CN109251868B - 一株酿酒酵母及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，本发明涉及一株酿酒酵母及应用，尤其是一株既具有高效糖化酶功能又具有良好发酵性能酿酒酵母及其用于生产生物乙醇的应用。本发明所述保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母具有糖化酶活性和良好的发酵性能，且表现出多种淀粉水解相关的酶酶活，在生物乙醇发酵工业中，实现淀粉糖化与酿酒酵母生长和乙醇发酵耦合，可有效替代30～50％外源糖化酶的添加，简化发酵工艺，降低乙醇生产成本，满足乙醇的大规模工业化生产。

Description

一株酿酒酵母及应用

技术领域

本发明属于微生物领域，本发明涉及一株酿酒酵母及应用，尤其是一株既具有高效糖化酶功能又具有良好发酵性能酿酒酵母及其用于生产生物乙醇的应用。

背景技术

由于对石油的过度依赖，能源危机和环境污染已成为制约各国经济发展，影响人类健康的主要因素，开发新能源已成为一项迫切的任务。生物乙醇是一种绿色的可再生能源，主要由纤维素质与淀粉质发酵获得，具有巨大生产潜能，成为了目前世界能源研究开发的热点。

在生物乙醇生产工业上主要以富含淀粉的小麦和玉米为原料，也因其来源广泛、成本低廉，是一种很有潜力的生物资源，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇发酵工业的重要微生物，但它不能直接利用淀粉生产乙醇，因此工业发酵一直利用糖化酶来分解利用淀粉。目前工业酒精生产中广泛应用的糖化酶主要来源黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、得氏根霉(Rhizopusniveus)和臭曲霉(Aspergillus foetides)等。利用淀粉来生产乙醇的方法有：在同一发酵液中共同养殖能水解淀粉和能发酵酒精的两种或以上微生物，以满足在发酵液中即能及时水解淀粉又能发酵生产酒精；或使用含淀粉酶类菌株先对淀粉水解后再利用酵母菌发醇生产酒精；再或先用葡萄糖淀粉酶水解发酵液中淀粉，再进行酵母的酒精发酵。上述三种方式在工业酒精发酵中均有应用。但是上述三种方式都很难使工业酒精发酵条件优化。共同培养糖化菌和发酵菌中大部分淀粉会被用于菌体自身生长繁殖，从而降低酒精产率。若先利用微生物或酶制剂糖化淀粉则增加了生产的成本。如若能获得一株既能产糖化酶又具有良好发酵性能的酿酒酵母应用于乙醇发酵工业，不仅能减少糖化酶的使用量或完全删除糖化工艺(糖化与发酵合二为一)，又能降低能耗，简化工艺节约生产成本，提高原料利用率。

根据酿酒酵母基因组公布数据可见酿酒酵母具有内源的a-淀粉酶、a-葡萄糖酶及糖化酶等一系列与淀粉水解相关的酶系，然而在发酵工业中酿酒酵母却没有表现出相关酶活，认为淀粉水解相关的酶系在长期酿酒酵母自然选育过程中出现了基因沉默或其表达受到多种抑制因子的调控。通过诱变和选择压力驯化相结合的方法激活酿酒酵母体内糖化酶的活性恢复其糖化功能，是一种绿色可行且使酿酒酵母可长期获得遗传性状稳定的糖化酶功能，可切实为目前的生物乙醇产业选育一株既具有高效糖化酶功能又具有良好发酵性能的酿酒酵母。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一株既有糖化酶功能又有良好发酵性能的酿酒酵母以解决以淀粉为原料的生物乙醇产业的先糖化后发酵以及额外添加糖化酶的复杂工艺及高成本的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13506，保藏日期为2016年12月27日。

本发明同时提供了保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母在生产乙醇中的应用。

本发明还提供了一种乙醇的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.13506的酿酒酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵，发酵期间添加蛋白酶和青霉素。

作为优选，所述蛋白酶添加量为0.14Kg/T～0.20Kg/T干基，所述青霉素添加量为5.0ppm～10.0ppm.

作为优选，所述发酵温度前6h控温30℃-32.5℃，6h后控温＜35℃。

作为优选，所述发酵时间为72小时。

作为优选，按扩繁后的培养物酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。

作为优选，所述种子培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉组成，pH值为7.0-7.2。

作为优选，所述发酵培养基由烘干后玉米经浸润、脱胚提油和混合粉碎后加入工艺水和淀粉酶调浆拌料后的液化醪，其干基含量为25％。

由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母具有糖化酶活性和良好的发酵性能，且表现出多种淀粉水解相关的酶酶活，在生物乙醇发酵工业中，实现淀粉糖化与酿酒酵母生长和乙醇发酵耦合，可有效替代30～50％外源糖化酶的添加，简化发酵工艺，降低乙醇生产成本，满足乙醇的大规模工业化生产。

