CN103060299A

CN103060299A - 活性提高的l-天冬酰胺酶变体

Info

Publication number: CN103060299A
Application number: CN2011103182506A
Authority: CN
Inventors: 沈林; 李鼎锋; 孙志丹; 陈星梅; 刘勇
Original assignee: BEIJING ABZYMO BIOSCIENCES Co Ltd
Current assignee: BEIJING ABZYMO BIOSCIENCES Co Ltd
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: WO2013056657A1; CN103060299B

Abstract

本发明涉及活性提高的L-天冬酰胺酶变体，其是如SEQ ID NO：3所示的大肠杆菌野生型L-天冬酰胺酶的变体，并且包含在对应于SEQ ID NO：3的第48、49、152和283位上具有一或多个氨基酸取代的氨基酸序列。本发明还提供包含编码本发明的L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列的分离的核酸、包含所述核酸的重组表达构建体以及包含所述表达构建体的重组宿主细胞。另外，本发明还提供产生本发明的L-天冬酰胺酶变体的方法。最后，本发明还提供包含本发明的L-天冬酰胺酶变体的用于治疗肿瘤的药物组合物。

Description

活性提高的L-天冬酰胺酶变体

技术领域

本发明属于医药生物工程技术领域。具体涉及活性提高的L-天冬酰胺酶变体以及这些变体在肿瘤治疗中的用途。

背景技术

白血病是当今世界上严重危及人类生命的一种恶性疾病，占肿瘤发病率的第六位，占青少年恶性肿瘤发病率的第一位[1]。这其中，急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukaemia，ALL)是发病率较高的血液系统恶性肿瘤，特别在青少年和儿童中比较普遍，其发病率占所有青少年癌症发病率的约25％以及白血病发病率的约80％[2]。由于恶性细胞的急剧增加和扩散，在不治疗的情况下病人在数月甚至数周内死亡。

在各种治疗方法中，L-天冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP，EC 3.5.1.1)是一种重要的白血病化疗药物，是几乎所有的ALL联合化疗的重要组成部分。它的作用机理是分解血液循环中的L-天冬酰胺，肿瘤细胞由于不能自身合成L-天冬酰胺，当失去外源L-天冬酰胺后导致死亡；而正常细胞由于还具有L-天冬酰胺的第二合成途径，因此不受影响。应用以L-ASP为主的联合化疗，使预后有了明显改观，完全缓解(CR)率达80％以上，5年以上无病生存率大于40％[3]。

已上市的L-ASP作为白血病化疗药物仍然具有局限性。目前临床上应用的L-ASP酶活性低，体内半衰期短(＜5小时)，因而用药剂量很大(30-50mg)，需要频繁注射(每周3次)，常引起患者过敏反应、热原反应及其它副作用[4]。PEG化修饰的L-ASP虽然有明显延长的半衰期，过敏反应总体发生率较天然提取产物降低，但PEG修饰造成酶活性降低30％，而且对天然L-ASP不过敏的患者有11％对PEG化产品过敏(数据来源为Enzon公司PEG化L-ASP Oncaspar的产品说明书)。加之PEG化修饰的L-ASP价格昂贵，其加重了患者的经济负担，因而目前的治疗仍然主要采用从大肠杆菌提取的天然产物。上述不足使得L-ASP的应用受到限制。

蛋白质体外定向进化技术能够用来对各种酶进行改造，如：Moon-sooKim等人[8]通过易错PCR技术增强了来源于大肠杆菌肌醇六磷酸酶AppA2的热稳定性；An YF等人[9]将易错PCR与StEP重组技术结合提高了S-腺苷基蛋氨酸合成酶Sam1的酶活性，使体内合成S-腺苷基蛋氨酸累积量增加了56％。

曾有研究报道：利用蛋白质体外定向进化技术对来源于欧文氏菌(Erwmia chrysanthemi)的L-ASP进行改造，获得热稳定性提高的变体L-ASP(D133V)，其体外半失活温度(Tm)较野生型L-ASP提高9.4℃[10]。

本领域仍需要能够降低蛋白剂量，延长给药间隔，大幅降低副反应，降低生产成本和治疗费用的具有较高酶活性和热稳定性的L-ASP。本发明使用蛋白质体外定向进化技术获得了这样的L-ASP。

