CN111909861A - 产己酸乙酯的葡萄牙棒孢酵母菌株及其培养方法与应用 - Google Patents

产己酸乙酯的葡萄牙棒孢酵母菌株及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物合成己酸乙酯的葡萄牙棒孢酵母菌株及其培养方法与应用，该菌株命名为Clavispora lusitaniae YX3308，已于2020年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

Description

产己酸乙酯的葡萄牙棒孢酵母菌株及其培养方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及新分离的产己酸乙酯的酵母菌株及其培养方法与应用。
技术背景
白酒是中国的国酒，中国白酒独特的发酵工艺以及开放的酿造环境，使得中国白酒风味成分的多样性和独特性高于其他五大蒸馏酒。白酒中的香气成分十分复杂，主要分为酯类、酸类、高级醇、醛类等，白酒中酯类和高级醇是评价白酒质量的重要指标。酯类是白酒风味化合物中种类最多的一类化合物，在白酒中已经发现的酯类超过400余种，含量占微量成分总量的75-95％，是白酒中含量较多的有机化合物。酯类物质能够散发出浓郁的果香，可以增强且丰富酒香的效果，在不同香型的白酒中，酯类物质是决定其特色的重要因素之一。己酸乙酯是浓香型白酒的主体香型，在感官上具有水果香的挥发性酯类，在浓香型白酒风味起着重要的作用。在国标中显示，一级浓香型白酒中己酸乙酯含量为0.6-2.5g/L，优级浓香型白酒中己酸乙酯含量为1.2-2.8g/L。以上均体现了己酸乙酯在白酒中的地位。
白酒中的己酸乙酯主要是体系中的己酸和乙醇经过酯化生成，在发酵过程中产生，大曲作为白酒发酵动力，为发酵提供了丰富的菌源，酵母菌是一类具有产己酸乙酯能力的微生物属，是传统发酵食品中酯类物质主要产生菌株。根据国内外研究，在酵母菌株中研究较少，且产量低。在采用生物技术产己酸乙酯的过程中，需要解决的关键问题是如何从源头上提高己酸乙酯的能力，也就是说，寻找高产己酸乙酯的酵母菌株是解决这一问题的关键。
随着白酒现代化分析研究发现，己酸乙酯是我国浓香型白酒中的特色风味物质，对于白酒的风味具有重要的影响。获得能高产己酸乙酯的酵母菌株，并将其强化应用到白酒酿造体系中，对于提高白酒己酸乙酯含量，提升白酒品质具有重要意义。
发明内容
针对酵母产己酸乙酯种类少、产量低等问题，以及提高传统酿造食品白酒中己酸乙酯含量，提升白酒品质的实际应用，本发明目的在于提供从白酒酒曲中新分离的高产己酸乙酯的菌株，命名为YX3308，并提供使用YX3308产己酸乙酯的培养方法与应用。
本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从酿酒酒曲中筛选获得，为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，该菌株已于申请日前保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 19730。
在一些实施方案中，上述所述菌株YX3308具有以下菌落特征和生化特征：
该菌株在固体培养基WL培养基上菌落呈乳白色，边缘规则，中间微微突起，湿润易挑起，细胞为椭圆形、芽殖；
该酵母菌株对葡萄糖的最高耐受为80％(w/v)、对氯化钠的最高耐受为15％；
该酵母菌株能够耐受0.06％己酸；能够耐受6％乙醇；能够耐受1200mg/L己酸乙酯，表明该菌株具有高产己酸乙酯的潜力；
该酵母菌株具有广泛的pH和温度适应性；
该酵母菌株在葡萄糖产酸、淀粉水解实验、脂肪酶水解实验、重氮蓝B实验、新生隐球菌实验、TTC实验、耐受1％乙酸实验、尿素水解实验均呈现阴性；
该酵母菌株在L-DOPA黑色素实验和熊果苷分解实验呈阳性；
该酵母菌株可耐受25ug/mL的放线菌铜。
葡萄牙棒孢酵母YX3308可以用于发酵过程中产己酸乙酯，在优化的培养条件下产量可达62.04mg/L。可以作为提高白酒中己酸乙酯含量的功能微生物菌株应用到白酒的生产中。
在一些实施方案中，该菌株能够利用以下作为碳源：葡萄糖、半乳糖、山梨糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉籽糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、甘油、D甘露醇、乙醇、核糖醇、DL-乳酸、D-葡萄糖胺或其组合。
在一些实施方案中，该菌株能够利用尸胺二盐酸盐、L-赖氨酸、硝酸钾或乙胺盐酸盐作为唯一氮源。
在一些实施方案中，该菌株能够耐受1200mg/L己酸乙酯浓度。
在一些实施方案中，上述葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株的26S rDNA D1/D2序列与其他多株葡萄牙棒孢酵母的26S rDNA D1/D2序列有99％的相似性。
在另一方面，本发明涉及上述葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株在合成己酸乙酯的应用。
在另一方面，本发明涉及上述葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株在白酒酿造中的应用。
在一些实施方案中，上述应用包括以下步骤：
(1)将葡萄牙棒孢酵母YX3308接入液体种子培养基中并进行种子活化培养以获得种子活化液；
