CN102851266A - 一株耐热α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明涉及一种来源于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌的α-淀粉酶编码基因，其基因序列为序列表中的SEQ NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达产生的重组α-淀粉酶，其氨基酸序列为序列表中的SEQ NO.1。利用本发明获得的α-淀粉酶编码基因构建重组微生物，可实现α-淀粉酶的高效率生产，具有很好的工业应用前景。

Description

一株耐热α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法

技术领域

本发明涉及一株α-淀粉酶基因工程菌及其构建方法，属于酶工程和基因工程领域。 

背景技术

淀粉酶是能够降解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照水解方式的不同，主要分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。 

淀粉作为原料在工业中的应用，其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖或者寡糖糖浆。这些糖浆随后被用作原料用于如酒精、有机酸、氨基酸等工业生产或直接作为产品用于其他工业领域。目前工业上用淀粉制糖主要采用酶水解的方法。酶法制糖工艺一般采用两步法，第一步用α-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精，第二步用糖化酶将糊精水解成葡萄糖。α-淀粉酶的作用特点是在淀粉分子链中间将α-1,4糖苷键切断。 

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供了一种耐热α-淀粉酶，其氨基酸序列如1)、或2）或3）所示： 

1)其氨基酸序列如SEQ NO.1所示； 

2).在1)所限定的氨基酸序列的基础上经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺少或添加，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列； 

3).与1)、或2）所限定的氨基酸序列具有90%同源性的，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列。 

所述的α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。 

本发明所解决的另一个技术问题是提供了一株表达α-淀粉酶的基因工程菌。本发明所解决的另一个技术问题是提供了一种α-淀粉酶基因工程菌的构建方法包括如下步骤： 

1)化学合成α-淀粉酶基因； 

2).将α-淀粉酶基因克隆到重组表达载体； 

3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。 

所述的重组表达质粒载体为为pUC系列，pET系列pT7-7，或pGEX中的任意一种，其中优选重组表达质粒载体为pET-20b。 

所述的宿主细胞包括：细菌，酵母及真菌，也是本发明所要保护的范围。 

所述的细菌主要是大肠杆菌包括：E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coliJM109(DE3)、E.coli DH5α中任意一种。 

本发明所解决的另一个技术问题是提供一种α-淀粉酶的基因工程菌的发酵生产方法，37℃，220rpm，摇瓶发酵48小时后，重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL。 

利用本发明获得的α-淀粉酶具有良好的稳定性，在95℃下保温4h后还有70%的酶活，编码基因构建重组微生物，可实现α-淀粉酶的高效率生产，摇瓶发酵48小时后，重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL，具有很好的工业应用前景。 

附图说明

图1重组α-淀粉酶摇瓶发酵产酶曲线。 

图2重组α-淀粉酶蛋白SDS-PAGE图。 

1、发酵液上清；2、破壁上清；3、包涵体；M、标准蛋白分子量。 

图3重组α-淀粉酶分批补料发酵产酶曲线。 

图4重组α-淀粉酶温度稳定性曲线。 

具体实施方式

实施例1：基因工程菌的构建 

1、将合成的α-淀粉酶基因片段克隆到pUC57载体上。 

2、用于构建大肠杆菌的质粒是pET-20b，带有T7启动子。将pET-20b质粒和带有目的基因片段的pUC57分别进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有30μg/mL卡那霉素的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到的重组表达质粒。 

3、将重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素（30μg/mL）的LB平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，获得基因工程菌。 

实施例2：含α-淀粉酶基因工程菌的摇瓶发酵 

将所述的基因工程菌在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB（甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L）发酵液体培养基中，摇床培养，转速200rpm，37℃恒温发酵48小时后，离心菌体，收集上清液测定酶活力，重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL。重组α-淀粉酶产酶曲线见图1，SDS-PAGE电泳图见图2。 

实施例3：含α-淀粉酶基因工程菌的分批补料发酵 

将所述的基因工程菌在工业级LB培养基中37℃培养8小时后，按10%接种量接入NBS(New Brunswick Scientific)3L全自动发酵罐，发酵罐初始装入1.1L工业级复合培养基(甘油8g/L，KH₂PO₄13.5g/L，（NH₄）₂HPO₄4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄0.68g/L，工业级蛋白胨1g/L，工业级酵母粉2gL，pH7.1)，32℃恒温发酵，维持溶氧在30%左右，利用氨水控制pH7.0左右。初始阶段培养基中甘油耗尽后，溶氧快速上升，开始指数流加补料液，控制比生长速率μ＝0.2h^-1。当菌浓OD₆₀₀达到15时，一次性添加终浓度为1%(质量体积分数)甘氨酸。当菌浓OD₆₀₀达到50时，恒速添流加0.1g/L/h的乳糖进行诱导，整个发酵过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。发酵过程中，菌浓OD₆₀₀最高可达160，重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到1.1万U/mL，重组α-淀粉酶分批补料发酵产酶曲线如图3所示。 

实施例4：重组α-淀粉酶在高温下的稳定性 

将重组α-淀粉酶用pH6.0的糊精溶液稀释10倍，再加入终浓度为10mM的钙离子，将该体系置于95℃恒温水浴锅中保温，定时取样测酶活力(具体实验方法参见GB8275-2009)。结果表明该重组酶具有良好的稳定性，在95℃下保温4h后还有70%的酶活，温度稳定性曲线如图4所示。 

Claims (9)

1.一种耐热α-淀粉酶，其特征在其氨基酸序列如1)或2）或3）所示：

1)其氨基酸序列如SEQ NO.1所示；

2).在1)所限定的氨基酸序列基础上经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺少或添加，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列；

3).与1)、或2）所限定的氨基酸序列具有90%同源性的，且具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述α-淀粉酶的核苷酸序列，其特征在于如SEQ NO.2所示。

3.含有权利要求1所述α-淀粉酶的基因工程菌。

4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)化学合成α-淀粉酶基因；

2).将α-淀粉酶基因克隆到重组表达载体；

3).将重组表达载体转化到宿主细胞中。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于所述的重组表达质粒载体为为pUC系列，pET系列pT7-7，或pGEX中的任意一种。

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于所述重组表达质粒载体为pET-20b。

7.根据权利要求4或5所述构建方法，其特征在于所述的宿主细胞包括：细菌，酵母及真菌。

8.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于所述细菌是大肠杆菌包括：E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)、E.coli DH5α中任意一种。

9.权利要求3所述α-淀粉酶的基因工程菌的发酵生产方法，其特征在于37℃，220rpm，摇瓶发酵48小时后，重组α-淀粉酶摇瓶发酵活力达到742U/mL。

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