发明概述

本发明通过体外定向进化-易错PCR技术对大肠杆菌(Escherichia coli)野生型L-天冬酰胺酶(L-ansB)进行改造，获得活性提高和热稳定性提高的L-天冬酰胺酶变体。

因此，在一个方面，本发明提供了L-天冬酰胺酶的变体，其是如SEQ IDNO：3所示的大肠杆菌野生型L-天冬酰胺酶的变体，所述L-天冬酰胺酶变体包含在对应于SEQ ID NO：3的第48、49、152和283位上具有一或多个氨基酸取代的氨基酸序列。本发明的L-天冬酰胺酶变体与野生型酶相比具有提高的活性和热稳定性。

另一方面，本发明提供了包含编码本发明的L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列的分离的核酸、包含所述核酸的表达构建体以及包含所述表达构建体的宿主细胞。

另外，本发明还提供了产生本发明的L-天冬酰胺酶变体的方法。

最后，本发明还提供了包含本发明的L-天冬酰胺酶变体的用于治疗肿瘤的药物组合物。

附图说明

图1.L-天冬酰胺酶分解L-天冬酰胺反应示意图。

图2.示出纯化的L-天冬酰胺酶变体蛋白电泳图。泳道1为发酵液；泳道2为穿透液；泳道3为平衡漂洗液；泳道4为用含0.2M NaCl的20mMPB(pH8.0)洗脱的洗脱液(L-天冬酰胺酶变体蛋白)；泳道5、6为用含有0.5M和1M NaCl的20mM PB(pH8.0)洗脱的洗脱液；泳道7为蛋白标记物。

图3.L-天冬酰胺酶变体与野生型酶纯化后的蛋白电泳图。泳道1为蛋白标记物，泳道2为野生型酶，泳道3为变体M1，泳道4为变体M13。

图4.L-天冬酰胺酶变体M1与野生型酶体外半失活温度测定比较图。

图5.L-天冬酰胺酶变体M1与野生型酶热稳定性比较图。

发明详述

通过体外定向进化-易错PCR技术对大肠杆菌野生型L-天冬酰胺酶(L-ansB)进行改造，令人惊奇地，本发明人获得了具有提高的活性和热稳定性的L-天冬酰胺酶变体。

在第一个方面，本发明提供了L-天冬酰胺酶的变体，其是如SEQ IDNO：3所示的大肠杆菌野生型L-天冬酰胺酶的变体，所述L-天冬酰胺酶变体包含在对应于SEQ ID NO：3的第48、49、152和283位上具有一或多个氨基酸取代的氨基酸序列，任选地，所述氨基酸序列不含有信号肽SEQ IDNO：15。

在一个优选的实施方案中，本发明的L-天冬酰胺酶变体包含选自SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8的氨基酸序列，最优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，以及任选地，所述氨基酸序列不含有信号肽SEQ ID NO：15。

“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

在一些实施方案中，本发明的L-天冬酰胺酶变体可以包含额外的接头或者与其它标签蛋白融合。这些接头和/或标签可以有利于本发明的L-天冬酰胺酶变体在目标宿主细胞中的产生，增加表达量或增加可溶性表达，有利于所述变体的分离和纯化，但基本上不会影响变体的活性。本领域已知许多这样的接头和/或标签。合适的接头和/或标签包括例如6×His、GST(谷胱甘肽转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)等等。合适的接头和/或标签通常可以通过选择合适的商品化表达载体而获得。

在第二个方面，本发明还提供了分离的核酸，其包含本发明的L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列，任选地，所述核苷酸序列不含有信号肽SEQ IDNO：15的编码序列。

编码本发明的L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列可以由本发明的L-天冬酰胺酶变体的氨基酸序列根据标准密码子表推导得出。本领域技术人员应当了解可以针对所选择的不同表达系统对编码本发明的L-天冬酰胺酶变体的核苷酸序列进行密码子优化以获得表达的最大化。例如在大肠杆菌表达系统中，可以选择大肠杆菌偏好的密码子来编码本发明的L-天冬酰胺酶变体。

在一个实施方案中，本发明分离的核酸包含选自SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的核苷酸序列，优选包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：14的核苷酸序列，最优选包含SEQID NO：10的核酸序列，以及任选地，所述核苷酸序列不含有信号肽SEQ IDNO：15的编码序列。