(2)将(1)获得的种子活化液接种于高粱浸出培养基并进行扩大培养；和
(3)添加乙醇和己酸并进行诱导培养，从而获得发酵液。
在上述应用的一些实施方案中，所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，自然pH，蒸馏水定容。
在一些实施方案中，所述步骤(1)包括：从斜面上挑取1环葡萄牙棒孢酵母YX3308接入液体种子培养基中；在28℃、180rpm/min条件下活化24h，获得种子活化液。
在上述应用的一些实施方案中，所述步骤(2)中的高粱浸出培养基通过以下方法制备：称取250g高粱粉碎，将粉末与蒸馏水1:4混合，待煮沸后，保持90℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液，分装于三角瓶中，灭菌备用。
在一些实施方案中，将步骤(1)获得的种子活化液接种于高粱浸出培养基具有选自下组的一个或多个特征：
a.种子活化液接种时间为种子活化培养开始后12-48h，例如12h、18h、24h、30h、36h、42h或48h，优选30h；和
b.种子活化液的接种量为约5-10％，例如5.0％、7.5％或10％，优选7.5％。
在一些实施方案中，种子活化液接种时间为种子活化培养开始后30h，且接种量为7.5％。
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括：在28℃和180rpm的培养条件下进行扩大培养。
在一些实施方案中，所述高粱浸出培养基具有选自下组的一个或多个特征：
a.pH为6-8，例如pH为6、7或8，优选6；和
b.糖度为8-12Brix，例如糖度为8、10或12Brix，优选10Brix。
在一些实施方案中，所述高粱浸出培养基的pH为6，且糖度为10Brix。
在上述应用的一些实施方案中，所述高粱浸出培养基通过以下方法制备：称取250g高粱粉碎，将粉末与蒸馏水1:4混合，待煮沸后，保持90℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液。将浸出液的糖度调节至10Brix，pH＝6。分装于三角瓶中，灭菌备用。
在上述应用的一些实施方案中，其中步骤(3)中的培养条件具有选自下组的一个或多个特征：
a.在静置条件下进行培养；和
b.培养温度为20-28℃，例如20℃、22℃、25℃或28℃，优选20℃。
在一些实施方案中，在步骤(3)中在静置条件下进行培养，且培养温度为20℃。
在上述应用的一些实施方案中，其中在步骤(3)中添加乙醇和己酸具有选自下组的一个或多个特征：
a.乙醇添加量为6-16％，例如6％、8％、10％、12％、14％或16％，优选10％；
b.乙醇添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后24-40h，例如步骤(2)中的扩大培养开始后24h、32h或40h，优选32h；
c.己酸添加量为0.02-0.04％，例如0.02％或0.04％，优选0.04％；和
d.己酸添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后32-48h，例如32h、40h或48h，优选40h。
在一些实施方案中，在步骤(3)中乙醇添加量为10％，且添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后32h。
在一些实施方案中，在步骤(3)中己酸添加量为0.04％，且添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后40h。
在上述应用的一些实施方案中，步骤(2)和步骤(3)的总培养时间为56-88h，例如56h、64h、72h、80h或88h，优选72h。
本发明的有益效果：
(1)本发明筛选出的菌株葡萄牙棒孢酵母YX3308来源于白酒酿造过程中，具有高产己酸乙酯的特点。经检测，该菌株己酸乙酯产量可达62.04mg/L。
(2)本发明通过对葡萄牙棒孢酵母YX3308发酵特性的研究，优化了培养基成分及培养条件，提高了该菌株产己酸乙酯的产量。
(3)本发明筛选出的葡萄牙棒孢酵母YX3308己酸乙酯耐受性高，具有高产己酸乙酯的能力，有利于在白酒酿造中的应用。
附图说明
图1是葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株在WL培养基上的菌落形态照片。
图2是葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株的细胞形态照片。
图3是葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株的系统进化发育树。
图4是使用己酸乙酯标准品制作的标准曲线。
图5是测试不同pH对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图6测试是不同转速对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图7是测试不同温度对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图8是测试不同乙醇添加量对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果；
