CN109652400A

CN109652400A - 抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株

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Publication number: CN109652400A
Application number: CN201710947449.2A
Authority: CN
Inventors: 朱蕾蕾
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2037-10-12
Also published as: CN109652400B

Abstract

本发明公开了一种抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株。本发明针对药用辅料(聚乙二醇和表面活性剂等)会降低蛋白质药物活性和半衰期的问题，通过对来自变形假单孢菌(P.plecoglossicida)的野生型精氨酸脱亚胺酶进行分子改造(随机突变和理性设计)，优化药物蛋白PEG修饰位点和表面活性剂耐受性位点，最终获得了一种高活性、高稳定性的精氨酸脱亚胺酶突变体。实验证明，本发明最终所得的精氨酸脱亚胺酶突变体具有可观的相对储存期和半衰期，可作为候选抗癌蛋白质药物。

Description

抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶(arginine deminase,ADI,EC 3.5.3.6)，属于“胍基修饰酶”超家族中的一员，负责催化ADI途径中第一步反应，可将精氨酸转化为瓜氨酸和氨。早前，ADI主要应用于转化精氨酸生产瓜氨酸。近年来，ADI在抗肿瘤探索中表现日益突出而备受关注。

由于其可将人体血液中的精氨酸转化为瓜氨酸和氨，使精氨酸缺陷型癌细胞因精氨酸的供给阻断而死亡，从而达到治疗癌症的目的。研究发现，ADI能比天冬酰胺酶能更有效地抵抗白血病，仅仅需5-10ng/mL ADI就能抑制白血病细胞生长，比L-天冬酰胺酶的浓度低约20-100倍；并且ADI能够专一性地作用于T细胞，而不影响B细胞，可以避免天冬酰胺酶的一些副作用，比如过敏性反应和凝固作用等，因此精氨酸脱亚胺酶是一种极具潜力的可用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的精氨酸消耗性抗癌药物，可用于治疗肝癌、黑色素瘤、急性髓性白血病及乳腺癌等。近年来，ADI作为新型抗癌药物的临床研究在国内外已经开展并引起了高度重视。

精氨酸脱亚胺酶等酶类抗肿瘤药物用于体内时，必须经过修饰以解除免疫反应和肾脏清除作用。聚乙二醇修饰(polyethyleneglycol,PEG)是酶类抗肿瘤药物临床应用的最常用的方法。PEG修饰是将活化的PEG分子通过化学键结合于蛋白质、多肽等生物大分子表面的氨基酸残基，以增加稳定性，提高抵抗蛋白酶水解的能力，降低免疫原性和毒性，延长体内半衰期及降低血浆清除率等。PEG修饰目前被广泛地应用在酶类抗肿瘤药物的开发中是抗癌药物研究的热点之一。PEG修饰技术迅速发展，已从理论走向实际的药物应用。

在临床使用中，酶类抗肿瘤药物的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰能解决其体内半衰期短、免疫原性、血浆清除率高、稳定性和溶解性差等问题。

虽然聚乙二醇修饰酶类抗肿瘤药物临床应用的最常用的方法，但常常会在提高体内半衰期的同时显著地降低酶类抗肿瘤药物的活性。例如，PEG分子连接在蛋白质活性区域或底物通道附近的氨基酸残基上，会阻碍底物分子的进入并降低底物转化效率。因此，PEG修饰的位点选择很关键，需要尽量避免酶活性区域的修饰，提高有效修饰位点的数目，降低活性损失。

精氨酸脱亚胺酶(ADI)通过表面赖氨酸残基上的PEG修饰后虽然可以达到降低其免疫原性、延长半衰期的目的，表现出较好的抗癌活性和安全性，但是经常会出现由于PEG分子修饰而导致酶活性降低的问题，仅维持原活性的48％-60％，无法发挥其最大的潜在抗癌活性。但目前PEG修饰的研究主要集中在对PEG修饰剂的开发、反应条件的优化、后续分离技术及定向修饰等方面。即使PEG修饰会导致酶活的降低，但考虑到对酶的体内半衰期的提高，除了少数的研究采用了定点突变技术，未见研究并通过系统的表面氨基酸位点优化来避免PEG分子连接酶活性区域的活性基团。