在第三个方面，本发明提供了包含本发明的核酸的重组表达构建体，其中所述核苷酸序列可操纵地连接至表达载体上的一或多个调控序列。

在本领域中已知有适用于各种宿主细胞的大量的各种调控序列。例如，存在于表达载体中的“调控序列”可包括增强子，启动子，剪接供体/受体信号，Kozak序列，终止子及聚腺苷酸化序列，其如本领域所熟知的那样促进可操纵地连接于其上的核苷酸序列的表达，或促进被编码的蛋白质的表达。对于启动子，可以使用例如在大肠杆菌或其他类似微生物中表达本发明的L-天冬酰胺酶变体的T71ac、CAT、Trp或T5启动子。这些调控序列是本领域已知的并在合适和已知条件下使用。

可用于构建本发明的重组表达构建体的表达载体包括质粒载体、酵母穿梭载体、杆状病毒、复制缺陷的腺病毒等。本领域中已知大量可获得的适于表达本发明的L-天冬酰胺酶变体的表达载体。

在一个优选的实施方案中，用于表达本发明的L-天冬酰胺酶变体的表达载体是pBV220质粒载体(上海闪晶分子生物科技有限公司)。

在第四个方面，本发明提供了用于产生本发明的L-天冬酰胺酶变体的重组宿主细胞，其包含本发明的重组表达构建体。

用于表达本发明的L-天冬酰胺酶变体的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属的，优选是大肠杆菌。在本发明的一个实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌Top10菌株细胞。

可以通过许多已熟知的任一技术将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。

本发明的L-天冬酰胺酶变体可以通过本领域已知的各种产生蛋白质的方法获得。例如化学合成，包括固相或液相合成。然而，出于生产成本的原因，优选使用遗传工程的方法。

因此，在第五个方面，本发明提供了产生本发明的L-天冬酰胺酶变体的方法，其包括：

a)在适合本发明的L-天冬酰胺酶变体表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

b)从培养物中回收产生的L-天冬酰胺酶变体。

在最后一个方面，本发明还提供了包含本发明的L-天冬酰胺酶变体的用于治疗肿瘤的药物组合物。优选地，所述肿瘤是血液系统肿瘤，更优选是急性淋巴细胞白血病或淋巴瘤。

适当地，所述药物组合物进一步包含药物学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。

“药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可以安全地进行系统性施用的固体或液体填充物、稀释剂或做成胶囊的物质等。依照施用时的特殊途径，可以使用本领域中所熟知的各种不同的载体。这些载体可以选自包括糖类，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽糖，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸缓冲液，乳化剂，等张盐水与盐类，盐类是如同包括了氯化氢的矿物酸盐，溴化物与硫化物，有机酸如醋酸盐，丙酸盐与丙二酸盐以及无热原水。

可用任何安全途径为患者提供本发明的药物组合物。可使用例如经口，直肠，肠外注射，舌下，口腔，静脉内，关节内，肌肉内，真皮内与皮下的注射，或经吸入，眼球内，腹膜内，脑室内或经透皮肤等及其类似途径。优选静脉注射。

可用与药剂设计兼容的方法来以药物有效量施用本发明的药物组合物。对患者施用的剂量应当足以在一段适当时间后在患者身上产生有利的应答。施用剂量应由医师判断，视施用对象的各种因素而定，如年龄、性别、体重及其一般健康状况等。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例1：大肠杆菌L-ansB基因的克隆

根据NCBI公布的L-ansB核苷酸序列设计上游引物mansB-001(5′-CGGAATTCATGGAGTTTTTCAAAAAGACG-3′)(SEQ ID NO：1)和下游引物mansB-002(5′-CGGGATCCTTAGTACTGATTGAAGATCTG-3′)(SEQ ID NO：2)，其中下划线示出分别额外添加的EcoRI和BamHI酶切位点，引物5’末端还额外添加两个保护碱基。

以E.coli DH5α基因组为模板进行PCR反应。反应条件为：95℃预变性5min，再按如下参数循环反应30次：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。

PCR产物经1％低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段的胶块并放入1.5mL Eppendorf管中，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒(OmegaBio-Tek公司)进行回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用。

纯化后的PCR产物片段和T载体pMD18T(宝生物工程(大连)有限公司)按以下体系使用NEB公司的T4连接酶进行连接反应：

将混匀后的连接反应液，放置于25℃反应30min，4℃备用或直接用于转化反应。

将10μL连接反应液加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加LB培养基至1mL，置于37℃、170rpm摇床中振荡培养1h，取200μL上述培养物涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，经37℃恒温培养过夜。挑取菌落扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取质粒，经EcoRI和BamHI酶切电泳鉴定，将正确克隆送往测序，核苷酸测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，经核对与NCBI公布L-ansB核苷酸序列一致，将该测序构建体命名为pMD18T-ansB。

