CN101845404A - 一种酿酒酵母菌株及其选育方法以及该菌在酒精生产上的应用 - Google Patents

一种酿酒酵母菌株及其选育方法以及该菌在酒精生产上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母菌株，分类命名为Saccharomyces cerevisiae Y09tj，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3476。本发明还提供了该菌株的选育以及高温快速浓醪发酵淀粉生产乙醇的方法。该菌株从自农家常见自酿甜酒中分离经紫外诱变选育得到。酿酒酵母菌CGMCC NO.3476生长快，发酵能力强，具有很高的抗乙醇毒性，并可耐高葡萄糖浓度，最高可耐62％(m/v)葡萄糖浓度，利用本发明的方法平均出酒率比其它生产菌提高1.2％，出酒率可高达16.0％(v/v)，且发酵周期短，仅需46h，设备利用率可大幅提高，发酵成本大大降低。

Description

一种酿酒酵母菌株及其选育方法以及该菌在酒精生产上的应用
技术领域
本发明涉及一株能快速生长且适于高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌株及其选育方法，以及利用该菌高温浓醪发酵淀粉生产燃料乙醇的方法，属工业微生物发酵工程技术领域。
背景技术
世界石油资源日趋枯竭，大力发展、使用燃料酒精，是国家一项新能源战略。木薯燃料酒精的研究和成功产业化，具有很大的战略意义和社会效益。目前木薯原料生产燃料乙醇大部分采用间歇式稀醪发酵，存在技术水平低，发酵效率低，能耗大，环境负荷大及经济性有待进一步提高等问题。美国企业浓醪发酵酒精浓度普遍可达15％(v/v)以上，而国内浓醪发酵酒精浓度仅为11％-12％(v/v)。经实际测算，每提高1％的发酵醪酒分(玉米为原料)，吨酒精收益约为30-40元，酒精生产企业中酒精含量每提高1％，能耗下降3％，整体经济效益提高3％。作为能源使用的燃料乙醇寻求环保、低成本的酒精发酵技术，浓醪发酵技术是发展发酵燃料乙醇工业的有效途径之一。浓醪发酵可以提高设备利用率，可节能省水，缩短发酵周期。目前，制约木薯原料浓醪发酵的主要瓶颈是发酵菌种和酶制剂。在浓醪发酵中，由于可发酵性糖含量高，普通酿酒酵母菌在浓醪液中生长繁殖和发酵受到抑制，且对温度敏感，高温耐受范围小，发酵最适温度通常为28～33℃，一般不超过36℃，而糖化酶的最适温度为60℃。若提高发酵温度，酶活力上升，单位时间内可发酵性糖的转化率提高，发酵周期会有所缩短，同时发酵温度的提高可减少冷却水的用量。在酒精生产过程中，酒精含量对酵母菌的生长影响很大，普通酵母在乙醇浓度达11％左右时，发酵完全受到抑制，所以在浓醪发酵时，有必要选用酒精耐性高的酵母菌。综上所述，耐高温、耐酒精和耐高糖的酵母菌，可以更好地适合浓醪酒精发酵的要求，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种能快速生长且适于高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌株及其选育方法，以及利用该菌高温浓醪发酵淀粉生产燃料乙醇的方法。
本发明技术方案如下：
一种能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌，经中国科学院微生物研究所鉴定，其分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为Y09tj，已于2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.3476。
所述酿酒酵母菌CGMCC NO.3476可在麦芽汁和含葡萄糖或麦芽糖或棉子糖的YPD培养基上生长，YPD培养基成分含蛋白胨20g/L、酵母粉5g/L和糖20g/L，乳白色，表面平滑，边缘整齐，适宜生长温度为28℃-40℃，最适生长温度37℃，葡萄糖最高耐受浓度为62％(w/v)，且生长快速，且有很好的抗乙醇毒性，适于浓醪发酵生产酒精。
所述酿酒酵母菌CGMCC NO.3476的选育方法，其特征是从常见的农家自酿甜酒中分离并经紫外诱变筛选得到，方法如下：
(1)培养基
