CN109321479B - 耐酸酿酒酵母及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酿酒微生物技术领域,具体涉及一种耐酸性能强的酿酒酵母及其用途。针对现有缺乏一种能够耐受强酸,在强酸下发酵能力强的酿酒微生物的问题,本发明提供一种耐酸酿酒酵母,该酵母已在CGMCC中心保藏,保藏编号为CGMCC No.16508。本发明酿酒酵母可耐受39℃高温,耐受最低pH值为2.0,并能在pH为2.2条件下正常发酵,产乙醇量为3.22%,同时具有高耐盐、耐酒精能力。本发明的酿酒酵母可应用于白酒酿造中,维持多粮浓香型窖池高酸正常生产,具有广阔的应用前景和极大的应用价值。

Description

耐酸酿酒酵母及其用途
技术领域
本发明属于酿酒微生物技术领域,具体涉及一种耐酸性能强的酿酒酵母及其用途。
背景技术
乙醇是酿造酒中最重要也是最主要的成分之一,中国白酒中乙醇含量高达40%~55%(v/v);黄酒中为14%~20%;啤酒中为2%~5%。酵母是产生乙醇的主要微生物,也是酿造酒工业中不可缺少的微生物。
白酒不同产区特定的气候环境是影响白酒酿造微生物群系及其代谢的关键因素。微生物群系是贯穿影响白酒酿造“一曲、二泥、三发酵”三方面的主体因素,而特定多样的自然环境又影响了微生物群系的构架、代谢及其风味物质的形成。所以,气候环境是影响白酒品质的关键因素之一。
尤其是在夏季,由于气温高和现有设备条件的限制,入窖温度无法控制,有害微生物迅速繁殖,因而升温过猛,酸度大幅度上升,酵母发酵力低下,导致产酒率低、酒质差等问题。而现有的降温控酸的方法均治标不治本,无法达到理想的效果,且会增加生产成本,因此,寻找一种高酸情况下能正常发酵的酿酒微生物,是本行业函待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题为:现有缺乏一种能够耐受强酸条件,在强酸条件下发酵能力强的酿酒微生物的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为:提供一种耐酸酿酒酵母。该酿酒酵母保藏编号为CGMCC No.16508。保藏时间为2018年9月20日,保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
其中,上述耐酸酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:1耐酸酿酒酵母的ITS核苷酸序列
cggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttgtagagggcgactttggggcggctccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttccgtgtaaagcgctctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgcgccccccgctccttgtgggtgggggactctcgcagctcactgggccagcatcagttttggcggccggacaaaactgcaggaacgtagcttgcttcgggaagtgttacagcctgcaggaatacggccagccgggactgaggaatgcgattcgtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtctt。
其中,上述耐酸酿酒酵母的形态学特征为:菌体为圆形;菌落呈白褐色,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐不扩散。
其中,上述耐酸酿酒酵母的生物学特征为:能利用葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖发酵;不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和松三糖发酵,不能利用醇类。
其中,上述耐酸酿酒酵母的温度耐受力≤39℃。
其中,上述耐酸酿酒酵母的pH耐受力为2.0~5.0。
其中,上述耐酸酿酒酵母的盐耐受浓度为≤9%(g/v)。
其中,上述耐酸酿酒酵母的耐受酒精度为≤12%(v/v)。
本发明还提供了一种上述耐酸酿酒酵母在浓香型白酒酿造中的用途。
本发明的有益效果为:
本发明首次从酒醅中分离出了一种耐酸酿酒酵母新菌株,具有较强的耐酸、耐高温、耐盐能力。能够耐受39℃高温,耐受pH值为2.0,并能在pH为2.2的条件下正常发酵,产乙醇量为3.22%;耐受Nacl浓度为9%(g/v);耐受酒精度为12%(v/v)。本发明为解决白酒生产中因环境温度高、窖池酸度高、酵母发酵力低下而导致产酒率低、酒质差的问题提供了一种新选择,其可维持正常生产,减少污染生酸,具有广阔的应用前景和极大的应用价值。
本发明提供的耐酸酿酒酵母于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏号为CGMCC No.16508,生物学分类命名为Kazachstaniahumilis。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株显微形态图;