生物保藏信息说明

菌株COTY：分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae于2016年12月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13506。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例3发酵过程失重图；

图2示实施例3酒份分析结果统计图。

具体实施方式

本发明公开了一株既具有高效糖化酶功能又具有良好发酵性能酿酒酵母及其用于生产生物乙醇的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明以中粮生化能源(肇东)有限公司连续发酵5代的酿酒酵母为出发菌株，以多功能等离子体诱变系统(multifunction plasma mutagenesissystem，MPMS)为诱变平台，以淀粉限制性培养基和生物乙醇发酵真实物料为酿酒酵母进化筛选压力，结合Qpix450自动挑克隆机器人和Biomek实验室自动化工作站为高通量筛选方法，对筛选获得具有糖化功能的酿酒酵母最后通过真实生物乙醇发酵物料及发酵工艺的中试检查。

本发明诱变选育的酿酒酵母命名为COTY。该酵母菌中的内源糖化酶(Sga1p)的序列出现在三个位置涉及8个氨基酸的突变，通过诱变筛选后的酿酒酵母具有高效的糖化酶功能，实现了糖化和发酵同步相结合。

酿酒酵母COTY发酵生长适宜温度30～34℃，具有一定的鲁棒性，产酒酒份15.20％(v/v)，糖醇转化率为92％，残总糖2.40(g/100ml)，具有良好的发酵性能。

对于上述酿酒酵母COTY，本发明申请人已于2016年12月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNo.13506。

本发明所述酿酒酵母COTY具有糖化酶活性，可有效替代30～50％外源糖化酶的添加，实现淀粉糖化与酿酒酵母生长和乙醇发酵耦合，能够应用于生产乙醇中，降低乙醇生产成本。因此，本发明提供了酿酒酵母COTY在生产乙醇中的应用，即保藏编号为CGMCCNo.13506的酿酒酵母在生产乙醇中的应用。

本发明还提供了一种乙醇的生产方法，将保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵，发酵期间添加蛋白酶和青霉素。

其中，作为优选，所述蛋白酶添加量为0.14Kg/T～0.20Kg/T干基，在一些实施例为0.15Kg/T干基。

作为优选，所述青霉素添加量为5.0ppm～10.0ppm。在一些实施例为5.0ppm。

本发明所述生产方法中，所述发酵温度为本领域公知，本领域技术人员均可采用合适的培养基进行乙醇的发酵。

在一些实施方案中，所述发酵温度前6h控温30℃-32.5℃，6h后控温＜35℃。

本发明所述生产方法中发酵可以一直进行到不再产生乙醇为止，然后可根据本领域常规方法对乙醇进行分离。

在一些实施方案中，所述发酵时间为66-78小时。

本发明所述生产方法中所述扩繁用的酿酒酵母接种量以及扩繁后的培养物接种量为本领域公知，本领域技术人员均可根据种子培养基及发酵培养基的多少，采用合适的接种量进行乙醇的发酵。

在一些实施方案中，按扩繁后的培养物酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。

对于扩繁用的种子培养基以及发酵用的发酵培养基为本领域公知，本领域技术人员均可采用合适的培养基进行乙醇的发酵。

作为优选，本发明所述种子培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉组成，pH值为7.0-7.2。

作为优选，本发明所述发酵培养基为干基含量为25％的液化醪。

所述液化醪由烘干的玉米经浸润、脱胚提油和混合粉碎后加入工艺水和淀粉酶调浆拌料制得。

由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母具有糖化酶活性和良好的发酵性能，且表现出多种淀粉水解相关的酶酶活，在生物乙醇发酵工业中，实现淀粉糖化与酿酒酵母生长和乙醇发酵耦合，可有效替代30～50％外源糖化酶的添加，简化发酵工艺，降低乙醇生产成本，满足乙醇的大规模工业化生产。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：酿酒酵母的诱变

1、将中粮生化能源(肇东)有限公司连续发酵5代的酿酒酵母发酵液稀释10⁷，取100μl涂布YPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，2％琼脂粉，pH7.0)固体平板，待长出单菌落后，挑取单菌落接种至YPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基中，30℃、250rpm进行摇瓶培养，培养至OD600为1.0～1.5左右，取一定量培养液以无菌生理盐水清洗菌体并用无菌生理盐水制备菌悬液。

2、设置多功能等离子体诱变系统(multifunctionplasma mutagenesissystem，MPMS)，以氮气作为等离子体的工作气体，在电源功率300W，平台高度14mm，等离子体的温度＜35℃，湿度＞10％，气体流量12slpm，诱变方式A的条件下，分别将50μl制备的菌悬液滴于无菌金属槽内中心位置，分别进行等离子体照射10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s后，以无菌生理盐水对处理完的菌悬液进行梯度稀释涂布于YPS(2％可溶淀粉、2％蛋白胨、1％酵母粉，2％琼脂粉，pH 7.0)固体平板，将平板分别放置于30℃、33℃、35℃生化培养箱中培养，待形成单菌落并观察其淀粉水解圈。