YPD液体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自来水定容至1000ml；
YPD固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，自来水定容至1000ml；
种子培养基：同前述YPD液体培养基；
上述培养基经高温121℃灭菌20min；
发酵培养基：30％-40％的淀粉，加自来水定容至100ml，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，再添加尿素0.1g；
(2)出发菌株分离筛选
菌种初筛：取5g甜酒样品加入装有100ml无菌生理盐水的小三角瓶中，置37℃摇床振荡培养2h，静置5min，取上清液做浓度梯度稀释至10-6倍，取200μl稀释液涂布于YPD平板，37℃倒置培养2d，挑取较大的酵母单菌落转接于10ml含10％葡萄糖的YPD液体培养基，置37℃，160r/min摇床培养，观察产泡沫的速度和量，闻发酵液中酒精浓度，初步筛选产酒精快而多的菌株，经YPD平板分离划线法得到纯种，取一环活化好的菌种接于5ml液体YPD培养基，37℃，160r/min摇床培养16h得初筛菌种种子液；
菌种复筛：30g的淀粉按1∶2.2(w/v)的料水比调好淀粉浆液，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，淀粉糊液冷却至37℃，加入终浓度为0.1％的尿素，分别接入初筛菌种种子液，接种量为5％，置37℃，160r/min摇床发酵3d，定时取样测酒度和残糖，选出生长发酵速度快，产酒率高，残总糖和残还原糖低的菌株，以此菌株作为出发菌株；
(3)紫外线诱变育种
酵母菌原生质体制备：从活化好的菌种斜面上分别取一环接种于100ml液体培养基上，于30℃，200r/min摇床培养12～16h，收集对数生长期细胞，各取5ml加入离心管中3500r/min，离心5min，用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗2次，30℃静置10min，离心弃去上清液，加入含有纤维素酶和蜗牛酶的PB破壁溶液，于30℃水浴处理处理30min，2000r/min，离心10min，用含0.1mol/L磷酸缓冲液、0.7mol/L KCl、pH6.0的高渗PB缓冲液洗涤2次，离心收集原生质体；
酵母菌原生质体诱变：取10ml原生质体液置于带转子的9cm的平皿中，在15W紫外灯下距30cm磁力搅拌照射15-20s后，取0.2ml涂在含5％NaCl的YPD固体培养基高渗平板(ok)，30℃恒温避光培养3d；
平板初筛：将紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分别放置在37℃、40℃进行培养，选出生长快且菌落大的耐高温菌株，将选出的耐高温菌株的以同样的方法制备原生质体，以同样的方法经紫外线照射，菌液涂布在含8％～15％酒精浓度的YPD平板，于37℃培养，选出生长快且菌落大的耐高温、耐高酒精菌株，再利用含0.1％TTC的YPD固体培养基平板筛选出产酒精能力强的突变菌株；
发酵复筛：利用平板初筛获得的菌株用发酵培养基进行发酵筛选，用显微镜观察菌体的活菌数和出芽率，筛选出产酒性能最优的酵母菌Y09tj。
所述酿酒酵母菌CGMCC NO.3476的性能测定方法及结果如下：
稳定性验证：把酿酒酵母菌CGMCC NO.3476在YPD培养基，37℃培养温度条件下传代十次，然后进行耐温和耐酒精试验，并用发酵培养基进行发酵产酒试验，发现其生长发酵速度快、产酒率高，其耐温和耐酒精的优良性状稳定遗传。
生长曲线测定：取一环活化好的菌种接于5ml液体YPD培养基，37℃，160r/min摇床培养16h，取1ml转接到250ml新鲜液体YPD培养基，37℃，160r/min摇床培养24h，每隔2小时取样，以未接种的液体YPD液体培养基为对照，测定不同培养时间下，菌悬液用分光光度计于可见光600nm测定光吸收值OD600，根据光吸收值和时间绘制生长曲线图，如附图1所示，酵母菌CGMCC NO.3476比对照菌株生长速度快，接种5小时就可达到对数生长期，比对照菌株提前了4个小时。