发明内容

本发明为了解决以上问题，通过优化酶表面的PEG修饰位点，降低活性损失，提高PEG修饰的效率，这不仅会大大提高酶类抗肿瘤药物的体内抗癌活性，也将进一步降低注射用量、给药次数并减轻病人痛苦和降低治疗成本。本发明的目的是提供抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株。

第一，本发明提供了一种优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造方法。

本发明所提供的优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造方法，具体可包括如下步骤(I)-(II)：

(I)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。该步骤可利用Discovery studio软件完成。

(II)将所述野生型待优化药用蛋白中的所述聚乙二醇修饰位点处的全部或部分氨基酸突变为赖氨酸，从而完成对所述野生型待优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造。

由于此聚乙二醇修饰位点的优化方法不受蛋白质结构和活性的限制，因此可以应用于任何药用蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述药用蛋白具体为精氨酸脱亚胺酶。

第二，本发明提供了精氨酸脱亚胺酶突变体。

本发明所提供的精氨酸脱亚胺酶突变体其与野生型精氨酸脱亚胺酶相比半衰期和相对储存期得到提高，具体可为精氨酸脱亚胺酶突变体A或精氨酸脱亚胺酶突变体B或精氨酸脱亚胺酶突变体C。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点和表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；其中，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸，将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体B为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点处的氨基酸进行定点突变后得到的，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体C将野生型精氨酸脱亚胺酶中的表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A和所述精氨酸脱亚胺酶突变体B中，所述聚乙二醇修饰位点均是按照如下(1)-(3)所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来的：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。该步骤可利用Discovery studio软件完成。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A和所述精氨酸脱亚胺酶突变体C中，所述表面活性剂耐受位点均是按照如下所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来的：制备所述野生型精氨酸脱亚胺酶的易错PCR突变体库，检测突变体的精氨酸脱亚胺酶的活性，活性比所述野生型精氨酸脱亚胺酶提高20％以上的入选。

第三，本发明提供了所述精氨酸脱亚胺酶突变体的制备方法。

本发明所提供的所述精氨酸脱亚胺酶突变体的制备方法，具体可为如下方法一或方法二或方法三：

方法一：前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体A的制备方法，包括如下步骤(A1)-(A3)：

(A1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。该步骤可利用Discovery studio软件完成。

(A2)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点。其中，所述表面活性剂耐受位点可按照如下所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来：制备所述野生型精氨酸脱亚胺酶的易错PCR突变体库，检测突变体的精氨酸脱亚胺酶的活性，活性比所述野生型精氨酸脱亚胺酶提高20％以上的入选。

(A3)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点和所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体A；其中，所述聚乙二醇修饰位点处的突变为将所述聚乙二醇修饰位点中的全部或部分突变为赖氨酸，所述表面活性剂耐受位点处的突变为将所述表面活性剂耐受位点中的全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸。

方法二：前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体B的制备方法，包括如下步骤(B1)-(B2)：

(B1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。该步骤可利用Discovery studio软件完成。

(B2)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点处的全部或部分氨基酸突变为赖氨酸，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体B。

方法三：前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体C的制备方法，包括如下步骤(C1)-(C2)：

(C1)从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点。其中，所述表面活性剂耐受位点可按照如下所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来：制备所述野生型精氨酸脱亚胺酶的易错PCR突变体库，检测突变体的精氨酸脱亚胺酶的活性，活性比所述野生型精氨酸脱亚胺酶提高20％以上的入选。

(C2)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述表面活性剂耐受位点中的全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体C。

