CN111334446B - 一株耐高温糖化酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一株耐高温糖化酵母菌株及其应用。本发明所述耐高温糖化酵母菌COTYT‑H其保藏编号为CGMCC No.16829。本发明所述耐高温糖化酵母菌株COTYT‑H在工业乙醇高温发酵下既能产糖化酶又具有良好发酵性能，能减少糖化酶的使用量，降低能耗，节约生产成本，提高原料利用率，适合于工业乙醇的大规模生产。

Description

一株耐高温糖化酵母菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及耐高温糖化酵母菌及其应用，尤其是涉及耐高温糖化酵母菌及其在发酵生产工业乙醇中的应用和生产工业乙醇的方法。

背景技术

在生物乙醇生产工业上主要以富含淀粉的小麦和玉米为原料，也因其来源广泛、成本低廉，是一种很有潜力的生物资源。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇发酵工业的重要微生物，但它不能直接利用淀粉生产乙醇，因此工业发酵一直利用糖化酶来分解利用淀粉。目前工业酒精生产中广泛应用的糖化酶主要来源黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、得氏根霉(Rhizopus niveus)和臭曲霉(Aspergillus foetides)等。

利用淀粉来生产乙醇的方法有：(1)在同一发酵液中共同养殖能水解淀粉和能发酵酒精的两种或以上微生物，以满足在发酵液中即能及时水解淀粉又能发酵生产酒精；(2)使用含淀粉酶类菌株先对淀粉水解后再利用酵母菌发醇生产酒精；(3)先用葡萄糖淀粉酶水解发酵液中淀粉，再进行酵母的酒精发酵。上述三种方式在工业酒精发酵中均有应用。但是上述三种方式都很难使工业酒精发酵条件优化。共同培养糖化菌和发酵菌中大部分淀粉会被用于菌体自身生长繁殖，从而降低酒精产率。若先利用微生物或酶制剂糖化淀粉则增加了生产的成本。如若能获得既能产糖化酶又具有良好发酵性能的酿酒酵母应用于乙醇发酵工业，不仅能减少糖化酶的使用量或完全删除糖化工艺(糖化与发酵合二为一)，又能降低能耗，简化工艺节约生产成本，提高原料利用率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题提供耐高温糖化酵母菌株。

为实现本发明的目的本发明采用了如下技术方案。

本发明经过数据库分析比对确定目标糖化酶基因，密码子优化后设计引物扩增目标糖化酶基因序列酶切后连接至表达载体构建糖化酶表达盒，整合至毕赤酵母基因组中构建毕赤酵母表达体系，验证扩增获得的糖化酶基因在酵母体系外源表达后糖化酶活性。进一步构建糖化酶在酿酒酵母中的表达盒转化耐高温酿酒酵母进行酿酒酵母基因组整合表达，进行平板筛选及酶活检测后获得耐高温糖化酵母。

本发明目标糖化酶基因为来源Saccharomycopsis fibuligera的糖化酶基因序列(Accession 19032257)。采用golden gate assembly的方法构建糖化酶在酿酒酵母中的表达盒，具体为选用酿酒酵母强启动子和a-factor信号肽构建糖化酶表达盒，采用OE PCR扩增获得带有信号肽的糖化酶片段，随后采用golden gate assembly的方法构建完成糖化酶表达盒，经测序验证表达盒无误后，进一步用Q5高保证酶扩增糖化酶表达盒，采用OE PCR连接抗性基因表达盒，选取酿酒酵母基因组多拷贝的rDNA为糖化酶基因的整合位点，采用Q5一步扩增获得组装完成的基因组整合大片段。

进一步的，本发明构建糖化酶在酿酒酵母中的表达盒后转化耐高温酿酒酵母进行酿酒酵母基因组整合表达。其中所述耐高温酿酒酵母为前期诱变筛选到的耐高温酿酒酵母S.C HR，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16831。

进一步，本发明将在耐高温酿酒酵母中表达的菌进行平板筛选及酶活检测。具体为挑取在耐高温酿酒酵母中表达的单克隆转板至YPS(含有可溶性淀粉)平板进行糖化酶活性粗筛，筛选获得的糖化酶活性高的耐高温糖化酵母菌菌株COTYT-H。