3、挑取具有明显淀粉水解圈的单菌落分别接种于20mlYPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基和YPS(2％可溶淀粉、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基中培养72h，每12h取样采用DNS法对糖化酶酶活进行检查。结果显示经过MPMS诱变及YPS限制性培养基压力筛选后的酿酒酵母部分菌株具有了不同程度的糖化酶活性。

实施例2：乙醇发酵工业物料连续驯化选育

挑选实施例1筛选表现出糖化酶活性的酿酒酵母，进行乙醇发酵工业物料连续驯化以确保选育发酵性能较好的酿酒酵母。以2L全自动发酵罐进行连续驯化；取中粮生化能源(肇东)有限公司三期(或二期)生产装置液化醪及酒母醪至自动化发酵罐，按照20％接种比例接种上述酿酒酵母。初始发酵至36小时后，取出一定比例的发酵醪，补充新鲜液化醪继续进行发酵，如此重复多轮操作。每一轮驯化结束后取部分发酵液稀释一定比例涂布YPS(2％可溶淀粉、2％蛋白胨、1％酵母粉，2％琼脂粉，pH 7.0)固体平板，将平板分别放置于30℃、33℃、35℃生化培养箱中培养，待形成单菌落后，采用Qpix450自动挑克隆机器人进行快速大量单克隆的挑取并进行96孔板的培养，在96孔板中采用发酵物料培养基的耐高浓度乙醇、耐温的压力选择培养，采用Biomek实验室自动化工作站进行高通量的OD600、酶活及酒份的检查筛选BioLector，筛选获得一株酿酒酵母与出发菌株相比具有相同的发酵生产乙醇能力，并具有一定的糖化酶活性，命名为COTY。

采用DNS方法进行筛选获得的酿酒酵母全细胞酶活检测，同时对发酵生产乙醇能力及发酵性能进行检测，结果见表1。

表1酿酒酵母全细胞酶活、发酵生产乙醇能力及发酵性能

表1结果显示，通过诱变筛选获得的酿酒酵母COTY表现出了一定的糖化酶活性，同时发酵生产乙醇能力及发酵性能检测结果显示筛选获得的酿酒酵母COTY与诱变筛选的出发菌株具有相同的乙醇发酵生产能力。

实施例3：酿酒酵母COTY真实生物乙醇发酵物料及发酵工艺的中试检查

将实施例2中驯化筛选出的酿酒酵母COTY和诱变驯化出发酿酒酵母菌株，进行发酵工艺中减少外源糖化酶使用的验证，两株菌经过YPD(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)液体培养基中扩培至相同细胞密度后，分别离心收集菌体，洗净后分别接种至减少0％、15％、30％、50％、75％外源糖化酶的200ml液化醪中，30℃、250rpm振荡培养96h，发酵培养结束后采用HPLC检测乙醇含量、葡萄糖残留、甘油含量，结果见表2。

表2乙醇含量、葡萄糖残留、甘油含量检测

g/100ml	A	A15	A30	A50	A75	B15	B30	B50	B75
										四糖以上	0.47	0.56	0.75	1.98	3.25	0.51	0.54	0.6	1.68
麦芽三糖	0.07	0.09	0.15	0.34	0.38	0.07	0.08	0.03	0.34
										麦芽糖	0.29	0.27	0.26	0.31	0.35	0.31	0.3	0.28	0.24
葡萄糖	0.03	0.02	0.01	0.09	0.1	0.03	0.03	0.03	0.08
										果糖	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.05	0.04
丁二酸	0.17	0.16	0.16	0.14	0.15	0.17	0.17	0.16	0.14
										乳酸	0.12	0.12	0.12	0.09	0.09	0.12	0.12	0.13	0.09
甘油	1.24	1.17	1.14	0.97	0.95	1.24	1.23	1.19	0.95
										乙酸	0.05	0.04	0.03	0.04	0.04	0.05	0.05	0.05	0.04
乙醇	12.56	12.55	12.42	11.66	10.94	12.6	12.59	12.56	11.93
										色谱还原糖	0.14	0.16	0.21	0.47	0.52	0.14	0.15	0.11	0.45
色谱总糖	0.91	1.00	1.22	2.76	4.11	0.96	1.00	0.98	2.38
										乙醇/甘油	10.14	10.68	10.89	12.00	11.50	10.17	10.25	10.52	12.6
总有机酸	0.33	0.32	0.32	0.27	0.27	0.34	0.34	0.34	0.27
										酒份％(v/v)	15.01	15.00	14.84	13.94	13.07	15.06	15.04	15.01	14.25