耐温测定：将酿酒酵母菌CGMCC NO.3476接种入含10％的葡萄糖的YPD液体培养基的试管中，试管内放有杜氏小试管，将试管分别放置在37℃、40℃、42℃和45℃培养箱，次日观察试管的产气泡情况。结果发现在37℃产气情况很好，40℃产气情况为37℃的80％以上，42℃有少量，45℃微量。
耐糖测定：将酿酒酵母菌CGMCC NO.3476接种入含10％-70％范围的葡萄糖的YPD液体培养基的试管中，试管内放有杜氏小试管，放置在37℃培养箱，次日观察试管的产气泡情况。结果发现在含葡萄糖为62％的试管内仍有气泡产生，说明其可耐高达62％的葡萄糖。
由此可见，酿酒酵母菌CGMCC NO.3476具备生长速度快，产酒率高，发酵周期短的优势和耐高温、耐高糖和耐酒精等性能特点，适于高温浓醪发酵制取酒精。
本发明还提供了利用酿酒酵母菌CGMCC NO.3476高温快速浓醪发酵淀粉生产燃料酒精的方法，步骤如下：
1、种子液准备
接种酿酒酵母菌CGMCC NO.3476于YPD液体培养基中，37℃摇床培养过夜，使OD600约为10左右，得种子液；
2、浓醪液准备
基于容器的容积，称取重量体积比30％～40％的淀粉置于容器中，加水搅拌均匀，按20u/g淀粉加入液化酶，加热升温使液化温度为85-90℃，液化时间1h，使DE值为15％-20％，得浓醪液；
3、接种发酵
浓醪液降温至37℃，按100u/g淀粉加入糖化酶，添加0.1％(m/v)的尿素，以5％接种量接入种子液，置于37℃摇床进行同步糖化发酵，转速100r/m，发酵时间46h，即可得酒精。
本发明的技术优点和有益效果是：
1、酿酒酵母菌CGMCC NO.3476适宜生长温度范围广，一年四季均可使用，尤其保证夏季高温正常发酵，适合于南方的天气条件，有利于节省能耗。
2、酿酒酵母菌CGMCC NO.3476性能稳定，长期冰箱甘油保藏发酵性能不降低，多批次发酵结果都有较好的重现性。
3、酿酒酵母菌CGMCC NO.3476生长快，发酵能力强，具有很高的抗乙醇毒性，并可耐高葡萄糖浓度，最高可耐62％葡萄糖浓度，适宜浓醪发酵，利用本发明的方法平均产酒率比其它生产菌提高1.2％，出产酒率可高达16.0％(v/v)，且发酵周期短，以含26.8％总糖的淀粉液化醪为底物发酵40h其酒度达15.0％，一般工业用酵母菌为发酵70h其酒度仅达14.5％。本发明发酵周期短，设备利用率可大幅提高。
保藏信息说明
一株能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj，目前保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2009年11月24日，保藏编号为CGMCC NO.3476。
附图说明
图1是酿酒酵母菌CGMCC No.3476和工业用菌在37℃的生长曲线。
图2是酿酒酵母菌CGMCC No.3476在500L发酵罐的发酵曲线图。
具体实施方式
实施例一：三角瓶摇床试验
1.高温发酵实验
1.1种子液的准备：将斜面保存的酿酒酵母菌CGMCC NO.3476接种入装有100mLYPD液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养过夜，使种子液的OD600约为10左右。
1.2工艺方案和基本条件：
工艺方案按照原料准备、调浆、液化、添加糖化酶、添加尿素发酵的步骤，采用液化酶一次加入，液化温度85-90℃，液化时间1h，无糖化，降温到37℃后添加诺维信糖化酶并接种发酵的发酵工艺。
实验的基本条件如下：
(1)原料淀粉量：33％(m/v)
(2)调浆方法：室温，加入自来水
(3)液化：震荡水浴锅加热至85-90℃，液化1h
(4)淀粉酶用量：22u/g原料
(5)糖化酶用量：105u/g原料
(6)尿素用量：0.1％(m/v)
(7)接种量：5％
1.3发酵实验：将种子液接入液化醪，分别在温度为30℃、37℃、40℃，转速100r/min的摇床进行发酵产酒试验，发酵46h。
1.4结果：如表1所示，酿酒酵母菌CGMCC NO.3476在37℃时产酒量最高，在40℃时的产酒量为最高产酒量的80％以上。
表1.酵母菌CGMCC№.3476在不同温度下发酵的酒精含量
Figure G2010100456213D00051
2.高温浓醪发酵实验
2.1种子液的准备，与1.1相同。