本发明所述耐高温糖化酵母菌菌株COTYT-H已于2018年11月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16829。

在一些实施方案中，本发明采用工业乙醇液化醪验证本发明所述耐高温糖化酵母菌菌株发酵效果。实验表明本发明所述耐高温糖化酵母菌菌株COTYT-H 50％糖化酶加量发酵成熟醪酒份高于出发菌株S.C HR 100％糖化酶加量，且残糖含量和甘油含量优于于S.CHR。

在一些实施方案中，本发明采用工业乙醇液化醪验证在发酵过程温度调整，0～16h温度32℃、17h温度调至33℃、18h温度调至34℃、19h至发酵结束温度35～37℃。实验表明本发明所述耐高温糖化酵母菌菌株COTYT-H在高温且50％糖化酶加量的发酵条件下发酵各项指标均达到目前工业生产使用商业酿酒酵母菌株正常控温和100％糖化酶加量条件下的指标要求。

因此，本发明所述耐高温糖化酵母菌菌株COTYT-H在高温发酵条件下既能产糖化酶又具有良好发酵性能的，能减少糖化酶的使用量，降低能耗，节约生产成本，提高原料利用率，适合于工业乙醇的大规模生产。因此本发明提供了保藏编号分别为CGMCC No.16829的酿酒酵母菌在发酵生产工业乙醇中的应用。

其中，所述发酵底物为富含淀粉的原料。

本发明还提供了一种生产工业乙醇的方法，发酵保藏编号为CGMCC No.16829的耐高温糖化酵母菌获得工业乙醇，作为优先，本发明将保藏编号为CGMCC No.16829的耐高温糖化酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵，发酵期间添加蛋白酶和青霉素。。

其中，本发明所述生产工业乙醇的方法中，所述发酵的底物为富含淀粉的原料的液化醪，所述蛋白酶添加量为0.14Kg/T～0.20Kg/T干基，所述青霉素添加量为5.0ppm～10.0ppm。。

作为优选，本发明所述生产工业乙醇的方法中，所述发酵温度前16h控温30℃-32.5℃，16h后控温＜37℃。

作为优选，本发明所述发酵时间为66-78小时。

作为优先，本发明所述耐高温酿酒酵母按扩繁后的培养物酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v％。

在一些实施方案中，本发明所述生产工业乙醇的方法中，在发酵前还包括所述耐高温糖化酵母菌经过种子培养基扩大培养的步骤，以达到一定的酵母数利于后续接种发酵底物发酵生产乙醇。扩培种子培养基为YPD液体培养基，pH值为7.0-7.2。

由上述技术方案可知，本发明提供了耐高温糖化酵母菌株及其应用。本发明所述耐高温糖化酵母菌COTYT-H其保藏编号为CGMCC No.16829。本发明所述耐高温糖化酵母菌株COTYT-H在工业乙醇高温发酵下既能产糖化酶又具有良好发酵性能的，能减少糖化酶的使用量，降低能耗，节约生产成本，提高原料利用率，适合于工业乙醇的大规模生产。

生物保藏说明

菌株COTYT-H：分类命名：酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，于2018年11月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16829。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1糖化酶基因扩增结果电泳图；

图2示实施例1糖化酶酿酒酵母表达盒构建示意图；

图3示实施例1糖化酶表达盒扩增结果电泳图；

图4示实施例1糖化酶表达盒、抗性标签表达盒及同源臂大片段扩增电泳图。

具体实施方式

本发明公开了耐高温糖化酵母菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中实验中用于糖化酶表达的耐高温酿酒酵母为前期诱变筛选到的酿酒酵母S.C HR，用于质粒构建、基因克隆实验的克隆宿主大肠杆菌(E.coli)DH5a购于北京全式金生物技术有限公司，糖化酶表达盒的构建采用Golden Gate Assembly的方式进行组装，中间构建质粒均为本单位前期通过基因工程构建的工具质粒。

本发明实施例中所涉及的主要溶液如下：

(1)YPD培养基用于酿酒酵母的活化、培养及菌种保存，含有1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、15％琼脂(配制固体培养基)，121℃条件下灭菌20min。