图9是测试不同己酸添加量对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图10是测试不同种子液接种时机对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图11是测试不同糖度对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图12是测试不同乙醇添加时机对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图13是测试不同接种量对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图14是测试不同己酸添加时机对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
图15是不同培养时间对葡萄牙棒孢酵母YX3308合成己酸乙酯的影响的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例所用培养基如下：
YPD培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容。
WL培养基：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，葡萄糖50g/L，琼脂20g/L，磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425g/L，氯化钙0.125g/L，氯化铁0.0025g/L，硫酸镁0.125g/L，硫酸锰0.0025g/L，溴甲酚绿0.022g/L，pH值为6.5，蒸馏水定容。
高粱浸出培养基：称取250g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至8Brix，分装于三角瓶中，灭菌备用。
实施例中所述葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株，已经于2020年4月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC19730。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例中所述己酸乙酯标准品购自美国Sigma公司。
实施例1葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308的分离
将粉碎的大曲混合均匀，将1g大曲粉用9g无菌水充分震荡混匀，制成菌悬液。在无菌环境下，将菌悬液梯度稀释至10-3、10-4、10-5和10-6。取各梯度0.1mL涂布于YPD平板上，每个梯度做三个平行。培养温度30℃，培养48h，并观察生长情况。挑选平板上具有明显酵母形态的菌落，乳白色、圆形、表面突起、不透明的单菌落，划线于YPD平板上。将得到的纯菌株保存于甘油管中备用。
将从大曲中分离得到的酵母活化24h，按1％接种量接入高粱浸出培养基中，28℃、180rpm/min扩大培养24h，添加乙醇2％(v/v)，己酸0.04％(v/v)，在28℃、180rpm/min诱导培养36h。培养结束后，通过GC-MS气质联用仪测定己酸乙酯含量，筛选出高产己酸乙酯的酵母。最终获得一株转化能力好、能积累高浓度己酸乙酯的菌株，命名为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308。
实施例2葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308的保存
上述所获得的葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株通过以下方法进行保存：
(1)斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72h后，在4℃冰箱中保存。
(2)甘油管保存：取6mL 20％甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20％甘油混合，将混合液分装于1.5mL无菌PE管中，于-80℃下保存。
实施例3葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308的鉴定
上述所涉及的葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308的鉴定包括以下步骤：
步骤1：形态学特征
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：
(1)WL培养基形态观察：将待测酵母经YPD培养基活化，培养24h后接种于WL培养基，30℃静置培养5天，进行观察。
(2)酵母菌细胞观察：挑取待测酵母单菌落的少量菌体，轻柔、均匀涂布在载玻片中的无菌水液滴中，固定后，采用美蓝染色液进行染色，制作临时装片，于10×100油镜下观察。
结果如图1和图2所示，菌落突起，呈乳白色，表面湿润光滑；显微镜下细胞形态特征，细胞为卵圆形，一端出芽，无菌丝体。根据菌株的菌落形态和细胞形态初步鉴定菌株YX3308为酵母菌。
步骤2：生理生化鉴定