实施例2：重组表达构建体pBV-ansB的构建

对实施例1中测序构建体pMD18T-ansB进行EcoRI和BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)双酶切反应以回收L-ansB目的基因片段：

混匀完毕后的酶切反应液，放置于37℃保温过夜后，用实施例1中的方法纯化回收。pBV220表达载体以同样的方式进行EcoRI和BamHI双酶切反应，纯化回收线性pBV220表达载体片段。

纯化后的L-ansB目的基因片段和线性pBV220表达载体片段按以下体系进行连接反应：

将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，目录号CB104)中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加SOC培养基至1mL，置于32℃、170rpm摇床中振荡培养1h，取200μL菌液涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃温育过夜。挑取菌落扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取质粒，经EcoRI和BamHI酶切电泳鉴定，将正确克隆送往测序，核苷酸测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，经核对与NCBI公布L-ansB核苷酸序列一致，将获得的构建体命名为pBV-ansB。

实施例3：易错PCR随机突变L-ansB基因

按如下体系配制易错PCR反应溶液：

·10×PCR缓冲液 10μL

·50×dNTPs混合物 2μL

·10mM dCTP 2μL

·10mM dTTP 2μL

·10×MgCl₂ 10μL

·MnCl₂ 5μL

·上游引物mansB-001 2μL

·下游引物mansB-002 2μL

·模板pBV-ansB 10～100ng

·rTaq DNA聚合酶 1μL(5U)

·加双蒸水至 100μL

其中：

10×PCR缓冲液：20mM MgCl2，200mM KCl，50mM Tris-HCl，pH8.3；

50×dNTPs混合物：含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10mM；

10×MgCl₂溶液：70mM，溶于灭菌水；

MnCl₂溶液：1mM，溶于灭菌水；

rTaq DNA聚合酶：购自宝生物工程(大连)有限公司，目录号DR001。

易错PCR反应条件为：95℃预变性5min，再按如下参数循环反应20次：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min

实施例4：L-ansB变体库的构建

取实施例3中纯化后的易错PCR产物片段按以下体系进行EcoRI和BamHI双酶切反应：

混匀完毕后的酶切反应液，放置于37℃温育3h后，使用E.Z.N.A Cycle PureKit试剂盒(Omega Bio-Tek公司)对酶切片段进行直接回收，取50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，取3μL进行电泳检测，-20℃保存备用或直接用于连接反应。pBV220表达载体以同样的方式进行EcoRI和BamHI双酶切反应，纯化回收线性pBV220表达载体片段。

纯化后的易错PCR产物片段和线性pBV220表达载体片段按以下体系进行连接反应：

将10μL连接反应液加入100μL E.coli Top10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加SOC培养基至1mL，置于32℃、170rpm摇床中振荡培养1h，离心上述培养物，剩余200μL上清并吹吸混匀后涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，32℃恒温培养过夜。

实施例5：L-天冬酰胺酶变体的筛选

原理：

L-天冬酰胺酶的高通量筛选是基于比色法而建立的，由于L-天冬酰胺酶的特异性底物L-天冬酰胺可以被水解生成氨(见图1)，而生成的氨可以与奈氏试剂发生特异性化学反应生成红棕色络合物碘化双汞胺，在460nm处有最大吸收值，通过比色可以筛选出具有增加的活性的L-天冬酰胺酶变体。

试剂：

L-天冬酰胺溶液：精密称取0.15g L-天冬酰胺，溶于25mL的0.1M PB缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)，pH8.0(新鲜配制)。

细胞裂解液：0.2mg/mL溶菌酶，50mM PB，pH8.0。

25％三氯乙酸(TCA)溶液：精密称取34g TCA溶于60mL去离子水(室温避光保存)。

奈氏试剂：取碘化汞11.5g，碘化钾8g，溶于50mL去离子水中，充分混匀，放置过夜得到碘化汞钾溶液，临用时取等体积与20％氢氧化钠溶液混合使用(室温避光保存)。