图2为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株菌落形态图;
图3为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)不同温度生长情况;
图4为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)不同乙醇浓度生长情况;
图5为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)不同Nacl浓度生长情况;
图6为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株在五粮粉液态静置模拟浓香型白酒窖池发酵中酵母活菌数变化;
图7为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株在五粮粉液态静置模拟浓香型白酒窖池发酵中产乙醇情况;
图8为本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株在五粮粉液态静置模拟浓香型白酒窖池发酵中产生风味物质情况。
具体实施方式
本发明提供了一种耐酸酿酒酵母,保藏编号为CGMCC No.16508。保藏时间为2018年9月20日,保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101。
本发明的菌株是从宜宾五粮液股份有限公司酒醅中分离获得。
其中,上述耐酸酿酒酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
其中,上述耐酸酿酒酵母的温度耐受力≤39℃。
其中,上述耐酸酿酒酵母的pH耐受力为2.0~5.0。
其中,上述耐酸酿酒酵母的盐耐受浓度为≤9%(g/v)。
其中,上述耐酸酿酒酵母的耐受酒精度为≤12%(v/v)。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明,但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
若未特别指明,实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1耐酸酿酒酵母菌株筛选和鉴定
1、菌株的初筛
材料:四川五粮液股份有限公司窖池发酵过程中的酒醅。
培养基:
麦芽汁培养基:商业合成培养基;组成包括:麦芽膏粉13%,氯霉素0.01%。
麦芽汁琼脂培养基:商业合成培养基;组成包括:麦芽膏粉13%,琼脂1.5%,氯霉素0.01%。
YPD培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,蒸馏水配制,pH自然,115℃高压灭菌20min。
YEPD培养基::葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,琼脂2%,蒸馏水配制,pH自然,115℃高压灭菌20min。
试验方法:
称取10g酒醅样品至装有玻璃珠和90mL无菌生理盐水的三角瓶中,160r/min振荡30min备用。无菌条件下取上清液进行梯度稀释,选取梯度为10~3、10~4、10~5、10~6的稀释液100ul,均匀的涂布于麦芽汁平板上,每个稀释梯度涂两个平行,28℃倒置培养3~4d,每12h观察菌落的生长情况;待菌落长出后,挑选菌落形态不同的疑似酵母单菌落于麦芽汁琼脂培养基中,编号并划线纯化,重复纯化2~3次,直至平板上的菌落都为同一形态。挑取单菌落制成水浸片,于显微镜下观察菌体细胞形态,酒醅酵母分离纯化完成。共分离纯化出20株不同形态的酵母菌,编号为1~20#。
2、耐酸酵母的筛选
(1)用接种环分别将1~20#酵母按相同的接种量接种到装有50mL麦芽汁培养基的100mL三角瓶中,摇床28℃,120rpm培养24h,进行活化。
(2)用乳酸调节YPD培养基的酸度,获得pH分别为2.0、2.2、2.5、3.0、3.5、4.0的YPD培养基,灭菌后备用。
(3)对活化后的菌液进行镜检确认无污染后,按相同接种量分别接种于上述YPD培养液中,于28℃培养48h。
(4)通过观察培养液浑浊度判断菌株长势情况。最终选定8株耐酸性能比较好的菌株进行下一步试验。
实施例2耐酸酵母菌株在低pH环境中产乙醇能力研究
分别测定实施例1选定的8株耐酸酵母菌株在不同pH培养48d后发酵液产乙醇能力,以标准菌株1964作为对比,8株耐酸酵母菌在pH≤3.0条件下产乙醇结果如表1所示。
表1耐酸酵母菌产乙醇(%)能力
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 1964
pH=3.0 4.53 4.55 4.19 4.4 4.68 4.69 4.62 4.52 4.33
pH=2.5 4.12 4.07 3.21 3.25 4.24 4.32 3.99 3.06 2.02
pH=2.2 0.04 0.16 0.35 0.3 0.05 3.22 0.15 0.07 0.33
pH=2.0 0.14
注:表中“~”表示没有测出。