菌株生理生化鉴定参考《中国担子菌酵母的分类与分子系统学研究》，包括糖发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验、无维生素和维生素需求生长实验、熊果苷分解实验、葡萄糖产酸实验、淀粉水解实验、尿素水解实验、脂肪酶活性实验、环己酰亚胺抗性实验、明胶液化实验、重氮蓝B颜色反应实验、新生隐球菌鉴定、黑色素合成实验及TTC实验。
见表1，酵母YX3308可以利用葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、纤维二糖产酸产气，生长状态良好。该酵母不能利用乳糖、可溶性淀粉、蜜二糖和D-木糖产酸产气，并且不能利用可溶性淀粉、蜜二糖和D-木糖生长。
表1酵母YX3308糖发酵实验结果
Figure BDA0002662302020000091
碳源同化实验结果见表2，酵母YX3308利用葡萄糖、半乳糖、山梨糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉籽糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、甘油、D甘露醇、乙醇、核糖醇、DL-乳酸、D-葡萄糖胺作为碳源时生长良好。利用乳糖、菊糖、L-阿拉伯糖、柠檬酸、琥珀酸、D-葡糖醛酸、杨梅苷作为碳源时生长缓慢。不能利用蜜二糖、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、赤藓糖醇、半乳糖醇、肌醇、甲醇、a-甲基-葡萄糖苷、十六烷作为碳源生长。
表2酵母YX3308碳源同化实验结果
Figure BDA0002662302020000111
氮源同化实验结果见表3，酵母YX3308能够利用尸胺二盐酸盐、L-赖氨酸作为唯一氮源生长良好，利用硝酸钾、乙胺盐酸盐为唯一氮源生长较好，不利用亚硝酸钠。
表3酵母YX3308氮源同化实验结果
Figure BDA0002662302020000121
维生素需求情况见表4，酵母YX3308可以利用所选维生素生长，并且利用硫胺素(VB1)和烟酸(VB3)生长良好。
表4无维生素培养基和维生素需求生长
Figure BDA0002662302020000122
其他生理生化实验结果见表5，酵母YX3308在其他生理生化实验，包括葡萄糖产酸、淀粉水解实验、脂肪酶水解实验、重氮蓝B实验、新生隐球菌实验、TTC实验、耐受1％乙酸实验、尿素水解实验均呈现阴性。在L-DOPA黑色素实验和熊果苷分解实验呈阳性。最高可耐受25ug/mL的放线菌酮，耐受60％(w/w)的葡萄糖浓度和14％NaCl浓度。
表5其他生理生化实验结果
Figure BDA0002662302020000131
步骤3：分子生物学鉴定
为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：
(1)菌体培养
将活化后的菌株接种于YPD中，在28℃的条件下以160rpm/min的转速培养48h。
(2)基因组DNA的提取及PCR扩增
按照真菌DNA试剂盒方法提取酵母基因组DNA，并进行PCR扩增。PCR反应体系：LAPCR Buffer 2.5μL、引物各1μL、dNTP 2μL、LAtaq酶0.2μL、DNA 2μL，用ddH2O定容至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30次循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验。
(3)序列测定及系统发育树的构建
将PCR扩增产物送公司进行纯化和测序，从而获得菌株PCR扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，进行校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLAST search)，比较供试菌株与已知酵母菌相应序列的相似程度。
根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树。所构建的系统发育树如图3所示，该菌株鉴定为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。
该菌株已于2020年4月26日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC 19730。
实施例4葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株的生长特性
本发明所涉及葡萄牙棒孢酵母生长特性，其特征在于，步骤如下：
(1)温度耐受性
将活化后的菌种接入装有50mL YPD培养基的250mL锥形瓶中，分别于20、25、30、35、40、45、50℃，180rpm/min的摇床中培养24h，每个梯度三个平行，在560nm波长下测定吸光度，判断其温度耐受性。
(2)酸碱耐受性
将活化后的菌分别接入pH为1-12的YPD培养基中，每个梯度三个平行，在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其pH耐受性。
(3)葡萄糖耐受性
将活化后的菌分别接入葡萄糖添加量为10-90％(w/v)的YPD培养基中，每隔10％为一个梯度，每个梯度三个平行。在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其葡萄糖耐受性。
(4)NaCl耐受性