2.2工艺方案和基本条件：与本实施例1.2的工艺方案和基本条件，除原料淀粉量分别为30％、33％和40％外，其余相同。
2.3发酵实验：将种子液接入30％、33％和40％的淀粉液化醪，在37℃，100r/min的摇床进行发酵产酒试验，发酵46h。
2.4结果：如表2所示酿酒酵母菌CGMCC NO.3476在高温浓醪条件下发酵产酒，产酒度可达16.28％。
表2.酿酒酵母菌CGMCC№.3476三角瓶浓醪发酵结果
Figure G2010100456213D00061
3.与工业菌株的发酵对照实验
3.1种子液的准备：与本实施例1.1的相同
3.2工艺方案和基本条件：本实施例1.2相同
3.3对照发酵实验：分别将对照工业菌株的种子液和酿酒酵母菌CGMCC NO.3476的种子液接入淀粉液化醪，在37℃，100r/min的摇床进行发酵产酒试验，测定成熟发酵醪的酒度、残还原糖和残糖。
3.4结果：如表3所示，酿酒酵母菌CGMCC NO.3476比对照工业菌株的发酵时间缩短了14h，且产酒量也高一些。
表3酿酒酵母菌CGMCC No.3476与对照工业菌的发酵结果
Figure G2010100456213D00062
实施例二：20L发酵罐小试
1、种子液的准备：将斜面保存的酿酒酵母菌CGMCC NO.3476接种入装有YPD液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养过夜，使种子液的OD600约为10左右。
2、工艺方案如下：
按照原料准备、调浆、液化、添加糖化酶、添加尿素发酵的步骤，采用液化酶1次加入，液化温度85-90℃，液化时间1h，无糖化，降温到37℃后添加诺维信糖化酶并接种发酵的发酵工艺。
3、实验的基本条件如下：
(1)原料淀粉量：33％(m/v)
(2)调浆方法：室温，加入自来水
(3)液化：边搅拌边加热至90～95℃，液化60min
(4)淀粉酶用量：22u/g原料
(5)糖化酶用量：105u/g原料
(6)尿素用量：0.1％(m/v)
(7)接种量：10％
4、发酵实验：将种子液接入液化醪，在温度为37℃，搅拌转速100r/min的条件下发酵44h。
5、结果：酒精浓度可达到14.9％(v/v)，残还原糖0.55％，残总糖1.30％。
实施例三：500L发酵罐放大中试
1、种子液的准备：接种一环斜面保藏的菌种于装有100ml的YPD液体培养基的三角瓶中，37℃摇床培养过夜，次日转接扩大培养，使种子液的OD600约为10左右。
2、工艺方案与基本条件与实施例二相同。
3、发酵：将种子液接入液化醪，在温度为37℃，搅拌转速100r/min的条件下发酵40h～48h，每隔4h取样测定其酒度和残糖。重复试验三批次。
4、发酵结果：结果如表4所示，发酵时间为40h时平均酒精浓度就可达到15.0％(v/v)，残还原糖0.55％，残总糖1.20％。
表4.酵母菌CGMCC№.3476在500L发酵罐3批次的发酵结果
Figure G2010100456213D00071
附图2是500L发酵罐的发酵曲线图，由图中看出，当发酵时间为40h，就可达到15％左右的酒度，残还原糖下降不明显，发酵即可以结束。
本发明技术方案中有关酒精含量、残还原糖及残总糖的测定方法如下：
1、酒精含量的测定
取1.5ml发酵醪液，12,000r/min离心10min，取上清与10％乙腈1∶1(v/v)混合，气相色谱法测定酒精含量。
2、还原糖、残总糖的测定
还原糖测定：取1ml发酵结束的醪液离心，取上清50μl，加入450μl蒸馏水，375μlDNS，混匀，沸水浴5min，立即冷却，可见分光光度法测定OD540。空白用蒸馏水代替发酵醪液，其他条件不变。
残总糖测定：先用20％盐酸10ml彻底酸解发酵醪液，再按还原糖测定法测定。

Claims (4)

1.一种能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌，其分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为Y09tj，已于2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.3476。
2.酿酒酵母菌CGMCC NO.3476的选育方法，其特征是从常见的农家自酿甜酒中分离并经紫外诱变筛选得到，
