CN103709236B - 一种可提高分泌效率的信号肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可提高分泌效率的信号肽，核苷酸序列如1）或2所示1）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2）对SEQ ID NO.1序列做出改造，但仍就行使信号肽功能且分泌效率未发生根本改变的核苷酸序列。本发明提供了一种可提高分泌效率的信号肽，使用后可显著提高菌株的分泌能力，本发明中可将天冬酰胺酶酶活提高了1.5倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种可提高分泌效率的信号肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种分泌能力提高的信号肽，特别是一种提高天冬酰胺酶活力的信号肽。
技术背景
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。
L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。
一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。
L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
本发明基于枯草芽孢杆菌来源天冬酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的平台，通过改造信号肽，实现的天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达，以期得到天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种可提高分泌效率的信号肽，核苷酸序列1）或2所示：
1）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1序列如下：
ATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA
2）对SEQ ID NO.1序列做出改造，但仍就行使信号肽功能且分泌效率未发生根本改变的核苷酸序列。
本研究通过融合信号肽，使天冬酰胺酶的分泌途径发生改变，转向SEC分泌方式，使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到进一步的提高。
本发明还提供一株天冬酰胺酶分泌能力增强的枯草芽孢杆菌。
先前的工作中，本研究团队已将枯草芽孢杆菌168来源的天冬酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中得到表达。基于枯草芽孢杆菌以构建好的平台，通过融合信号肽，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的新菌株；所述信号肽融合到需要表达基因的N端。
本发明所用到的培养基：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；
枯草芽孢杆菌发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钾2.3g/L，磷酸二氢钾1.7g/L，硫酸镁0.75g/L，氯化钠5g/L；调节pH6.8-7.0。
本发明中天冬酰胺酶酶活力的测定:
采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmol NH3所需要的酶量为一个酶活单位（U/ml）。酶活测定条件：37℃条件下，1ml10mM K2HPO4-KH2PO4（PH7.5），0.1ml189mM天冬酰胺，0.3ml发酵上清液，保温30分钟，0.1ml1.5M TCA终止反应。利用Shimadzu UV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
本发明提供了一种可提高分泌效率的信号肽，使用后可显著提高菌株的分泌能力，本发明中可将天冬酰胺酶酶活提高了1.5倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
附图说明
图1pMA0911-wapA-SP-ansZ质粒图谱
图2天冬酰胺酶生产菌株产酶鉴定
1：PMA5-ansZ/WB600
2：pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600
具体实施方式
实施例1一种新型信号肽
本发明提供的信号肽（WapA-SP）核苷酸序列如SEQ ID NO.1：ATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA所示或者是对SEQ ID NO.1序列做出改造，但仍就行使信号肽功能且分泌效率未发生根本改变的核苷酸序列。上述信号肽序列为化学全合成或者通过PCR方法获得。
将上述目的信号肽WapA-SP与克隆到载体pMA5，构建质粒pMA0911-wapA-SP，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。
本研究通过融合信号肽，使天冬酰胺酶的分泌途径发生改变，转向SEC分泌方式，能使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到进一步的提高。
实施例2天冬酰胺酶基因获取
根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物G19Sence和G19Antisence。通过PCR的方式，扩增缺失信号肽（N端19个氨基酸）的ansZ基因。
G19Sence:CCGGAATTCTGTTCACATTCTCCTGAAACAA（EcoR I）
G19Antisence:CGCGGATCCTCAATACTCATTGAAATAAGCTTG（BamH I）
以pET22b-ansZ（上海生工合成）为模版，利用上面提供的引物做PCR扩增进行,PCR条件：98℃预变性，3min，一个循环；98℃变性，30s，50℃退火，30s，72℃延伸，70s，34个循环；72℃，10min，一个循环；12℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix4μL，5×primeSTAR Buffer10μL，灭菌的双蒸水32.5μL，primeSTARDNA聚合酶0.5μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。EcoR I，BamH I酶切胶回收产物（目的基因ansZ）及pMA0911-wapA-SP质粒（表达载体），柱回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。
实施例3高效分泌天冬酰胺酶菌株构建
目的基因ansZ与载体pMA0911-wapA-SP连接，连接体系：目的基因4μL，载体pMA0911-wapA-SP1μL，solution I5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pMA0911-wapA-SP-ansZ转化到感受态E.coil JM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMA0911-wapA-SP-ansZ，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。
将测序正确的质粒，转化枯草芽孢杆菌WB600，获得产天冬酰胺酶基因工程菌。
实施例4高分泌能力天冬酰胺酶生产菌株的验证
将实施例2中构建的重组菌pMA0911-wapA-SP-ansZ/B.subtilisWB600，与出发菌株WB600PMA5-ansZ分别接种于10mL含卡那霉素的LB养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。枯草芽孢杆菌发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钾2.3g/L，磷酸二氢钾1.7g/L，硫酸镁0.75g/L，氯化钠5g/L。调节pH7.0。
对天冬酰胺酶活力进行测定，结果如图2所示。实验结果表明与出发菌株比较，pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600酶活力提高了1.5倍，最高达到8.42U/ml。

Claims (5)

1.一种可提高分泌效率的信号肽的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.应用权利要求1所述信号肽的核苷酸构建的表达效率提高的基因工程菌。
3.权利要求2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于将权利要求1)中所述信号肽的核苷酸融合到需要表达的基因上，使融合后的基因编码的蛋白的N端融合有相应信号肽。
4.权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌分泌天冬酰胺酶能力提高的基因工程菌。
5.权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌为枯草芽孢杆菌基因工程菌。
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