将活化后的菌分别接入NaCl含量为0、5、10、15、20、25、30％(w/v)的装有50mL YPD培养基的250mL锥形瓶中。每个梯度三个平行。将其在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其NaCl耐受性。
(5)己酸耐受性
将活化的菌接入己酸添加量为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12％(v/v)的装有50mL YPD培养基的250mL锥形瓶中，每个梯度三个平行。将其在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其己酸耐受性。
(6)乙醇耐受性
将活化的菌接入乙醇含量为0-20％(v/v)的YPD培养基中，每隔2％为一个梯度，每个梯度三个平行。在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其乙醇耐受性。
(7)己酸乙酯耐受性
将活化的菌接入己酸乙酯含量为0、300、600、900、1200、1500、1800mg/L的YPD培养基中，每个梯度三个平行。在28℃，180rpm/min的摇床中培养24h，在560nm波长下测定吸光度，判断其己酸乙酯耐受性。
本发明所涉及的该菌株耐受性结果如下表6所示。菌株能够耐受的最高温度为50℃，属于高温型酵母；该菌株能够耐受的最低pH为2，最高为11，生长pH范围较广；该酵母菌株对葡萄糖的最高耐受为80％(w/v)；最高耐受15％氯化钠；最高耐受0.06％己酸；菌株能够耐受的乙醇浓度为6％；菌株能够耐受1200mg/L己酸乙酯浓度，说明该菌株具有高产己酸乙酯的潜力。
本发明涉及的酵母菌株能在pH 2-11下正常生长，如表6所示；最适生长温度为20-40℃。
表6酵母YX3308耐受性实验结果
Figure BDA0002662302020000161
实施例5葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株合成己酸乙酯
本发明涉及葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株合成己酸乙酯的步骤如下：
(1)从斜面上挑取1环葡萄牙棒孢酵母YX3308接入液体种子培养基中，在28℃、180rpm/min条件下，活化24h，获得种子活化液；
(2)将(1)获得的种子活化液以0.33％(v/v)的接种量接种于高粱浸出培养基，在28℃、180rpm/min条件下培养24h，完成扩大培养，加入2％乙醇和0.04％己酸，28℃、180rpm/min培养36h(诱导培养)即得发酵液，待测其己酸乙酯含量。
所述步骤(1)中的液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，自然pH，蒸馏水定容。
所述步骤(2)中高粱浸出培养基组分如下：称取250g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90℃条件下加入耐高温α-淀粉酶液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至8Brix，分装于三角瓶中，灭菌备用。
产物和产物浓度的确定：
采用GC-MS检测己酸乙酯含量，其参数为：
色谱条件：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：在50℃的初始温度下，保持2min；将温度以10℃/min的速率提高到180℃，保持2min；再以6℃/min的速度将温度提高到230℃，保持2min；恒流流速1.0mL/min；分流比为37:1；进样量为1μL，进样口温度为250℃；载气为He。
质谱条件：EI源；电子能量70eV；离子源250℃；四级杆温度150℃；传输管线温度：230℃；溶剂延迟1min。
(1)己酸乙酯标准曲线的绘制
准确称取0.0869g己酸乙酯纯品，用正庚烷定容至100ml，再分别将其稀释至50、100、200、400、800倍，制成标品。经气质联用仪检测其峰面积，以己酸乙酯含量为X轴，峰面积为Y轴，制成己酸乙酯标准曲线。
将上述不同浓度梯度的己酸乙酯标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。每次浓度重复测定3次，求均值，绘制己酸乙酯的标准曲线，如图4所示，根据该曲线获得的方程式为y＝1E+08X-2E+08(R2＝0.9931)。
(2)样品的制备
将发酵液离心，取上清液与正庚烷等体积混合，萃取。取有机相于1.5mL离心管中，放入适量无水硫酸钠，置于-20℃冰箱中，直至无冰晶出现。用有机滤膜过滤样品，用气质联用仪检测己酸乙酯含量，记录峰面积。
实施例6 pH的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308，不同之处在于，将高粱浸出培养基的pH分别调节为4、5、6、7、8、9，28℃、180rpm/min培养24h，完成扩大培养。后加入2％乙醇和0.04％己酸，28℃、静置状态下培养36h，完成诱导培养。如图5所示，当pH为6时，己酸乙酯产量最高达3.37mg/L。
实施例7转速的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308，28℃、180rpm/min培养24h，完成扩大培养，后加入2％乙醇和0.04％己酸，培养36h，完成诱导培养，不同之处在于完成扩大培养后，诱导培养的转速选取0(静置)、30、60、90、120rpm/min。结果图6所示，当诱导培养处于静置状态时，合成己酸乙酯浓度最高达5.40mg/L。
