CN102154137B - 一株温度耐受性酿酒酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株温度耐受性酿酒酵母及其应用。该酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT 1373，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4378。该突变酵母菌株克服了普通酵母菌不能耐受高温(47℃及以上)的难题，具有在47℃高温下仍然能正常发酵的优点。因此，本专利的耐高温酿酒酵母菌具有重要的经济和应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株温度耐受性酿酒酵母及其应用。
背景技术
酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于生产和现代生物学研究。酵母是世界上研究最多的微生物之一，是当今生物技术产品研发的热点和现代生物技术发展以及基因组研究的模式系统。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵工业中最常用的种类，其温度耐受性在28℃-35℃。在发酵的过程中，由于各种生化反应的不断进行，导致整个发酵体系的温度不断升高，从而严重影响酵母细胞的正常生长与代谢，甚至引起酵母的大量死亡。所以在实际生产过程中不得不采取各种方法对发酵体系进行降温，以保证发酵过程的正常进行；这是一种较大的物力和财力耗费。同时，耐高温酵母在饲料、酒精和面包的生产中也有广泛的需求。因此，获得耐高温酵母已成为当前国内外工业发酵行业研究的热点，备受广泛的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一株温度耐受性酿酒酵母及其应用。
本发明提供的酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT1373，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4378。
本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT1373为诱变得到，已于2010年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.4378。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT1373在生产饲料、酒精或面包中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供的获得耐47℃高温酿酒酵母的方法，包括如下步骤：用酵母膏胨葡萄糖(Yeast extract Peptone Dextrose，YPD)液体培养基在28℃活化酵母至对数生长期前期，再以1％(体积比)的比例转接至YPD液体培养基中，在28℃培养至OD560值为0.6-1.5。吸取5mL的菌液于90mm培养皿中，置于紫外灯下进行诱变。条件为：紫外灯功率15W，距离30cm，时间10-50s。诱变后在4000rpm离心10min富集菌液，涂布于YPD固体培养基上，于45℃-50℃高温下筛选。紫外诱变后的菌株在可见光下会有光复活现象，因此所有操作必需在红光下进行。
上述酵母可以是购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为1373的酿酒酵母。
上述获得耐高温酿酒酵母的方法中，效果最佳的一种方法如下：所述的培养基为YPD液体培养基，活化转接后的菌液OD560为1.2，紫外诱变时间为18s。
该方法选取合适浓度的菌液，即处于对数生长期前期的菌液，此时菌液浓度适中，能保证在所述条件下获得较高的突变频率，同时菌株生命力旺盛，新陈代谢比较活跃，对紫外线敏感，最易于发生基因突变而得到所需的突变株。基础耐温性能的测定是为了对比所得到的突变株在温度的耐受性上得到真正的提高。
本专利的耐高温酵母克服了普通酿酒酵母不能在高温下正常发酵的难点，具有47℃耐受性。因此，本专利所获得的耐高温酵母具有重要的经济和应用推广价值，在发酵工业中如饲料、酒精或面包的生产中具有很重要的应用价值。在生产上的优势主要表现为：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的糖化发酵同步进行；从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率；②繁殖速度快，即具有高的生长速率。高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高，因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高；⑤对培养基的适应性强，耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。因此，使用耐高温酵母不仅有利于降低生产成本，充分利用现有设备，缩短生产周期，提高生产率，而且保证了夏季的正常生产。
附图说明