由表1结果可知,酿酒酵母菌株6#耐酸性能最好,在pH 2.2时能够正常发酵,产乙醇量仍可以达到3.22%。
因此,特将6#菌株命名为Z3~1作为目标菌株继续研究。
实施例3目标菌株Z3~1的鉴定
1、梅里埃生理生化鉴定试剂盒鉴定
API 20C AUX实验条是由19个同化测定的干粉底物的20个小杯所组成。小杯内含半固体微量培养基供接种,只有能以该底物为碳源的酵母菌才能生长。测定结果是以与对照生长物的比较而得;鉴定结果参照分析图谱索引或鉴定软件。
测试步骤:
①形态学试验
加1滴菌悬液到RAT medium上,如检测到菌丝或假菌丝,记为阳性。该试验组成试条的第21个试验。
②准备试条和接种物
③试条接种
将上述混合悬液注入试条每个试孔中,将吸管的顶部靠在杯内缘加液体,以避免形成气泡。小心注入,表面呈平或稍凸。盖上培养盒,于28℃培养48~72h。
④判读试条
28℃培养48或72h后,每个杯内生长反应情况与0杯(阴性对照)比较,比阴性对照更浑浊者,记为阳性。
该菌株的碳源同化试验结果如表2所示。
表2本发明1#新菌株的生理生化试验结果
Figure BDA0001882313730000051
注:“+”为阳性,“-”为阴性。
2、分子鉴定:提取菌株基因组DNA,用酵母ITS通用引物对正向引物ITS1(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、反向引物ITS4(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)扩增基因组DNA,反应条件为:94℃预变性5min后进入以下循环:94℃变性45s,55℃退火40s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸10min。经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果在NCBI数据库上进行BLAST序列比对,确定为酿酒酵母,并命名为酿酒酵母(Kazachstania humilis)Z3~1。该菌已于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNO.16508,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
SEQ ID NO:2正向引物ITS1的核苷酸序列
tccgtaggtgaacctgcgg。
SEQ ID NO:3反向引物ITS4的核苷酸序列
tcctccgcttattgatatgc。
实施例4本发明酿酒酵母菌株的形态特征及生物学特性鉴定
下述各试验中均要用到新活化的菌体,挑取少量菌体接种于麦芽汁固体培养基中,28℃培养1~2d。
菌落及菌体形态观察
将经活化的酿酒酵母菌株用接种环划线接种于麦芽汁琼脂平板培养基上,28℃培养1~2d,观察菌落形态;用接种针挑取少量菌体,利用显微镜观察菌体形态;
菌体观察结果:菌体呈椭圆形,多核,出芽方式繁殖。如附图1所示。
菌落观察结果:菌落呈白褐色,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐不扩散。如附图2所示。
综述可知:本发明酿酒酵母(Kazachstania humilis)菌株的细胞学特征为:菌体呈椭圆形;菌落呈白褐色,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐不扩散。生理生化特征为:能发酵D-半乳糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖五种糖;不可利用甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、N-乙酰氨基葡萄糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和松三糖作为碳源发酵;醇类几乎都不可利用。
实施例5目标菌株酿酒酵母Z3~1耐受性的验证
(1)温度耐受性:将目标菌株Z3~1进行活化确认无污染后,按相同接种量接种于YPD培养基中,于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值,最后计算OD600的差值。菌株Z3~1温度初筛显示:在40℃时,生长状态不佳。复筛耐受最高温度:方法同上,于35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃培养48h。测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值,菌株Z3~1温度最终显示:目标菌株Z3~1耐受最高温度为39℃,38℃以下生长良好,结果如图3所示。
(2)酒精耐受性:分别设置初始酒精度(%v/v)为0、5、10、15、20、25,将目标菌株Z3~1以5%接种量接种于12°Bx麦芽汁中,28℃培养48h,用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值,最后计算OD600的差值。菌株Z3~1耐受酒精度初筛显示:15%v/v时,酵母生长受到抑制,10%v/v时,生长状态良好。复筛耐受最高酒精度:方法同上,设置初始酒精度(%v/v)为8、9、10、11、12、13、14、15培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值,最后计算OD600的差值。菌株Z3~1酒精度耐受复筛显示:目标菌株Z3~1酒精度高于13%v/v时,酵母生长受到抑制。由此可知,此酿酒酵母菌株耐受酒精度为12%v/v。结果如图4所示。