实施例8培养温度的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308，在实施例7的优化基础上(诱导培养处于静置状态)，28℃、180rpm/min培养24h，完成扩大培养，不同之处在于，诱导培养的培养温度选择18、20、22、24、26、28℃，加入2％乙醇和0.04％己酸，培养36h。如图7所示，当温度为20℃时，己酸乙酯的含量高达6.75mg/L。
实施例9乙醇添加量的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308，在实施例8的优化基础上(诱导培养在静置、20℃下进行)，28℃、180rpm/min培养24h，完成扩大培养，不同之处在于，诱导培养添加的乙醇浓度选择0、2、4、6、8、10、12、14、16％，以及0.04％己酸，培养36h。如图8所示，当乙醇添加量为10％时，己酸乙酯的含量高达7.84mg/L。
实施例10己酸添加量的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308，在实施例9的优化基础上(诱导培养在静置、20℃下进行；乙醇添加量为10％)，28℃、180rpm/min培养24h，完成扩大培养，不同之处在于，诱导培养添加的己酸浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1％，以及10％乙醇，培养36h。如图9所示，当己酸添加量为0.04％时，己酸乙酯的含量高达9.79mg/L。
实施例11种子液添加时机的优化
采用实施例5的方法培养酵母YX3308时，选择酵母在YPD培养基中的活化时间分别为：0、6、12、18、24、30、36、42、48、54h，在实施例10的优化基础上(诱导培养在静置、20℃下进行；乙醇添加量为10％且己酸添加量为0.04％)，其他条件不变。如图10所示，在种子液培养30h接入高粱浸出培养基，经培养己酸乙酯产量最高达12.06mg/L。
实施例12糖度的优化
将高粱浸出培养基糖度调至2、4、6、8、10、12、14Brix，在实施例11的优化基础上(种子液培养30h接入高粱浸出培养基)培养酵母YX3308。结果如图11所示，当糖度为10Brix时，己酸乙酯产量最高达17.29mg/L。
实施例13乙醇添加时机的优化
在实施例12的优化基础上(高粱浸出培养基糖度调至10Brix)培养酵母YX3308。在扩大培养开始后，乙醇的添加时机分别选择为0、8、16、24、32、40、48、56h，并进行诱导培养，共培养80h。培养后测定己酸乙酯含量。结果如图12所示，当乙醇添加时机为32h时，己酸乙酯含量最高达37.18mg/L。
实施例14接种量的优化
在实施例13的优化基础上(乙醇添加时机为32h)培养酵母YX3308，不同之处在于，酵母菌株活化后以不同的接种量0.1、0.33、0.5、1、2、5、7.5、10％的比例接种于高粱浸出培养基中，经过培养测定己酸乙酯。结果如图13所示，当接种量为7.5％时，己酸乙酯含量最高达42.66mg/L。
实施例15己酸添加时机的优化
在实施例14的优化基础上(酵母菌株接种量为7.5％)培养酵母YX3308。在扩大培养开始后，己酸的添加时机分别选择为0、8、16、24、32、40、48、56h，并进行诱导培养，共培养80h。培养后测定己酸乙酯含量。结果如图14所示，当己酸添加时机为40h时，己酸乙酯含量最高达46.30mg/L。
实施例16培养时间的优化
在实施例15的优化基础上(乙醇添加时机为32h，己酸添加时机为40h)培养酵母YX3308，共培养96h，每隔8h取样。结果如图15所示，当培养时间为72h时，己酸乙酯含量最高达62.04mg/L。
上述实施例6-16，按照实施例5中样品制备处理样品，采用GC-MS测定其己酸乙酯的含量。

Claims (13)

1.一株葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)YX3308菌株，其保藏编号为CGMCC19730。
2.如权利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株，该菌株能够利用以下作为碳源：葡萄糖、半乳糖、山梨糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉籽糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、甘油、D甘露醇、乙醇、核糖醇、DL-乳酸、D-葡萄糖胺或其组合。
3.如权利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株，该菌株能够利用尸胺二盐酸盐、L-赖氨酸、硝酸钾或乙胺盐酸盐作为唯一氮源。
4.如权利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株，该菌株能够耐受1200mg/L己酸乙酯浓度。
5.如权利要求1-4中任一项所述的葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株在合成己酸乙酯中的应用。
6.如权利要求1-4中任一项所述的葡萄牙棒孢酵母YX3308菌株在白酒酿造中的应用。