在本发明的一个实施例中，所述野生型精氨酸脱亚胺酶具体为来自于变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)CGMCC No.2039的精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列1所示，编码基因的序列如序列表中序列2所示。

相应的，所述聚乙二醇修饰位点具体为所述野生型精氨酸脱亚胺酶(即来自于变形假单胞菌CGMCC No.2039的精氨酸脱亚胺酶)的第299位精氨酸、第319位精氨酸、第338位精氨酸、第382位精氨酸、第55位组氨酸、第73位组氨酸、第118位组氨酸、第199位组氨酸和第218位组氨酸。所述表面活性剂耐受位点为所述野生型精氨酸脱亚胺酶(即来自于变形假单胞菌CGMCC No.2039的精氨酸脱亚胺酶)的第6、50、81、114、130、162、216、251、254、264、332和353位的谷氨酰胺。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述精氨酸脱亚胺酶突变体A的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Gln130Arg/Gln216Arg/Gln353Arg/Arg299Lys；Gln264Arg/Gln332Arg/Arg382Lys；Gln50Arg/Arg299Lys/Arg382Lys。所述精氨酸脱亚胺酶突变体B的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Arg319Lys/His55Lys；Arg338Lys/His73Lys；Arg382Lys/His118Lys/His199Lys；Arg299Lys/Arg382Lys/His218Lys。所述精氨酸脱亚胺酶突变体C的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Gln6Pro/Gln50Arg；Gln50Arg；Gln81Arg/Gln114Arg/Gln251Arg；Gln130Arg/Gln216Arg/Gln353Arg；Gln162Arg/Gln254Arg；Gln264Arg/Gln332Arg；Gln50Arg/Gln162Arg/Gln353Arg。

对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在序列1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在序列1的第319位用赖氨酸取代原有的精氨酸氨酸命名为“Arg319Lys”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔，例如：“Arg319Lys/His55Lys”代表分别在序列1的第319和55位用赖氨酸和赖氨酸取代原有的精氨酸和组氨酸。

第四，本发明提供了精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物。

本发明所提供的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，其与野生型精氨酸脱亚胺酶相比半衰期和相对储存期得到提高，具体可是通过将前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体A或精氨酸脱亚胺酶突变体B进行聚乙二醇修饰后得到的。

第五，本发明提供了精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材料。

本发明所提供的精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材料，具体为如下任一：

(I)所述精氨酸脱亚胺酶突变体的编码基因；

(II)含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

在本发明中，当所述精氨酸脱亚胺酶突变体为前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体A时，其编码基因与序列表中序列2相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：CAG 388-390 CGA/CAA 646-648CGA/CAG 1057-1059CGA/CGC 895-897AAG；CAA 790-792CGA/CAG994-996CGG/CGC 1144-1146AAG；CAG 148-150 CGA/CGC 895-897AAG/CGC 1144-1146 AAG。当所述精氨酸脱亚胺酶突变体为前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体B时，其编码基因与序列表中序列2相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：CGC 955-957AAA/CAC 163-165AAA；CGT 1012-1014AAG/CAT 217-219AAG；CGC 1144-1146AAG/CAC 352-354AAA/CAC595-597AAA；CGC 895-897AAG/CGC 1144-1146AAG/CAC 652-654AAG。当所述精氨酸脱亚胺酶突变体为前文所述的精氨酸脱亚胺酶突变体C时，其编码基因与序列表中序列2相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：CAG 16-18CCA/CAG 148-150 CGC；CAG 148-150 CGC；CAG 241-243AGG/CAG 340-342AGA/CAA 751-753CGA；CAG 388-390 CGA/CAA 646-648CGA/CAG 1057-1059CGG；CAG 484-486CGG/CAG 760-762CGA；CAA 790-792CGA/CAG 994-996AGG；CAG 148-150 CGA/CAG 484-486CGG/CAG 1057-1059CGA。