(2)YPS培养基用于构建后糖化酵母的筛选，含有1％酵母提取物，2％蛋白胨、2％可溶性淀粉、15％琼脂(配制固体培养基)，121℃条件下灭菌20min。

(3)2YT培养基用于大肠杆菌的活化、培养及菌种保存，含有1％酵母提取物、1.6％蛋白胨、0.5％NaCl、15％琼脂(配制固体培养基)，121℃条件下灭菌20min。

(3)50％甘油溶液用于菌种的保藏，量取50mL的甘油，用去离子水定容至100mL，121℃条件下灭菌20min，4℃保存待用。

(4)50×TAE溶液用于琼脂糖凝胶电泳分析，称取242g的Tris和37.2g的Na₂EDTA·2H₂O，充分溶解后加入57.1mL的醋酸，去离子水定容至1L，室温保存待用。

(5)1M山梨醇：称取18.217g山梨醇，加入约80mL的去离子水，充分溶解后定容至100mL，121℃条件下灭菌20min，4℃保存待用。

实施例1、耐高温糖化酵母构建

1、目标糖化酶基因发掘

糖化酶亦称葡萄糖淀粉酶、α-1,4-葡萄糖水解酶(glucoamylase)，从淀粉非还原性未端水解a-1,4-葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖，该酶的催化特异性不严格，因此该酶广泛用于目前淀粉制糖和淀粉制乙醇的糖化工艺。通过对brenda-enzymes、PDB、NCBI数据库进行搜索比对同时参照相关文献，获得来源多个微生物的糖化酶基因，通过序列比对分析，选中来源Saccharomycopsis fibuligera糖化酶(Accession 19032257)，氨基酸序列如下：

MIRLTVFLTAVFAAVASCVPVELDKRNTGHFQAYSGYTVARSNFTQWIHEQPAVSWYYLLQNIDYPEGQFKSAKPGVVVASPSTSEPDYFYQWTRDTAITFLSLIAEVEDHSFSNTTLAKVVEYYISNTYTLQRVSNPSGNFDSPNHDGLGEPKFNVDDTAYTASWGRPQNDGPALRAYAISRYLNAVAKHNNGKLLLAGQNGIPYSSASDIYWKIIKPDLQHVSTHWSTSGFDLWEENQGTHFFTALVQLKALSYGIPLSKTYNDPGFTSWLEKQKDALNSYINSSGFVNSGKKHIVESPQLSSRGGLDSATYIAALITHDIGDDDTYTPFNVDNSYVLNSLYYLLVDNKNRYKINGNYKAGAAVGRYPEDVYNGVGTSEGNPWQLATAYAGQTFYTLAYNSLKNKKNLVIEKLNYDLYNSFIADLSKIDSSYASKDSLTLTYGSDNYKNVIKSLLQFGDSFLKVLLDHIDDNGQLTEEINRYTGFQAGAVSLTWSSGSLLSANRARNKLIELL

核酸序列如下:

atgaatacaggtcattttcaagcatattcaggttatacagttgctcggtccaattttacacagtggattcatgaacaaccagcagtttcttggtattatttgttacaaaatattgattatcctgaaggtcaattcaaatctgctaaacctggtgttgttgttgcttcaccatctacttcagaaccagattatttttatcagtggactagggatactgctattacatttttgtctttgattgctgaagttgaagatcattctttttctaatactactttggctaaagttgttgaatattatatttcaaatacatatactttacaaagagtttcaaatccatcaggtaattttgattctcctaatcatgatggtttgggtgaacctaagtttaatgttgatgatacagcttatacagcatcatggggtaggccacaaaatgatggtccagctttaagggcatacgctatttctaggtatttgaatgcagttgctaaacataacaacggtaaattgttgttagctggtcaaaatggtattccttattcatctgcttcagacatatattggaaaattattaaaccggatctacaacatgtttctacacattggtctacatcaggttttgatttgtgggaagaaaatcaaggtactcacttctttactgcattagttcaattgaaggccttgtcttatggtattccattgtctaaaacttataatgatccaggttttacttcttggttagaaaaacaaaaagatgcactcaactcttatattaattcttcaggttttgttaattctggaaagaaacatattgttgaatctcctcaattgtcatctaggggtggtttggattctgcaacttatattgcagctttgattacacatgatattggcgatgatgatacatatactccctttaatgttgataattcctatgttctaaattcattgtattatttgttagttgataataagaataggtacaagattaatggtaattacaaggctggtgccgcagttggtagatacccagaagatgtttataatggtgttggtacatcagaaggtaatccttggcaattagcaacagcctacgcaggtcaaacattttatactttagcatataattctttgaaaaacaaaaagaacttggttattgaaaaattgaattatgatttgtataattcttttattgctgatttgtctaaaattgattctagttacgcatctaaagattctttaactttaacttatggttcagataattacaaaaatgttattaaatctttgttgcaatttggggattcatttttgaaagttttgttagatcatattgatgataatggtcaattaacagaagaaattaataggtatactggttttcaagcaggtgcagtttctttaacttggtcatcaggttcattgttatctgcaaatagagcaaggaataagttgattgaattgttgtaa

