12.64％，异戊醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低19.86％、15.91％，活性戊醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低27.76％、39.77％。苯乙醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低19.16％、3％。总高级醇含量较亲本菌株EC1118、QA23分别降低20.80％、17.09％。
表3乙酸乙酯含量(mg/L)
由表3和图8可以看出，杂交菌株QL-001发酵液中乙酸乙酯含量较亲本EC1118、QA23分别提高15.9％、56.7％。
由以上结果可以看出，采用本发明新菌株QL-001进行葡萄汁的发酵，能够得到低高级醇含量、高乙酸乙酯含量的葡萄酒，即得到了低高级醇增香葡萄酒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.酿酒酵母QL-001在生产低高级醇和高乙酸乙酯酒产品中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母QL-001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29339；
所述酒包括葡萄酒；
所述高级醇包括异丁醇、异戊醇或活性戊醇。
2.一种降低酒产品中高级醇含量和/或提高酒产品中乙酸乙酯含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1中的酿酒酵母QL-001接种于发酵原料中进行发酵；
所述发酵原料包括葡萄。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵为先进行有氧发酵，再进行厌氧发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有氧发酵的温度为25℃-28℃，时间为24h；所述厌氧发酵的温度为18℃-20℃，时间为6d。
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