对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基(野生型)，位置(即在序列2中的位置)，取代碱基。相应的，在序列2的第955-957位用AAA取代原有的CGC命名为“CGC 955-957AAA”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔，例如：“CGC 955-957AAA/CAC 163-165AAA”代表分别在序列2的第955-957位和第163-165位用AAA和AAA取代原有的CGC和CAC。

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A或所述精氨酸脱亚胺酶突变体B或其相关生物材料在制备所述精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物中的应用，以及所述精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物或所述精氨酸脱亚胺酶突变体或所述精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材料在制备抗癌药物中的应用也分别属于本发明的保护范围。

其中，所述抗癌药物具体为抗精氨酸缺陷型的黑色素瘤，肝癌，乳腺癌，非小细胞肺癌等等的药物。

本发明针对药用辅料(聚乙二醇和表面活性剂等)会降低蛋白质药物活性和半衰期的问题，通过对来自变形假单孢菌(P.plecoglossicida)的野生型精氨酸脱亚胺酶进行分子改造(随机突变和理性设计)，优化药物蛋白PEG修饰位点和表面活性剂耐受位点，最终获得了一种高活性、高稳定性的精氨酸脱亚胺酶突变体，并且有效的提高了其相对储存期(relative shelf life time)和半衰期，可作为候选抗癌蛋白质药物。

附图说明

图1为精氨酸脱亚胺酶的离子交换纯化谱图。

图2为纯化后的精氨酸脱亚胺酶的蛋白质凝胶电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PEG修饰和/或具有表面活性剂耐受性的精氨酸脱亚胺酶的制备及鉴定

本实施例中所涉及的野生型精氨酸脱亚胺酶为来自于变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)CGMCC No.2039的精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列1所示，编码基因的序列如序列表中序列2所示。

一、精氨酸脱亚胺酶突变体基因的克隆

1、从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点

利用Discovery studio软件，按照如下(1)-(3)所示步骤从序列1所示的野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：

(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；

(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；

(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。

最终得到的聚乙二醇修饰位点有：R299、R319、R338、R382、H55、H73、H118、H199、H218。其中，大写字母表示氨基酸种类，阿拉伯数字表示在序列1中的位置，如R299表示序列1中第299位的精氨酸。

2、从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点

按照如下步骤从序列1所示的野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点：用牙签从易错PCR突变库挑取突变体的单克隆至平底96孔板，进行培养(37℃，900rpm，控制70％湿度)。使用96孔板复制器将菌液复制到含有一定葡萄糖和乳糖的自诱导培养基的V形底96孔板进行诱导表达，表达条件：37℃，900rpm，控制70％湿度，培养12h。表达结束后离心除去上清，菌体置于-20℃过夜，之后加入80μl含0.8mg/mL溶菌酶的PBS缓冲液(pH 7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂PO₄,2mM KH₂PO₄,)至96孔板中混匀菌体，37℃，700rpm处理30min。利用瓜氨酸检测法测试突变体的活性，具体步骤：吸取20μl上清至平底96孔板中，再加入100μl含1mM精氨酸和一定量表面活性剂的PBS缓冲液(pH 7.4)，37℃孵育20min。孵育结束后分别向96孔板中加入60μl氯酸铁溶液和20μl二乙酰一肟(0.5M)，置于55℃孵育30min，孵育结束后使用酶标仪检测在490nm处的吸光值。活性较野生型提高20％以上的入选。

最终得到的表面活性剂耐受位点有：Gln50、Gln6、Gln81、Gln114、Gln130、Gln162、Gln216、Gln 251、Gln254、Gln264、Gln332、Gln353。其中，三字母表示氨基酸种类，阿拉伯数字表示在序列1中的位置，如Gln50表示序列1中第50位的谷氨酰胺。

3、精氨酸脱亚胺酶突变体基因的克隆

将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点和所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变，得到精氨酸脱亚胺酶突变体A；其中，所述聚乙二醇修饰位点处的突变为将所述聚乙二醇修饰位点中的全部或部分突变为赖氨酸，所述表面活性剂耐受位点处的突变为将所述表面活性剂耐受位点中的全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸。在基因层面的具体操作如下：