(1)培养基
YPD液体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自来水定容至1000ml；
YPD固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，自来水定容至1000ml；
种子培养基：同前述YPD液体培养基；
上述培养基经高温121℃灭菌20min；
发酵培养基：30％-40％的淀粉，加自来水定容至100ml，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，再添加尿素0.1g；
(2)出发菌株分离筛选
菌种初筛：取5g甜酒样品加入装有100ml无菌生理盐水的小三角瓶中，置37℃摇床振荡培养2h，静置5min，取上清液做浓度梯度稀释至10-6倍，取200μl稀释液涂布于YPD平板，37℃倒置培养2d，挑取较大的酵母单菌落转接于10ml含10％葡萄糖的YPD液体培养基，置37℃，160r/min摇床培养，观察产泡沫的速度和量，闻发酵液中酒精浓度，初步筛选产酒精快而多的菌株，经YPD平板分离划线法得到纯种，取一环活化好的菌种接于5ml液体YPD培养基，37℃，160r/min摇床培养16h得初筛菌种种子液；
菌种复筛：30g的淀粉按1∶2.2(w/v)的料水比调好淀粉浆液，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，淀粉糊液冷却至37℃，加入终浓度为0.1％的尿素，分别接入初筛菌种种子液，接种量为5％，置37℃，160r/min摇床发酵3d，定时取样测酒度和残糖，选出生长发酵速度快，产酒率高，残总糖和残还原糖低的菌株，以此菌株作为出发菌株；
(3)紫外线诱变育种
酵母菌原生质体制备：从活化好的菌种斜面上分别取一环接种于100ml液体培养基上，于30℃，200r/min摇床培养12～16h，收集对数生长期细胞，各取5ml加入离心管中3500r/min，离心5min，用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗2次，30℃静置10min，离心弃去上清液，加入含有纤维素酶和蜗牛酶的PB破壁溶液，于30℃水浴处理处理30min，2000r/min，离心10min，用含0.1mol/L磷酸缓冲液、0.7mol/L KCl、pH6.0的高渗PB缓冲液洗涤2次，离心收集原生质体；
酵母菌原生质体诱变：取10ml原生质体液置于带转子的9cm的平皿中，在15W紫外灯下距30cm磁力搅拌照射15-20s后，取0.2ml涂在含5％NaCl的YPD固体培养基高渗平板，30℃恒温避光培养3d；
平板初筛：将紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分别放置在37℃、40℃进行培养，选出生长快且菌落大的耐高温菌株，将选出的耐高温菌株的以同样的方法制备原生质体，以同样的方法经紫外线照射，菌液涂布在含8％～15％酒精浓度的YPD平板，于37℃培养，选出生长快且菌落大的耐高温、耐高酒精菌株，再利用含0.1％TTC的YPD固体培养基平板筛选出产酒精能力强的突变菌株；
发酵复筛：利用平板初筛获得的菌株用发酵培养基进行发酵筛选，用显微镜观察菌体的活菌数和出芽率，筛选出产酒性能最优的酵母菌。
3.利用酿酒酵母菌CGMCC NO.3476发酵淀粉生产酒精的应用。
4.利用酿酒酵母菌CGMCC NO.3476高温快速浓醪发酵淀粉生产燃料酒精的方法，步骤如下：
1)种子液准备
接种酿酒酵母菌CGMCC NO.3476于YPD液体培养基中，37℃摇床培养过夜，使OD600约为10左右，得种子液；
2)浓醪液准备
基于容器的容积，称取重量体积比30％～40％的淀粉置于容器中，加水搅拌均匀，按20u/g淀粉加入液化酶，水浴加热使液化温度为85-90℃，液化时间1h，使DE值为15％-20％，得浓醪液；
3)接种发酵
浓醪液降温至37℃，按100u/g淀粉加入糖化酶，添加0.1％(m/v)的尿素，以5％接种量接入种子液，置于37℃摇床进行同步糖化发酵，转速100r/m，发酵时间46h，即可得酒精。
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