送往上海生工生物工程有限公司进行全基因合成并进行参照酿酒酵母偏爱的密码子进行优化，根据密码子优化后的基因序列信息设计扩增引物GA-F1和GA-SP-R1，并以全基因合成的糖化酶基因质粒为模板扩增糖化酶基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图1。其中扩增引物为：

GA-F1：AACACTGGACATTTCCAAGC

GA-SP-R1：TCAAAGAAGTTCAATCAATTTGTT

结果显示，扩增获得约1400bp特异性条带，与糖化酶基因理论值大小一致。

2、耐高温糖化酵母的构建及酶活检测

构建糖化酶在酿酒酵母中的表达盒，其示意图如图2。

选用酿酒酵母强启动子和a-factor信号肽(引导糖化酶分泌胞外表达)构建糖化酶表达盒，采用OE PCR扩增获得带有信号肽的糖化酶片段，随后采用golden gateassembly的方法构建完成糖化酶表达盒，扩增结果如图3。

经测序验证表达盒无误后，进一步用Q5高保证酶扩增糖化酶表达盒，采用OE PCR连接抗性基因表达盒，选取酿酒酵母基因组多拷贝的rDNA为糖化酶基因的整合位点，采用Q5一步扩增获得组装完成的基因组整合大片段，电泳结果如图4。

前期诱变筛选到的耐高温酿酒酵母S.C HR为糖化酶的表达宿主，YPD培养并制备工业酿酒酵母的电转感受态细胞，将纯化后的约1μg的大片段转化酿酒酵母S.C HR感受态细胞，30℃在相应抗性平板上培养3天后，挑取生长出来的单克隆转板至YPS(含有可溶性淀粉)平板进行糖化酶活性粗筛，整合糖化酶的基因工程菌在YPS(含有可溶性淀粉)平板上可见明显的淀粉水解圈。

进而挑取具有水解圈的转化子，进行摇瓶培养3天后，对其培养集中的糖化酶采用DNS方法进行酶活检测，结果见表1。

表1糖化酵母酶活检测结果

样品	糖化酶活性(葡萄糖/h*OD)
		S.C HR	0.157
COTYT-H	12.022
		COTYT-M	6.301
COTYT-L	1.672

结果可见，整合耐高温酿酒酵母S.C HR基因组后获得了不同酶活水平的糖化酶酿酒酵母COTYT-H、COTYT-M和COTYT-L，其中COTYT-H酶活较高，COTYT-M次之，COTYT-L酶活最低。

实施例2、耐高温糖化酵母减糖化酶发酵效果评价

工艺条件：工业乙醇液化醪底物，S.C HR、COTYT-H、COTYT-M、COTYT-L分别接种YPD摇瓶(500ml)，经过培养达到一定的酵母数，按0.125亿/ml液化醪折算用量，离心、水洗一次，用生理盐水悬浮至2.5ml，洗净后分别接种至加量0.9kg/t粮(添加比例100％)和0.45kg/t粮(添加比例50％)外源糖化酶的350g液化醪中，发酵温度32℃，发酵72小时。工业乙醇液化醪底物液化检测数据见表2，各组发酵72h化学滴定法检测数据见表3，各组发酵72h HPLC数据见表4。