使用本领域已知的方法构建含有编码所述野生型精氨酸脱亚胺酶(序列1)及其突变体基因的质粒，并且将所得重组质粒转化至合适的宿主细胞中。使用的载体质粒具体是pET42b。以含有野生型精氨酸脱亚胺酶或其突变体编码基因的基因片段为模板，以Primer15--3TACATATGTCCGCTGAAAAACAGAAG和5--3GTGCTCGAGTTAGT AGTTGATCGG为引物进行PCR扩增相应的核苷酸基因片段。之后，将所述PCR扩增得到的基因片段作为引物，用MegaWhop的方法扩增整个质粒骨架，得到表达野生型精氨酸脱亚胺酶或其突变体的重组质粒。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞，将含有野生型精氨酸脱亚胺酶或其突变体编码基因的重组质粒导入到该宿主细胞中。

其中，共涉及14种精氨酸脱亚胺酶突变体，这些精氨酸脱亚胺酶突变体在蛋白和基因水平的突变位点具体如表1中所示。

表1精氨酸脱亚胺酶突变体蛋白和基因突变位点

注：蛋白取代的编号是从序列1所示氨基酸序列的N端为起始的；基因取代的编号是从序列2所示核苷酸序列的5’端为起始的。备注一栏中的“PEG修饰位点/表面活性剂耐受修饰位点”表示该突变体在聚乙二醇修饰位点和表面活性剂耐受位点均作了突变；“PEG”表示该突变体仅在聚乙二醇修饰位点作了突变；“表面活性剂耐受”表示该突变体仅在表面活性剂耐受位点作了突变。表中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在序列1中的位置)，取代氨基酸。相应地，在序列1的第319位用赖氨酸取代原有的精氨酸氨酸命名为“Arg319Lys”。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基(野生型)，位置(即在序列2中的位置)，取代碱基。相应的，在序列2的第955-957位用AAA取代原有的CGC命名为“CGC 955-957AAA”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔，例如：“Arg319Lys/His55Lys”代表分别在序列1的第319和55位用赖氨酸和赖氨酸取代原有的精氨酸和组氨酸；“CGC 955-957AAA/CAC 163-165A AA”代表分别在序列2的第955-957位和第163-165位用AAA和AAA取代原有的CGC和CAC。

二、精氨酸脱亚胺酶及其突变体的表达与纯化

将步骤一获得的精氨酸脱亚胺酶或其突变体菌株分别接入LB/Kan液体培养基，待OD₆₀₀为0.6-0.7，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃诱导8h后，10000r/min离心15min收集菌体，用PBS缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)洗涤2次并悬浮，进行高压均质破碎。将破碎液于12000r/min离心20min，保留上清进行提纯。用溶液A(20mmol/L，pH 7.0，磷酸钠缓冲液)平衡HiPrep DEAE FF离子交换层析柱，上样后用所述溶液A洗脱未吸附蛋白，再用溶液B(20mmol/L，pH 7.0，磷酸钠缓冲液，1mol/L NaCl)进行线性洗脱。并将活性部分超滤浓缩脱盐后进行凝胶过滤层析。用溶液C(20mmol/L，pH 7.0，磷酸钠缓冲液，0.15mol/L NaCl)平衡SuperdexTM 200凝胶过滤层析柱，将上步浓缩后的蛋白上样后以进行洗脱。将活性部分收集后于0～4℃冰箱保存，并进行SDS-PAGE分析。

精氨酸脱亚胺酶的离子交换纯化谱图如图1所示。纯化后的精氨酸脱亚胺酶的蛋白质凝胶电泳图如图2所示。由图可见：纯化后的精氨酸脱亚胺酶样品中存在极少的杂蛋白，纯度较高。