初级筛选：

1)吸取300μL含有氨苄抗性LB液体培养基加至96深孔板，并用灭菌牙签挑取实施例4所得单菌落至各个孔中轻微晃动(分别在94、95、96号孔中挑入含有表达野生型L-天门冬酰胺酶的单菌落作为筛选对照)，再在已画有方格并标有序号的新鲜LB平板上进行保种，平板置于32℃培养过夜。

2)将96深孔板固定于32℃摇床中，170rpm振荡24h。

3)培养结束后，再向各孔中加入300μL含有氨苄抗性LB液体培养基，再固定于42℃摇床中，170rpm振荡诱导培养5h。

4)诱导培养结束后，取出96深孔板。吸取100μL诱导后的菌液至另一深孔板中，2500g离心10min，弃去培养基上清，加盖置于-80℃放置15min。

5)再加入200μL预冷的细胞裂解液，加盖放置于4℃冰箱中10min，再固定于微孔板振荡器上，室温200rpm振荡10min，充分裂解菌体。

6)充分裂解后，向各孔中加入200μL已预热的0.04M L-天冬酰胺溶液，放置于37℃培养箱中振荡反应15min。准确反应15min后，立即加入50μL 25％三氯乙酸(TCA)终止反应，轻微振荡数十秒。

7)2500g离心10min，吸取10μL上清至含有90μL PB的96孔板中，再加入40μL奈氏试剂进行显色，反应10min后在主波长450nm，副波长630nm处进行测定，吸光值A＝A450-A630。

次级筛选

1)初级筛选获得的酶活性提高的初级变体单菌落接种入含有20mL LB培养基的小摇瓶中，32℃、170rpm振荡培养。

2)当OD600至0.6左右时，将温度调至42℃进行诱导培养5h。

3)诱导培养结束后，取1mL菌液进行5000rpm离心5min，弃去上清液，置于-80℃放置15min。

4)再加入1mL预冷的细菌裂解液，室温振荡5min，充分裂解菌体，然后5000rpm离心5min。

5)取100μL裂解上清液与200μL已预热的0.04M L-天冬酰胺溶液，放置于37℃培养箱中振荡反应15min。准确反应15min后，立即加入50μL 25％三氯乙酸(TCA)终止反应，轻微振荡数十秒。

6)5000rpm离心5min，向上述反应液中加入100μL奈氏试剂进行显色，反应10min后在主波长450nm，副波长630nm处进行测定，吸光值A＝A450-A630。

7)将吸收值与初级筛选吸收值进行核对比较，获得较野生型酶活性提高的L-天冬酰胺酶变体。

将活性提高的L-天冬酰胺酶变体的编码基因进行DNA序列测定，证实获得了三种具有提高的活性的L-天冬酰胺酶变体，总结于下表1：

表1

变体命名	突变位置	氨基酸序列号	核酸序列号
				M1	48、49	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：10
M2	152	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：11
				M3	283	SEQ ID NO：6	SEQ ID NO：12

实施例6：L-天冬酰胺酶变体的纯化

2L发酵菌液经8000rpm，4℃离心20min，收集菌体沉淀，加20mL 20mMPB(pH8.0)重悬菌体后，在冰浴上进行超声破碎，破碎完成后12000rpm，4℃离心20min，收集超声破碎上清液。

取DEAE sepharose FastFlow柱(3cm×10cm)(填料购自GE Healthcare公司，目录号17-0709-01)，用20mM PB(pH8.0)平衡。20mL含L-天冬酰胺酶变体的超声破碎上清液经0.45μm滤膜过滤后，缓慢过柱(AKTA-Prime，0.3MPa，2mL/min)，然后用含有0.05M～1M NaCl的20mM PB(pH8.0)分段洗脱蛋白。SDS-PAGE结果见图2。

将收获的L-天冬酰胺酶变体蛋白透析至20mM PB(pH8.0)缓冲液中，超滤浓缩后采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce Biotechnology)进行蛋白浓度定量，调整浓度至20mg/ml，小瓶分装，冷冻干燥，-20℃保存。

实施例7：变体的活性测定

按照中国药典-天冬酰胺酶比活测定方法，测定单位时间内产物氨的生成量，OD460测定氨与奈氏试剂生成特异性棕红色络合物碘化双汞胺生成量，计算酶活性单位。L-天冬酰胺酶变体比活测定结果见表2：

表2

实施例8：组合不同突变位点的变体

获得了活性提高的M1、M2、M3的3种变体。为了考察不同突变位点的组合对变体酶活性的影响，对已获得的突变位点进行组合，获得多种变体。按照实施例6的方法获得纯化后的变体，再通过实施例7的方法进行酶活测定并比较酶活。变体的比活性测定结果见下表3：