表2工业乙醇液化醪液化检测数据：

表3各组发酵72h化学滴定法检测数据：

表4各组发酵72h的HPLC数据：

通过上述数据看出，在本次实验中：

相同糖化酶加量条件下，三种糖化酶酿酒酵母COTY-H、COTY-G和COTY-L发酵成熟醪酒份均高于出发菌株S.C HR，其中COTYT-H酒份最高，残糖含量最低；

50％糖化酶加量实验组，甘油含量均低于对应的100％糖化酶加量实验组；

50％糖化酶加量实验组(除COTYT-H因素外)，酒份含量均低于对应的100％糖化酶加量实验组；

COTYT-H 50％糖化酶加量实验组成熟醪酒份高于COTYT-H 100％糖化酶加量实验组，分析原因可能是由于COTYT-H酵母属于糖化酶基因高表达型酵母，配合100％糖化酶加量，造成发酵前期醪液内葡萄糖浓度过高，抑制了酵母生长。

实施例3、耐高温糖化酵母高温减糖化酶发酵效果评价

工艺条件：工业乙醇液化醪为底物，发酵72小时，目前工业生产使用商业酿酒酵母菌株(商业酵母)、COTYT-H、COTYT-M、COTYT-L分别接种YPD摇瓶(500ml)，经过培养达到一定的酵母数，按0.125亿/ml液化醪折算用量，离心、水洗一次，用生理盐水悬浮至2.5ml，加入350g液化醪中。

该批次实验中加入发酵过程温度调整，商业酵母一试验组(100％糖化酶加量)温度32℃至发酵结束期间温度不调整，商业酵母、COTYT-H、COTYT-M、COTYT-L(100％和50％糖化酶加量)分别对温度进行调整，调整方案：0～16h温度32℃、17h温度调至33℃、18h温度调至34℃、19h至发酵结束温度35℃。工业乙醇液化醪底物液化检测数据见表5，各组发酵72h化学滴定法检测数据见表6，各组发酵72h HPLC数据见表7。

表5工业乙醇液化醪液化检测数据：

表6各组发酵72h化学滴定法检测数据：

表7各组发酵72h的HPLC数据：

通过数据看出，在本次实验中：

通过对比HPLC中DP4+数据，可以看出，温度调整试验组四种酵母菌种50％糖化酶加量试验组均高于100％糖化酶加量试验组；

100％糖化酶加量条件下，三种耐高温糖化酶酿酒酵母COTYT-H、COTYT-G和COTYT-L发酵成熟醪酒份均高于商业酵母调温组和不调温组，其中COTYT-H试验组最高，COTYT-M和COTYT-L试验组残糖含量最低；

50％糖化酶加量条件下，COTYT-H发酵成熟醪酒份最高且残糖最低，COTYT-L试验组酒份低于安琪超酒酵母试验组；

COTYT-H在温度调整情况下，糖化酶加量高和加量低的试验组发酵效果均优于商业酵母无温度调整试验组；

50％糖化酶加量实验组，甘油含量均略低于其对应的100％糖化酶加量实验组；

在进行温度调整后，COTYT-H菌种在糖化酶100％和50％加量情况下其发酵效果均表现出明显优势。

Claims (5)

1.耐高温糖化酵母菌（Saccharomycescerevisiae ） COTYT-H，其保藏编号为CGMCCNo. 16829。

2.权利要求1所述的耐高温糖化酵母菌在发酵生产工业乙醇中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述发酵底物为富含淀粉的原料。

4.一种生产工业乙醇的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No. 16829的耐高温糖化酵母接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物接种发酵培养基发酵，发酵期间添加蛋白酶和青霉素；

所述发酵的底物为富含淀粉的原料的液化醪，所述蛋白酶添加量为0.14 Kg/T~0.20Kg/T干基，所述青霉素添加量为5.0 ppm~10.0 ppm；

所述发酵温度前16 h控温30℃-32.5℃，16 h后控温＜37℃；

所述发酵时间为66-78小时；

按扩繁后的培养物酿酒酵母浓度为0.125亿/ml计算，所述扩繁后的培养物接种量为16v/v%。

5.根据权利要求4所述的方法，所述种子培养基YPD液体培养基，pH值为7.0-7.2。

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