图1为1373的生长曲线；
图2为1373在紫外照射下的致死曲线。
具体实施方式
实施例1、本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT1373的获得及鉴定
一、酿酒酵母生长曲线的测定
1、实验材料：购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为1373的酿酒酵母；是目前温度耐受性较高的菌株。
YPD液体培养基：1％(质量百分含量)酵母提取物，2％(质量百分含量)蛋白胨，2％(质量百分含量)葡萄糖，自然pH值。
2、实验步骤
(1)活化：挑取单个斜面1373活化菌落接种于10mL的YPD液体培养基中，28℃，180rpm培养8-12h。
(2)转接：取2.5mL活化的菌液转接入250mL的YPD液体培养基中。
(3)培养：将转接后的菌液分装到25个三角瓶中，每瓶10mL，在28℃，180rpm振荡培养24h。
(4)测定：从0h开始，每小时取出一瓶菌液测定其OD560值，每一瓶菌液重复测定三次，结果取平均值。
(5)绘制生长曲线：以时间(h)为横坐标，OD560值为纵坐标，绘制24h生长曲线。
3、实验结果
结果如图1所示，1373菌株在0-4h为延迟期，4-13h为对数生长期，以后逐步进入稳定期。因为处于对数生长期的菌体生长旺盛，易感性强，处于诱变的最佳时期，故选取此时期的菌液用于诱变实验。所以，对于1373菌株，选取培养10h后的菌液(OD560为1.2)，用于诱变实验。
二、酿酒酵母的温度耐受性测定
1、实验材料：购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为1373的酿酒酵母；是目前温度耐受性较高的菌株。
2、实验方法：
(1)活化：挑取单个斜面1373活化菌落接种于10mL的YPD液体培养基中，28℃，180rpm培养8-12h。
(2)转接：取2.5mL活化的菌液转接入10mL的YPD液体培养基中，培养适合的时间。
(3)温度耐受性的测定：吸取转接后的菌液100μL，稀释适当的倍数后，取100μL稀释后的菌液分别涂布于YPD固体培养基中，分别放置于39，40，41，42，43，44，45℃培养，36h后观察酵母菌的生长情况。每个温度涂三个平板。
3、实验结果
结果如表1所示，实验结果表明，1373酿酒酵母菌株能耐受的最高温度为40℃。
表11373酿酒酵母的温度耐受性
注：“+”表示可以生长，“-”表示不能生长，“+”的个数表示菌落的相对数目。
三、酿酒酵母的紫外诱变
1、实验材料：购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为1373的酿酒酵母；是目前温度耐受性较高的菌株。
2、实验方法：
(1)活化：挑取单个斜面1373活化菌落接种于10mL的YPD液体培养基中，28℃，180rpm培养8-12h。
(2)转接：取2.5mL活化的菌液转接入10mL的YPD液体培养基中，培养至对数生长期(即OD560为1.2)。
(3)紫外诱变致死曲线的绘制：取浓度为107/mL的菌液5mL，置于90mm培养皿中(带搅拌子)，并放入紫外诱变箱的磁力搅拌器上进行紫外诱变。诱变条件为：紫外灯功率15W，诱变距离(紫外灯到培养皿的距离)30cm，分别诱变10，20，30，40，50s。每个诱变时间重复三次。将紫外辐射后的菌液适当稀释后涂布于YPD固体培养基上黑暗培养36h后，计算三次平均菌落数，用菌落数除以未诱变的总菌落数即可算出致死率。所有操作均在红灯下进行。以时间(s)为横坐标，致死率(％)为纵坐标，绘制致死曲线。
(4)紫外诱变：根据致死曲线，选择致死率为80％左右的时间点，即紫外诱变时间为18s，同步骤(3)的操作进行紫外诱变。在45，46，47，48，49，50℃下筛选出所需要的突变菌株。
3实验结果
致死率曲线如图2所示，选择致死率为80％左右的时间点(即紫外诱变时间为18s)筛选出一株最高能耐受47℃的突变株，比原始菌株的基础最高耐受温度提高了7℃，其它性状没有改变，将其命名酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SBT1373；按照步骤二的方法测定其在45，46，47，48，49，50℃下的温度耐受性，结果如表2所示。酿酒酵母SBT1373，已于2010年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.4378。
表2SBT 1373酵母菌株的温度耐受性
注：“+”表示可以生长，“-”表示不能生长，“+”的个数表示菌落的相对数目。
Claims (2)
1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SBT1373，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4378。
2.权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC №.4378生产饲料、酒精或面包中的应用。
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