三、对精氨酸脱亚胺酶及其突变体进行聚乙二醇修饰

将聚乙二醇mPEG-SS20(Laysanbio公司产品，货号为Laysanbio MPEG-SS-20K-1g)按照摩尔比100:1、50:1和20:1加入纯化后的精氨酸脱亚胺酶或其突变体溶液中(溶剂：10μM，PBS缓冲液，pH7.4)，在室温下搅拌3小时后，用50kDa Amicon Ultra-50进行洗涤三次，以除去未反应的聚乙二醇。此后，进行用阴离子交换柱进行纯化，得到聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶。其中，野生型记为PEG-ADI，突变体分别记为PEG-ADI M1、PEG-ADI M2，PEG-ADIM3和PEG-ADI M4(M1、M2、M3和M4与表1中的M1、M2、M3和M4相对应)。

四、聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的浓度测定

用Bradford蛋白质检测试剂盒测定纯化后的精氨酸脱亚胺酶及其突变体和聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶及其突变体的浓度。将20μL蛋白质样品加入96孔板中，加入100μL 1×protein assay dye(Bio-Rad)，然后置于室温10min后检测595nm的吸光度值后，与BSA标曲进行比对，计算蛋白质浓度。

五、精氨酸脱亚胺酶及其突变体的酶活检测

利用瓜氨酸检测法测试精氨酸脱亚胺酶及其表面活性剂耐受突变体的活性，具体步骤：吸取20μl上清至平底96孔板中，再加入100μl含1mM精氨酸和一定量表面活性剂CTAB或吐温-80(4mM)的PBS缓冲液(pH 7.4)，37℃孵育20min。孵育结束后分别向96孔板中加入60μl氯酸铁溶液和20μl二乙酰一肟(0.5M)，置于55℃孵育30min，孵育结束后使用酶标仪检测在490nm处的吸光值。实验同时设置未加入表面活性剂的对照组。

相对酶活定义为：ADI WT在有表面活性剂时和其它突变体在有和无表面活性剂时的活性除以ADI WT在无任何表面活性剂存在时的活性所得数值。

结果如表2所示，可见M5-M11在无CTAB存在时的活性较ADI WT有1.1倍到1.6倍的提高，在有CTAB存在时提高非常显著，有1.6-6.2倍的提高，因此M5-M11的表面活性剂耐受性有了大幅度的提高。

表2表面活性剂耐受性突变体的相对活性

注：ADI WT表示野生型精氨酸脱亚胺酶(序列1)；M5等与表1中相一致。

六、聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的热稳定性及半衰期的检测

聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶在磷酸缓冲液(50mM，pH 7.4)中在37-60℃孵育4小时后，检测残余活性(具体方法参见步骤五)。T_m值定义为残余50％初始活性时的温度。聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶在PBS冲液液和血清中在37℃孵育，每隔6小时取样检测残余活性，测定半衰期。半衰期定义为酶活残余50％时的孵育时间。

结果如表3和表4所示，可见：PEG修饰后的ADI突变株的Tm值在PBS缓冲液中较野生型均有提高，1-4℃的范围；在血清中的提高幅度更大，为1-5℃。PEG修饰后的ADI突变株的半衰期在PBS缓冲液中较野生型均有提高，提高1.1-1.3倍；在血清中的提高1.1-1.4倍。

表3 PEG修饰后稳定性提高的突变体的T_m值

注：PEG-ADI WT表示经PEG修饰的野生型精氨酸脱亚胺酶(序列1)；PEG-ADI M1等中的M编号与表1中相一致。

表4 PEG修饰后稳定性提高的突变体的半衰期(37℃)(单位：天)

	PBS缓冲液中的半衰期	血清中的半衰期
			PEG-ADI WT	2.8	3.0
PEG-ADI M1	3.6	3.8
			PEG-ADI M2	3.1	3.2
PEG-ADI M3	3.2	3.4
			PEG-ADI M4	3.7	4.1

