CN112175847B

CN112175847B - 丛梗孢属酵母新菌株及其用途

Info

Publication number: CN112175847B
Application number: CN202011257667.1A
Authority: CN
Inventors: 郑佳; 雷学俊; 张霞; 赵东; 乔宗伟; 刘多涛; 杨康卓
Original assignee: Wuliangye Yibin Co Ltd
Current assignee: Wuliangye Yibin Co Ltd
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-11-11
Also published as: CN112175847A

Abstract

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种丛梗孢属酵母新菌株及其用途。为进一步提升白酒风味，开发新的酿酒酵母菌种，本发明提供了一种丛梗孢属酵母新菌株，保藏编号为CGMCC No.20235。本发明的丛梗孢属酵母新菌株在多粮浓香型白酒酿造环境中分离，最适生长温度28℃；耐受NaCl浓度为10％g/v；耐受酒精度为10％v/v；耐受pH范围广，pH值3.0到7.7范围内均能正常生长。利用麦芽汁和五粮粉液态静置发酵，不产乙醇，可产生4‑乙烯基愈创木酚等多种风味物质。具有广阔的应用前景和极大的应用价值。

Description

丛梗孢属酵母新菌株及其用途

技术领域

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种丛梗孢属酵母新菌株及其用途。

背景技术

白酒酿造是一种涉及多菌种、开放式、固态发酵过程。遍布于空气、工具及摊晾场地等环境中的其他微生物常常在糟醅摊晾、加曲等环节沉降富集在入窖糟醅中，影响白酒发酵过程中微生物种群结构，最终影响白酒产品的品质，由此可见环境微生物在白酒酿造中发挥非常重要的作用。本发明的丛梗孢属酵母是采用传统可培养方法从四川五粮液股份有限公司酿造环境中筛选分离，属于环境微生物中的一种微生物。

丛梗孢属(Moniliella sp.)在分类学上属于真核生物原界、真菌界、担子菌门、黑粉菌亚门、Moniliellomycetes纲、丛梗孢目、丛梗孢科的一属真菌。细胞圆形、卵形或柱形，直径3-8μm，无性繁殖以多边芽殖方式，形成假菌丝或真菌丝，可生厚垣孢子。不产子囊孢子、节孢子或掷孢子，不产色素。目前，分离得到丛梗孢属酵母主要有M.acetoabutens、M.carnis、M.dehoogii、M.fonsecae、M.megachiliensis、M.mellis、M.nigrescens、M.oedocephalis、M.pollinis、M.spathulata、M.suaveolens、M.macrospora、M.byzovii、M.sojae、M.casei、M.pyrgileucina和M.floricola等，主要来源于肉类加工环境、花和酱油等。这类酵母主要用于食品工业商业化生产赤藓糖醇和发酵生成葵内酯、脲酶等物质，还未发现丛梗孢酵母属微生物在白酒酿造中有相关的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：为进一步提升白酒风味，开发新的酿酒酵母菌种。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种丛梗孢属酵母新菌株。本发明的丛梗孢属酵母新菌株，保藏编号为CGMCC No.20235。保藏时间为2020年8月10日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的26S rRNA D1/D2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1丛梗孢属酵母新菌株的26S rRNA D1/D2的核苷酸序列

ccgctgaaagccattaagcccgcatcctctaccaggagcggtcctcggtcaccggcagggcatccacagcgcggctataacactccccccgcaaagagagagccaccttccgcactgccttctcccccaccccgtaaccgatgcgggccccactgcctccaaagaaacagctgcggcactgactgccagcgcttccctcttggcaatttcacgtactgtttaactctctttccaaagtgcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctccccggtatttagccttggatggcgtttaccacccactttgcgctgcattcccaaacaacgcgactcgtcgagcgcaccccacaacacggcgcacagccagaccaagcacgggattctcaccctctctgatgctgctttccagcagacttggcgtccagccgcaccgctcgaggcacgtctccagcttacaatgcgccctggcgggagctttcaaatctgggctcatcccgcttcgctcgccgctactaggggaatccatgtttgtttcttttc。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的形态学特征为：菌体为长梗，芽殖，芽体为长椭圆形；菌落呈白色，表面平坦，质地纤毛状，边缘整齐不扩散。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的生理生化特征为：能发酵葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰氨基-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、木糖醇、甘油和山梨醇；不可利用2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖、松叁糖、侧金盏花醇、肌醇。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的适宜生长的pH条件为3.0-7.7。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的适宜生长温度为28℃-30℃。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的耐受NaCl浓度为10％g/v。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株的耐受酒精度为10％v/v。