注：A:出发菌株糖化酶不减量0％；A15:出发菌株糖化酶减量15％；A30:出发菌株糖化酶减量30％；A50:出发菌株糖化酶减量50％；A75:出发菌株糖化酶减量75％；B15:酿酒酵母COTY糖化酶减量15％；B30:酿酒酵母COTY糖化酶减量30％；B50:酿酒酵母COTY糖化酶减量50％；B75:酿酒酵母COTY糖化酶减量75％。

表2结果显示，在30％～50％糖化酶减量下，酿酒酵母COTY发酵性能优于相同糖化酶减量下诱变出发菌株发酵性能，且与常规糖化酶添加量下诱变出发菌株的发酵性能持平。

发酵中试试验：以50L的中试发酵罐进行酿酒酵母的减少50％糖化酶使用量的发酵性能试验。酿酒酵母COTY接种YEPD液体培养基，培养18h以上，数酵母数，种子液按初始0.125亿/ml折算用量，加入40L液化醪中接种量16％，同时加入0.15Kg/T干基的蛋白酶和5.0ppm的青霉素，发酵总时间为72h。发酵温度前6h控温30-32.5℃，6h后控温＜35℃，不同时间点取相同体积发酵醪液及时记录每个样品的重量，结果见表3和图1。

表3不同发酵时间失重

表3结果显示，采用诱变选育的酿酒酵母COTY进行乙醇发酵真实物料的中试试验，在减少50％外源糖化酶添加的情况下，72小时的发酵周期中COTY的乙醇生产速率与外源糖化酶不减量的出发菌株保持一致，说明COTY菌株发酵过程中减少50％糖化酶的使用不会影响乙醇的生产速率。

取发酵液约10ml，用两层纱布过滤，稀释过滤液10倍后检测还原糖、残总糖含量，结果见表4。

表4残糖含量检测结果

残还原糖、残总糖等数据均是乙醇发酵工艺中常用来表征发酵性能及糖醇转化效果，高残糖说明发酵不彻底，菌株对碳源的利用不足，其生长及发酵性能差，同时高残糖对发酵下游副产品的品质均有较高影响。从表3可见，COTY菌株在糖化酶减量50％的情况下其发酵结束时残糖指数与出发菌株保持一致，说明COTY菌株发酵过程中减少50％糖化酶的使用不会影响糖醇转化率。

另取12ml发酵液倒入15ml离心管，加入65％硫酸混合均匀使酶失活，同时调节pH值为1.0-1.5，4000rpm离心20min，然后用注射器吸取离心清液，用0.22μm微孔滤膜进行过滤，对滤液进行HPLC分析结果见表5，酒份分析结果见图2。

表5 HPLC分析结果

表5结果显示，发酵液HPLC检测结果反映整体发酵性能及发酵各指标，结果可见COTY菌株发酵过程中减少50％糖化酶的使用可以达到出发菌株的发酵指标，且发酵产酒酒份为15.20％(v/v)，符合目前燃料乙醇的发酵生产要求。

综上所述，诱变选育的酿酒酵母COTY发酵生长适宜温度30～34℃，具有一定的鲁棒性，产酒酒份15.20％(v/v)，糖醇转化率为92％，残总糖2.40(g/100ml)，具有良好的发酵性能。

实施例4：酿酒酵母COTY糖化功能机理分析

MPMS诱变及工业物料的连续驯化认为在一定程度上去除了酿酒酵母内源淀粉水解相关酶系的转录表达抑制因子，使相关酶系得以表达具有一定活性。其中扩增酿酒酵母COTY内源糖化酶基因(Sga1p)，将扩增结果与Genbank公布的酿酒酵母内源糖化酶基因(Sga1p)序列(Genbank注册序列号为330443595)作BLAST比对，进行同源性分析，分析结果显示酿酒酵母COTY内源糖化酶(Sga1p)片段与Genbank基因库公布的酿酒酵母内源糖化酶基因(Sga1p)的同源性为98％，出现了三个位置涉及8个氨基酸的突变，突变氨基酸为：Q120T、T121S、H122E、F194Y、E196A、D197S、Y410V、F412T，推测突变后的内源糖化酶(Sga1p)使该酿酒酵母具有一定的糖化酶功能。

Claims (9)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13506。

2.保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母在生产乙醇中的应用。

3.一种乙醇的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.13506的酿酒酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵，发酵期间添加蛋白酶和青霉素。

4.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述蛋白酶添加量为0.14Kg/T～0.20Kg/T干基，所述青霉素添加量为5.0ppm～10.0ppm。

5.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵温度前6h控温30℃-32.5℃，6h后控温＜35℃。

6.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵时间为66-78小时。

7.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，按扩繁后的培养物酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。

8.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉组成，pH值为7.0-7.2。

9.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基为干基含量为25％的液化醪。

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