七、优化表面活性剂耐受位点和PEG修饰位点后经PEG修饰后的ADI的相对储存期(relative shelf life time)的测定

将精氨酸脱亚胺酶野生型和突变株M12-M14纯化后进行聚乙二醇的修饰，在吐温80存在的PBS缓冲液中4℃储存，定期取样测试残余酶活。

相对储存期的定义：精氨酸脱亚胺酶突变体的储存期除以野生型精氨酸脱亚胺酶的储存期，相当于提高的倍数。

结果如表5所示，可见M12-14较精氨酸脱亚胺酶野生型的储存期均有显著提高，提高幅度为1.5倍-2.2倍。

表5优化表面活性剂耐受位点和PEG修饰位点后经PEG修饰后的ADI突变体的相对储存期

	氨基酸突变	相对储存期
			ADI WT	无	1.0
M12	Gln130Arg/Gln216Arg/Gln353Arg/Arg299Lys	1.5
			M13	Gln264Arg/Gln332Arg/Arg382Lys	1.7
M14	Gln50Arg/Arg299Lys/Arg382Lys	2.2

注：ADI WT表示野生型精氨酸脱亚胺酶(序列1)；M12等与表1中相一致。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株

<130> GNCLN171543

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）

<400> 1

Met Ser Ala Glu Lys Gln Lys Tyr Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys

1 5 10 15

Leu Arg Lys Val Met Val Cys Ala Pro Gly Leu Ala His Lys Arg Leu

20 25 30

Thr Pro Ser Asn Cys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp Val

35 40 45

Asp Gln Ala Lys Arg Asp His Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu

50 55 60

Arg Gly Val Asp Val Leu Glu Met His Asn Leu Leu Thr Asp Ile Val

65 70 75 80

Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr Pro

85 90 95

Asp Thr Val Gly Val Gly Leu Thr Asn Glu Val Arg Ser Trp Leu Glu

100 105 110

Gly Gln Glu Pro Arg His Leu Ala Glu Phe Leu Ile Gly Gly Val Ala

115 120 125

Gly Gln Asp Leu Pro Glu Ser Glu Gly Ala Ser Val Val Lys Met Tyr

130 135 140

Asn Asp Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Ile Leu Pro Pro Leu Pro Asn

145 150 155 160

Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr

165 170 175

Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr

180 185 190

Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Thr Lys Ala Asp Phe Gln

195 200 205

Val Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Gln Glu His Gly Gln Ala Thr Leu Glu

210 215 220

Gly Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Lys Gly Ile Val Leu Ile Gly Met

225 230 235 240

Gly Glu Arg Thr Ser Arg Gln Ala Ile Gly Gln Leu Ala Gln Asn Leu

245 250 255

Phe Ala Lys Gly Ala Val Glu Gln Val Ile Val Ala Gly Leu Pro Lys

260 265 270

Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg

275 280 285

Asp Leu Val Thr Val Phe Pro Glu Val Val Arg Glu Ile Val Pro Phe

290 295 300

Ile Ile Arg Pro Asp Glu Ser Lys Pro Tyr Gly Met Asp Val Arg Arg

305 310 315 320

Glu Asn Lys Ser Phe Ile Glu Val Val Gly Glu Gln Leu Gly Val Lys

325 330 335

Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu

340 345 350

Gln Trp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Ala Leu Glu Pro Gly Val Val

355 360 365

Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala

370 375 380

Gly Ile Glu Val Ile Thr Ile Ser Ala Gly Glu Leu Gly Arg Gly Arg

385 390 395 400

Gly Gly Gly His Cys Met Thr Cys Pro Ile Val Arg Asp Pro Ile Asn

405 410 415

Tyr

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> 变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）