其中，上述丛梗孢属酵母新菌株所产风味物质如表2所示。

本发明还提供了一种上述丛梗孢属酵母新菌株在白酒酿造中的用途。

本发明的有益效果为：

本发明从浓香型白酒酿造环境中分离得到了一种丛梗孢属酵母新菌株，其最适生长温度为28℃；耐受最低pH值为2.2；耐受NaCl浓度为10％g/v；耐受酒精度为10％v/v；发酵条件下可产生多种风味物质，满足多粮浓香型白酒酿造的需求，为白酒酿造中提升白酒风味提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景和极大的应用价值。

本发明的丛梗孢属酵母新菌株，保藏编号为CGMCC No.20235。保藏时间为2020年8月10日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为Moniliellasp.,编号为WLY-L-Y-1-25。

附图说明

图1为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株基于26S rRNA D1/D2序列的Neighbor-Joining法构建的系统发育树；

图2为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株显微形态图；

图3为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株菌落形态图；

图4为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株不同温度生长情况；

图5为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株不同pH值生长情况；

图6为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株不同乙醇浓度生长情况；

图7为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株不同NaCl浓度生长情况；

图8为本发明丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株在麦芽汁和五粮粉液态静置模拟浓香型白酒窖池发酵中产生风味物质情况。

具体实施方式

本发明提供了一种丛梗孢属酵母新菌株，保藏编号为CGMCC No.20235。保藏时间为2020年8月10日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的丛梗孢属酵母新菌株是从四川五粮液股份有限公司酿造环境中筛选分离的，生物学特征为：菌体为长梗，芽殖，芽体为长椭圆形；菌落呈白色，表面平坦，质地纤毛状，边缘整齐不扩散。

本发明所述的酵母能发酵葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰氨基-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖等六种糖，木糖醇、甘油和山梨醇等三种醇；不可利用2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖、松叁糖、侧金盏花醇、肌醇。

上述丛梗孢属酵母新菌株采用麦芽汁和五粮粉液态静置发酵模拟窖池发酵，不产乙醇，可产生4-乙烯基愈创木酚等多种风味物质，满足多粮浓香型白酒酿造的需求，提高了白酒酿造中的风舞物质成分和含量，为提升白酒风味提供了基础。

因此，本发明还提供了一种上述丛梗孢属酵母新菌株在白酒酿造中的用途。

下面将结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1菌株筛选

1、菌株的初筛

材料：四川五粮液股份有限公司酿造环境

培养基：

麦芽汁琼脂培养基：商业合成培养基，购买于广东环凯微生物科技有限公司，产品型号为021110。

麦芽汁(YPD)液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，蒸馏水配制，pH自然，115℃高压灭菌20min。

试验方法：

选取四川五粮液股份有限公司酿造环境，采用浙江苏净净化设备有限公司FKC-1型浮游菌采样器，距离地面80cm，将直径为9cm的麦芽汁琼脂平板置于采样器内，每次采用设置三个平行，空气流量为100L/min，采样时间为1min。然后将平板倒置于28℃培养箱中培养3-4d；待菌落长出后，挑选菌落形态不同的疑似酵母单菌落于麦芽汁琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态。挑取单菌落制成水浸片，于显微镜下观察菌体细胞形态，环境酵母分离纯化完成，斜面试管保存于4℃冰箱。

实施例2本发明丛梗孢属酵母新菌株的形态特征及生物学特性鉴定

下述各试验中均要用到新活化的菌体，挑取少量菌体接种于麦芽汁琼脂培养基中，28℃培养1-2d。

菌落及菌体形态观察：

将经活化的丛梗孢属酵母新菌株用接种环划线接种于麦芽汁琼脂平板培养基上，28℃培养1-2d，观察菌落形态；用接种针挑取少量菌体，利用显微镜观察菌体形态。

菌体观察结果：菌体为长梗，芽殖，芽体为长椭圆形。如图1所示。

菌落观察结果：白色，表面平坦，质地纤毛状，边缘整齐不扩散。如图2所示。

实施例3菌株的鉴定

1、梅里埃生理生化鉴定试剂盒鉴定

API 20C AUX实验条(购买于梅里埃诊断产品(上海)有限公司)是由19个同化测定的干粉底物的20个小杯所组成。小杯内含半固体微量培养基供接种，只有能以该底物为碳源的酵母菌才能生长。测定结果是以与对照生长物的比较而得；鉴定结果参照分析图谱索引或鉴定软件。

