CN105349515A - 一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用,属于酶工程领域。本发明通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变,得到了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体,并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬酰胺酶相比,本发明的突变体的胞外分泌能力提高了3.14倍。本发明构建的重组菌,发酵生产天冬酰胺酶酶活达到407.6U/mL,生产率达到9.26U/(mL/h),为目前报道的最高的产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用,属于酶工程领域。
背景技术
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶,能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用,尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物,对骨髓细胞没有抑制作用。
L-天冬酰胺酶有两种类型,L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II,Escherichiacoli、Erwiniachrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶,研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用,来自Escherichiacoli和ErwiniachrysanthemiL-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物,目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成,在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺,从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低,且提取工艺复杂,微生物具有易培养,成本低等优点,成学者研究的重点,目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichiacoli、Erwiniacarotovora、Erwiniachrysanthemi等,但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低,近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中,获得L-天冬酰胺酶的高效表达,利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。
如何在食品安全菌株中表达L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力,是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述问题,以高效分泌信号肽菌株为基础,通过构建p43强启动子菌株,实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达,通过缺失N端残基,进一步提高天冬酰胺酶的表达强度,实现天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达,得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
本发明的第一个目的是一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体,所述突变体的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。
所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。
本研究中的突变体为使用了WapA外源信号肽的天冬酰胺酶的基础上做的改造,也就是在天然的(NCBI上公布的NC-000964.3)天冬酰胺酶的基础上先替换了信号肽,然后再次基础上对天冬酰胺酶N端进行的缺失。
本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌,所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK质粒为载体,表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为宿主构建的。
在本发明的一种实施方式中,所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因的氨基酸序列是SEQIDNO.1。
在本发明的一种实施方式中,所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因的核苷酸序列是SEQIDNO.2。
在本发明的一种实施方式中,所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因是连接到pP43NMK质粒的KpnI,PstI酶切位点,然后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。
本发明的第三个目的是提供一种发酵生产天冬酰胺酶的方法,是以所述重组枯草芽孢杆菌为生产菌株,将种子液按照4%的接种量转接于发酵培养基中,37℃发酵培养。
在本发明的一种实施方式中,所述方法通过补加酸碱控制pH为7.0,并控制发酵液溶氧高于20%,发酵过程中补加蔗糖和蛋白胨进行高密度发酵。
本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列、表达所述突变体的基因工程菌。
本发明还要求保护所述天冬酰胺酶突变体、所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物方面的应用。
本发明的有益效果:
本发明通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变,得到了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体,并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬酰胺酶相比,本发明的突变体的胞外分泌能力提高了3.14倍。本发明构建的重组菌,发酵生产天冬酰胺酶酶活达到407.6U/mL,生产率达到9.26U/(mL/h),为目前报道的最高的产量。其产量是含有野生型信号肽的枯草芽孢杆菌的4.5倍(Cloning,expression,andcharacterizationofL-asparaginasefromanewlyisolatedBacillussubtilisB11-06)、重组大肠杆菌的8.71倍(201510102732.6)。