表3

实施例9：变体热稳定性的测定

体外半失活温度测定

将纯化后的野生型酶和变体M1在37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、70℃热水浴中进行热处理60min后，分别以未经热处理的野生型酶和变体M1作为对照，进行残留酶活测定。结果如图4所示，变体M1体外半失活温度较野生型酶提高了约6.5℃，热稳定性明显得到提高。

常见温度条件下稳定性测定

考虑到酶在生产、运输、储存和治疗中及极端条件下的实际情况，我们进一步分别在50℃、37℃和4℃条件下测定了酶的热稳定性情况。

将纯化后的野生型酶和变体M1分别置于50℃、37℃和4℃环境中，分别以未经处理的野生型酶和变体M1作为对照，每个温度条件各设置6个测定点，置于50℃环境中的酶每小时测定一次残留酶活(图5-A)；置于37℃环境中的酶每天测定一次残留酶活(图5-B)；置于4℃环境中的酶每月测定一次残留酶活(图5-C)。结果如图5所示，变体M1在各温度条件下的稳定性较野生型酶都得到了提高。

实施例10：变体特异性底物动力学参数的测定

通过以下两种酶偶联催化反应对L-ASP进行动力学参数测定：

L-天冬酰胺+H₂O＝L-天冬氨酸+NH₃

α-酮戊二酸+NH₃+NADH+H⁺＝L-谷氨酸+H₂O+NAD⁺

试剂溶液：

L-天门冬酰胺溶液：0.09375mM、0.1875mM、0.375mM、0.5625mM、0.75mM、1.125mM、1.5mM、3mM、6mM。

反应溶液：66.7mM Tris、7.5mMα-酮戊二酸、0.25mM NADH，pH8.0。谷氨酸脱氢酶溶液(Toyobo CO.，Ltd.Bio Chemical Department)：浓度为50U/mL。

纯化后野生型或变体酶溶液(电泳图见图3)：浓度为0.0025mg/mL。

实验方法：

在3ml的体系中，首先加入2.4ml反应溶液和0.2ml的不同浓度L-天冬酰胺溶液，混合后置于37℃预热5min，加入0.2ml谷氨酸脱氢酶溶液，反应2min，加入野生型酶或变体酶溶液0.2ml，每1min测定一次，持续10min。

以双倒数作图法(Lineweaver-Burk Plot)求取Km及其kcat值。测定结果示于下表4：

表4

实施例11：变体对急性淋巴瘤白血病小鼠治疗效果测定[11]

取18～22g的DBA/2小鼠(中国医学科学院实验动物研究所)70只，雌雄各半，按移植性肿瘤研究法[12]接种L5178Y-R腹水瘤(ATCC目录号CRL-1722)。接种后随机分为7组，每组10只，分别按以下剂量给药：野生型酶溶液(4000IU/kg体重)；M1酶溶液(4000IU/kg体重)；M2酶溶液(4000IU/kg体重)；M3酶溶液(4000IU/kg体重)；M12酶溶液(4000IU/kg体重)；M13酶溶液(4000IU/kg体重)；另设立PBS空白对照组(20ml/kg体重)。于接种L5178Y-R腹水瘤后，24h腹腔注射给药，每天一次，共给药10d，观察荷瘤DBA/2小鼠接种腹水瘤后的存活天数。

L5178Y-R小鼠腹腔注射野生型酶和变体的平均生存时间(均值±标准差，n＝10)测定结果总结于下表5，差异用统计学进行分析(t-test)。

表5

注：a为野生型酶组对比对照组，P＜0.01；b为M1组对比野生型酶组，P＜0.01；c为M13组对比野生型酶组，P＜0.05。

实施例12：变体对正常小鼠的毒性测定

取18～22g昆明种小鼠(军事医学科学院实验动物中心)300只，雌雄各半，随机分为30组，每组10只将野生型酶和变体分别按剂距比为1∶0.5分成剂量25×10³、50×10³、100×10³、200×10³、400×10³IU/kg体重，进行静脉注射给药，给药体积为25ml/kg体重。给药后观察14d，逐日记录小鼠活动和死亡情况。正常小鼠静脉注射野生型酶和变体的死亡率(n＝10)测定结果示于下表6。

表6

参考文献

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