测试步骤：

①准备试条和接种物

②试条接种

将上述混合悬液注入试条每个试孔中，将吸管的顶部靠在杯内缘加液体，以避免形成气泡。小心注入，表面呈平或稍凸。盖上培养盒，于28℃培养48-72h。

③判读试条

28℃培养48或72h后，每个杯内生长反应情况与0杯(阴性对照)比较，比阴性对照更浑浊者，记为阳性。该菌株的碳源同化试验结果如表1所示。

表1本发明新菌株的生理生化试验结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

2、分子鉴定：提取菌株基因组DNA，用酵母26S rRNA D1/D2通用引物对正向引物NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG(SEQ ID NO:2)，反向引物NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG(SEQID NO:3)扩增基因组DNA，反应条件为：94℃预变性5min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI数据库上进行BLAST序列比对，与Moniliella spathulata模式菌株的碱基序列差异为6％，均远大于酵母菌种间在此区域的序列差异(-1％)，确定为丛梗孢属中的一个新菌株，并分类命名为Moniliella sp.，编号为WLY-L-Y-1-25。将所述菌株于2020年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20235，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明丛梗孢属酵母新菌株的细胞学特征为：菌体为长梗，芽殖，芽体为长椭圆形；菌落呈白色，表面平坦，质地纤毛状，边缘整齐不扩散。生理生化特征为：能发酵葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰氨基-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖等六种糖，木糖醇、甘油和山梨醇等三种醇；不可利用2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖、松叁糖、侧金盏花醇、肌醇。

实施例4本发明菌株WLY-L-Y-1-25最适生长条件筛选

(1)最适温度：将目标菌株WLY-L-Y-1-25行活化确认无污染后，按1％接种量接种于YPD液体培养基中，于25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25最适温度生长显示：在温度高于35℃时，生长状态不佳。菌株WLY-L-Y-1-25温度最终显示：目标菌株WLY-L-Y-1-25最适生长温度为28℃能良好生长。由此可知，此丛梗孢属酵母新菌株最适生长温度为28℃，如图4所示。

(2)最适pH范围：分别设置初始pH值(采用乳酸和0.1moL/L氢氧化钠调节)为2、4、6、8、10，将目标菌株WLY-L-Y-1-25以1％接种量接种于12°Bx的YPD液体培养基中，28℃培养48h，用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25能良好生长pH范围初筛显示：pH值低于2和高于10时，酵母生长受到抑制。复筛：方法同上，设置初始pH值(采用乳酸和0.1moL/L氢氧化钠调节)为2.2、3.0、4.0、5.6、6.9、7.7、8.7，28℃培养培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25能良好生长pH范围复筛显示：目标菌株WLY-L-Y-1-25在pH低于3.0或高于7.7时，酵母生长受到抑制。由此可知，此丛梗孢属酵母新菌株耐受pH范围广，pH值3.0到7.7范围内均能正常生长。如图5所示。

(3)乙醇耐受性：分别设置初始乙醇含量(％v/v)为0、5、10、15、20、25，将目标菌株WLY-L-Y-1-25以1％接种量接种于12°Bx的YPD液体培养基中，28℃培养48h，用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25乙醇耐受性初筛显示：15％v/v时，酵母生长受到抑制，10％v/v时，生长状态良好。复筛乙醇耐受性：方法同上，设置初始乙醇含量(％v/v)为6、7、8、10、11、12、15培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25乙醇耐受复筛显示：目标菌株WLY-L-Y-1-25在乙醇含量高于10％v/v时，酵母生长受到抑制。由此可知，此丛梗孢属酵母新菌株耐受乙醇量为10％v/v。如图6所示。

(4)NaCl浓度耐受性：方法同乙醇耐受性，分别设置初始NaCl浓度(％g/v)为0、5、10、15、20，将目标菌株WLY-L-Y-1-25以1％接种量接种于12°Bx麦芽汁中，28℃培养48h，用紫外分光光度计在600nm测定吸光值，最后计算OD₆₀₀的差值。菌株WLY-L-Y-1-25耐受NaCl浓度初筛显示：15％g/v时，酵母生长受到抑制，10％g/v时，生长状态良好。复筛耐受最高NaCl浓度：方法同上，设置初始NaCl浓度(％g/v)为5、6、7、8、9、10、11培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD₆₀₀值，最后计算OD₆₀₀的差值。目标菌株WLY-L-Y-1-25的NaCl浓度耐受复筛显示：目标菌株WLY-L-Y-1-25在NaCl浓度高于11％g/v时，酵母生长受到抑制。因此，此丛梗孢属酵母新菌株耐受NaCl浓度为10％g/v。如图7所示。

实施例5本发明菌株WLY-L-Y-1-25发酵液中主要风味成分分析

培养基：麦芽汁。葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，蒸馏水配制，pH为6.0，115℃高压灭菌20min。

培养基：五粮粉。五粮(高粱、玉米、糯米、大米、小麦)经打成细粉，按照五粮粉：水＝1:10，自来水煮沸，加入细五粮粉，大约熬煮40min(成稀粥状)，冷却至60℃左右，同时加入液化酶(5g/3L)和糖化酶(5g/3L)，62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖使糖度达到12°Bé左右，pH约为6.8，分装灭菌备用。