7.如权利要求5或6所述的应用，其包括以下步骤：
(1)将葡萄牙棒孢酵母YX3308接入液体种子培养基中并进行种子活化培养以获得种子活化液；
(2)将(1)获得的种子活化液接种于高粱浸出培养基并进行扩大培养；和
(3)添加乙醇和己酸并进行诱导培养，从而获得发酵液。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述步骤(1)中液体种子培养基组分如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，自然pH，蒸馏水定容。
9.如权利要求7或8所述的应用，其中将步骤(1)获得的种子活化液接种于高粱浸出培养基具有选自下组的一个或多个特征：
a.种子活化液接种时间为种子活化培养开始后12-48h，优选30h；和
b.种子活化液的接种量为5-10％，优选7.5％。
10.如权利要求7-9中任一项所述的应用，其中所述高粱浸出培养基具有选自下组的一个或多个特征：
a.pH为6-8，优选6；和
b.糖度为8-12Brix，优选10Brix。
11.如权利要求7-10中任一项所述的应用，其中步骤(3)中的培养条件具有选自下组的一个或多个特征：
a.在静置条件下进行培养；和
b.培养温度为20-28℃，优选20℃。
12.如权利要求7-11中任一项所述的应用，其中在步骤(3)中添加乙醇和己酸具有选自下组的一个或多个特征：
a.乙醇添加量为6-16％，优选10％；
b.乙醇添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后24-40h，优选32h；
c.己酸添加量为0.02-0.04％，优选0.04％；和
d.己酸添加时间为步骤(2)中的扩大培养开始后32-48h，优选40h。
13.如权利要求7-12中任一项所述的应用，其中步骤(2)和步骤(3)的总培养时间为56-88h，优选72h。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019849A (zh) * 2019-12-30 2020-04-17 贵州大学 一种葡萄牙棒孢酵母及其用途
CN116162557A (zh) * 2023-02-03 2023-05-26 大连三仪动物药品有限公司 一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019849A (zh) * 2019-12-30 2020-04-17 贵州大学 一种葡萄牙棒孢酵母及其用途
CN111363686A (zh) * 2020-03-05 2020-07-03 湖南农业大学 一种酿制增香葡萄酒的酵母菌及用途和方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019849A (zh) * 2019-12-30 2020-04-17 贵州大学 一种葡萄牙棒孢酵母及其用途
CN111363686A (zh) * 2020-03-05 2020-07-03 湖南农业大学 一种酿制增香葡萄酒的酵母菌及用途和方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PENG WANG 等: "Bacillus licheniformis affects the microbial community and metabolic profile in the spontaneous fermentation of Daqu starter for Chinese liquor making", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY》 *
WEIWEI LI 等: "Effects of fortification of Daqu with various yeasts on microbial community structure and flavor metabolism", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
付俊淑 等: "酵母分离株分子鉴定及其挥发性香气成分检测分析", 《食品与发酵工业》 *
崔小亮 等: "多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性分析与优质功能菌筛选", 《中国酿造》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019849A (zh) * 2019-12-30 2020-04-17 贵州大学 一种葡萄牙棒孢酵母及其用途
CN111019849B (zh) * 2019-12-30 2022-04-05 贵州大学 一种葡萄牙棒孢酵母及其用途
CN116162557A (zh) * 2023-02-03 2023-05-26 大连三仪动物药品有限公司 一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法
CN116162557B (zh) * 2023-02-03 2023-09-01 大连三仪动物药品有限公司 一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法

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