附图说明
图1:突变株发酵酶活;
图2:SDS-PAGE分析;
图3:补料分批发酵法WB43H-D30生产L-ASP。
具体实施方式
培养基:
LB培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L,pH7.0;
发酵培养基:大豆蛋白胨10g/L,玉米浆5g/L,尿素1g/L,蔗糖35g/L,磷酸氢二钾2.3g/L,磷酸二氢钾1.7g/L,硫酸镁0.75g/L,氯化钠5g/L;调节pH6.8-7.0。
天冬酰胺酶酶活力的测定:
采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为:酶活定义:在37℃反应条件下,每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmolNH3所需要的酶量为一个酶活单位(U/ml)。酶活测定条件:37℃条件下,1ml10mMK2HPO4-KH2PO4(PH7.5),0.1ml189mM天冬酰胺,0.1ml发酵上清液,保温30分钟,0.5ml1.5MTCA终止反应。利用ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值,通过硫酸铵绘制标准曲线,根据标准曲线计算酶活。
实施例1:强启动子高效表达菌株的构建
设计L-ASP的上下游引物P1、P2(如表1所示),以前期构建的pMA0911-wapA-SP-ansZ为模板,通过PCR的方式扩增含有WapA信号肽的L-ASP基因。PCR条件为:98℃3min,98℃30S,55℃90S、72℃90S,34个循环。PCR扩增体系:模板1μL,上下游引物各1μL,dNTPMix4μL,5×primeSTARBuffer10μL,灭菌的双蒸水32.5μL,primeSTARDNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度。KpnI,PstI酶切胶回收产物(目的基因L-ASP)及pP43NMK质粒(表达载体),柱回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收,胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收,电泳检验回收产物的浓度。目的基因L-ASP与载体pP43NMK连接,连接体系:目的基因4μL,载体pP43NMK1μL,solutionI5μL,16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pP43H转化到感受态E.coilJM109,用氨苄青霉素LB平板,挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒,命名为pP43H,酶切验证正确后,转化子由上海生工进行测序。相应的,将测序重组质粒pP43H再转入枯草芽孢杆菌WB600,以获得WB43H。
表1引物
实施例2:N端缺失菌株构建
设计的上下游引物P3、P4(如表1所示),以pP43H质粒为模版进行PCR,构建N端缺失菌株。PCR条件为:98℃3min,98℃30S,55℃90S、72℃90S,34个循环。PCR扩增体系:模板1μL,上下游引物各1μL,dNTPMix4μL,5×primeSTARBuffer10μL,灭菌的双蒸水32.5μL,primeSTARDNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度。磷酸化处理PCR回收产物,并加入连接酶,16℃过夜连接。将连接好的重组质粒D30转化到感受态E.coilJM109,用氨苄青霉素LB平板,挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒,命名为D30,酶切验证正确后,转化子由上海生工进行测序。相应的,将测序重组质粒D30再转入枯草芽孢杆菌WB600,以获得截短L-ASP基因N端25个残基的突变菌株WB43H-D30。
实施例3:高分泌能力天冬酰胺酶生产菌株的验证
将实施例1、2中构建的重组菌WB43H,WB43H-D30,与出发菌株pMA0911-wapA-SP-ansZ/B.subtilisWB600(ZL201310716775.4)分别接种于10mL含卡那霉素的LB养基中,37℃振荡培养过夜,次日按4%的接种量转接于枯草芽孢杆菌发酵培养基中,37℃培养24h,取发酵液于4℃,10000r/min离心10min,上清为胞外粗酶液,细胞破碎上清液为胞内粗酶液,用于酶活力的测定。枯草芽孢杆菌发酵培养基:大豆蛋白胨10g/L,玉米浆5g/L,尿素1g/L,蔗糖35g/L,磷酸氢二钾2.3g/L,磷酸二氢钾1.7g/L,硫酸镁0.75g/L,氯化钠5g/L;调节pH6.8-7.0。
对天冬酰胺酶活力进行测定,结果如图1所示。实验结果表明:与出发菌株比较,突变株WB43H的L-ASP的胞外酶活力提高了1.4倍,达到39.52U/ml,突变株WB43H的L-ASP的胞外酶活力提高了3.14倍,达到88.24U/ml。SDS-PAGE的结果进一步论证了在缺失N端25个残基能显著提高L-ASP的产量(图2)。
实施例4:补料分批发酵法生产L-ASP
将实施例2中构建的重组菌WB43H-D30进行3L罐发酵。上罐发酵初始培养基与摇瓶发酵培养基一致,接种量4%,通过补加酸碱控制pH为7.0,并通过关联发酵转速控制DO,使其高于20%。并补加蔗糖和蛋白胨进行高密度发酵。发酵结果如图3所示,在40h时OD600达到153。在44h时,天冬酰胺酶浓度达到407.6U/mL,生产率达到9.26U/(mL/h),为目前报道的最高的产量。其产量是含有野生型信号肽的枯草芽孢杆菌的4.5倍、重组大肠杆菌的8.71倍。这表明枯草芽孢杆菌是一个合适的宿主用于工业生产L-ASP。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体,其特征在于,所述突变体的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的突变体,其特征在于,所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
3.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
5.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK质粒为载体,表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因的氨基酸序列是SEQIDNO.1。
7.一种发酵生产天冬酰胺酶的方法,其特征在于,所述方法是以权利要求5或6的重组枯草芽孢杆菌为生产菌株,将种子液按照4%的接种量转接于发酵培养基中,37℃发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法通过补加酸碱控制pH为7.0,并控制发酵液溶氧高于20%,发酵过程中补加蔗糖和蛋白胨进行高密度发酵。
9.权利要求1所述天冬酰胺酶突变体在制备药物方面的应用。
10.权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物方面的应用。
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