WLY-L-Y-1-25菌株种子液，以终浓度活菌数10⁵-10⁶个/mL，接入麦芽汁液体培养基和五粮粉培养基中，装液量200mL/250mL三角瓶，密封，同一处理的样品做三组平行，置于28℃培养发酵72h。

发酵液中风味物质的前处理方法：0.2gLiChrolut EN采用CH₂Cl₂-methanol-超纯水各5ml进行活化，将20mL发酵液、5mL超纯水和20μL同位素内标(100ppm，己酸乙酯-d11、苯甲醇-d7、苯甲醛-d6、乙酸苯乙酯-d3、苯酚-2，4，6-d3)加入至LiChrolut EN SPE玻璃小柱中，采用5mL超纯水进行水洗，然后抽真空10min，再采用5mLCH₂Cl₂进行洗脱，加入1.5g无水硫酸钠干燥过夜，最后采用氮气浓缩至0.5mL。

发酵液中风味性化合物经前处理提取后，随后采用全二维气相色谱-飞行时间质谱技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-fight massspectrometry,GC×GC-TOFMS)分析。根据以下升温程序进行分离：起始温度40℃保持3min后，以5℃/min升温至230℃保持5min。第二个烘箱全程保持比一维烘箱高5℃。调制补偿温度为15℃。调制周期为4s(热脉冲时间0.8s)。样品运行采用恒流模式，载气为高纯氦气(纯度>99.9995％)，流速为1mL/min。离子源电压为70eV，温度为230℃，传输线温度为240℃。溶剂延迟540s，检测器电压为1500V。采集质量数范围为35-400amu，采集频率为100spectra/s。如图8所示。

测定结果如表2所示，可见：菌株WLY-L-Y-1-25在麦芽汁培养基中主要产乙酸苯乙酯、麦芽醇、2-乙酰基呋喃、3-甲硫基丙醇、乙酸、4-乙烯基愈创木酚、糠醛。在五粮粉培养基中主要产3,5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、2-甲基丁酸、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、γ-丁内酯。在两种培养基中共同主要产苯甲醇、苯乙醇、丙醇、正丁醇、异戊醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、己酸乙酯、己酸、异丁酸、乙偶姻、5-羟甲基糠醛、5-甲基呋喃醛。

表2菌株WLY-L-Y-1-25在不同培养基中的风味物质

由上述实施例可知，本发明的WLY-L-Y-1-25菌株可用于发酵产多种风味物质，将其用于白酒酿造，能够提升白酒风味，酿造出风味更佳的白酒，具有很好的应用价值。

序列表

<110> 宜宾五粮液股份有限公司

<120> 丛梗孢酵母属新菌株及其用途

<130> A201028K（序）

<141> 2020-11-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgctgaaag ccattaagcc cgcatcctct accaggagcg gtcctcggtc accggcaggg 60

catccacagc gcggctataa cactcccccc gcaaagagag agccaccttc cgcactgcct 120

tctcccccac cccgtaaccg atgcgggccc cactgcctcc aaagaaacag ctgcggcact 180

gactgccagc gcttccctct tggcaatttc acgtactgtt taactctctt tccaaagtgc 240

ttttcatctt tccctcacgg tacttgttcg ctatcggtct ctccccggta tttagccttg 300

gatggcgttt accacccact ttgcgctgca ttcccaaaca acgcgactcg tcgagcgcac 360

cccacaacac ggcgcacagc cagaccaagc acgggattct caccctctct gatgctgctt 420

tccagcagac ttggcgtcca gccgcaccgc tcgaggcacg tctccagctt acaatgcgcc 480

ctggcgggag ctttcaaatc tgggctcatc ccgcttcgct cgccgctact aggggaatcc 540

atgtttgttt cttttc 556

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatatcaat aagcggagga aaag 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims

1.丛梗孢属(Moniliella sp.)酵母新菌株，其特征在于：保藏编号为CGMCC No.20235。

2.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的26S rRNAD1/D2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的形态学特征为：菌体为长梗，芽殖，芽体为长椭圆形；菌落呈白色，表面平坦，质地纤毛状，边缘整齐不扩散。

4.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的生理生化特征为：能发酵葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰氨基-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、木糖醇、甘油和山梨醇；不可利用2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖、松叁糖、侧金盏花醇、肌醇。

5.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的适宜生长的pH条件为3.0-7.7。

6.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的适宜生长温度为28℃-30℃。

7.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的耐受NaCl浓度为10％g/v。

8.根据权利要求1所述的丛梗孢属酵母新菌株，其特征在于：所述新菌株的耐受酒精度为10％v/v。

9.权利要求1-8任一项所述的丛梗孢属酵母新菌株在白酒酿造中的用途。