(3)Nacl浓度耐受性:方法同酒精耐受性,分别设置初始Nacl浓度(%g/v)为0、5、10、15、20,将目标菌株Z3~1以5%接种量接种于12°Bx麦芽汁中,28℃培养48h,用紫外分光光度计在600nm测定吸光值,最后计算OD600的差值。菌株Z3~1耐受Nacl浓度初筛显示:10%g/v时,酵母生长受到抑制,5%g/v时,生长状态良好。复筛耐受最高Nacl浓度:方法同上,设置初始Nacl浓度(%g/v)为6、7、8、9、10培养48h。用紫外分光光度计测定接种后培养0h和48h发酵液OD600值,最后计算OD600的差值。目标菌株Z3~1Nacl浓度耐受复筛显示:目标菌株Z3~1Nacl浓度高于10%g/v时,酵母生长受到抑制。因此,此酿酒酵母菌株耐受Nacl浓度为9%g/v。结果如图5所示。
实施例6酿酒酵母FS~ZJQ发酵液中主要风味成分分析
培养基:五粮粉(为高粱、小麦、大米、糯米和玉米的混合物)。五粮粉打成细粉,五粮粉:水=1:15混匀,水煮沸加入五粮粉,煮至稀粥状,冷却;加入1.8%液化酶,65℃保温3h;再加入1.8%糖化酶,62℃保温3h;过滤,将糖度调至12~13°P,分装,0.68×105Pa,灭菌15min。
培养菌株种子液,以终浓度活菌数105~106,接入五粮粉共发酵培养液中,装液量200mL/250mL三角瓶,密封,同一处理的样品做三组平行,最终的测定结果求平均值。培养周期为15d,发酵第0d、3d、7d、10d、15d取出测定其活菌数、乙醇产生量。发酵结束后检测其挥发性风味物质成分。目标菌株Z3~1五粮粉发酵液活菌数在发酵3d前增长迅速,呈几何级数增长;发酵7d后增速缓慢,几乎达到稳定期(如图6所示)。发酵前7d,目标菌株Z3~1产乙醇量迅速增多,发酵第7d达到最大值(47.2g/L),随后逐渐下降(如图7所示)。目标菌株Z3~1五粮粉发酵液生产出多种风味物质,主要是:苯乙醇、苯乙酸乙酯、异戊醇、己酸、己酸乙酯和乙酸等(如图8所示)。
由实施例结果可知:本发明分离鉴定出一株耐酸能力强的酵母新菌株,能够耐受最低pH值为2.0,并且在pH2.2条件下能够正常发酵,产乙醇量可达3.22%。同时,本发明的耐酸酵母菌株还具有很好的耐高温、耐盐和耐酒精能力,解决了白酒生产中因环境温度高、窖池酸度高、酵母发酵力低下而导致产酒率低、酒质差的问题,具有极高的应用价值。
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 耐酸酿酒酵母及其用途
<130> A181254K
<141> 2018-11-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaggaaaa gaaaccaacc gggattgcct cagtaacggc gagtgaagcg gcaaaagctc 60
aaatttgaaa tctggtacct tcggtgcccg agttgtaatt tgtagagggc gactttgggg 120
cggctccttg tctatgttcc ttggaacagg acgtcataga gggtgagaat cccgtgtggc 180
gaggagtgcg gttccgtgta aagcgctctc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc 240
taagtgggtg gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag 300
tacagtgatg gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt 360
tgaaagggaa gggcatttga tcagacatgg tgttttgcgc cccccgctcc ttgtgggtgg 420
gggactctcg cagctcactg ggccagcatc agttttggcg gccggacaaa actgcaggaa 480
cgtagcttgc ttcgggaagt gttacagcct gcaggaatac ggccagccgg gactgaggaa 540
tgcgattcgt caaggatgct ggcataatgg ttatatgccg cccgtctt 588
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (2)

1.一种酵母菌,其分类命名为Kazachstania humilis,其特征在于:所述酵母菌的保藏编号为CGMCC No.16508。
2.权利要求1所述的酵母菌在浓香型白酒酿造中的用途。
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