<400> 2

atgtccgctg aaaaacagaa gtacggtgtc cactccgaag caggcaagct gcgcaaggta 60

atggtctgcg ctccgggact ggcgcacaag cgcctgaccc cgagcaactg cgacgagctg 120

ctgttcgacg atgtgatctg ggtcgaccag gccaagcgcg accacttcga cttcgtcacc 180

aagatgcgcg agcgcggcgt ggatgtgctg gaaatgcata acctgctcac cgacatcgtg 240

cagaaccccg aggccctgaa gtggatcctc gaccgcaaga tcacccctga caccgtcggg 300

gtgggcctga ccaacgaagt gcgcagctgg ctggagggcc aggagccacg ccacctcgcc 360

gagttcctga tcggcggcgt ggccggccag gacctgccgg agagcgaagg tgccagcgtg 420

gtcaagatgt acaacgacta cctgggccac tccagcttca tcctgccgcc gctgcccaac 480

acccagttca cccgcgacac cacctgctgg atctacggcg gcgtgaccct caacccgatg 540

tactggccgg cgcgacgcca ggaaaccctg ctgaccaccg ccatctacaa gttccacccc 600

gagttcacca aggccgactt ccaggtctgg tacggcgacc cggaccaaga gcacggccag 660

gccaccctcg aaggcggcga cgtcatgccg atcggcaagg gcatcgtgct gatcggcatg 720

ggtgagcgca cctcgcgcca ggccatcggc caactggcac agaacctctt cgccaagggc 780

gcagtggagc aagtgatcgt cgccgggctg ccgaagtccc gtgcggccat gcacctggac 840

accgtgttca gcttctgcga ccgcgacctg gtcacggttt tcccggaagt ggtgcgcgag 900

atcgtgccgt tcatcatccg cccggacgaa agcaagccct acggcatgga cgtacgccgc 960

gagaacaagt cgttcatcga ggtggtcggc gagcagctgg gcgtcaagct gcgtgtggtc 1020

gagaccggcg gcaacagctt cgccgccgag cgcgagcagt gggatgacgg caacaacgtg 1080

gtggcgctgg agccaggtgt ggtcatcggc tacgaccgca acacctacac caataccttg 1140

ctgcgcaagg ccgggataga ggtcatcacc atcagtgccg gcgaactggg ccggggccgt 1200

ggcggcggcc actgcatgac ctgcccgatc gtgcgcgacc cgatcaacta ctaa 1254

Claims

1.优化药用蛋白的聚乙二醇修饰位点的分子改造方法，包括如下步骤(I)-(II)：

(I)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型待优化药用蛋白的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述药用蛋白为精氨酸脱亚胺酶。

3.精氨酸脱亚胺酶突变体，为精氨酸脱亚胺酶突变体A或精氨酸脱亚胺酶突变体B或精氨酸脱亚胺酶突变体C；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点和表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；其中，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸，将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体B为将野生型精氨酸脱亚胺酶中的聚乙二醇修饰位点处的氨基酸进行定点突变后得到的，将所述聚乙二醇修饰位点处的氨基酸全部或部分突变为赖氨酸；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体C将野生型精氨酸脱亚胺酶中的表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变后得到的；将所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体A和所述精氨酸脱亚胺酶突变体B中，所述聚乙二醇修饰位点均是按照如下(1)-(3)所示步骤从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选择出来的：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点。

4.权利要求3所述精氨酸脱亚胺酶突变体的制备方法，为如下方法一或方法二或方法三：

方法一：权利要求3中所述精氨酸脱亚胺酶突变体A的制备方法，包括如下步骤(A1)-(A3)：

(A1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点；

(A2)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点；

(A3)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点和所述表面活性剂耐受位点处的氨基酸进行定点突变，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体A；其中，所述聚乙二醇修饰位点处的突变为将所述聚乙二醇修饰位点中的全部或部分突变为赖氨酸，所述表面活性剂耐受位点处的突变为将所述表面活性剂耐受位点中的全部或部分突变为精氨酸或脯氨酸；

方法二：权利要求3中所述精氨酸脱亚胺酶突变体B的制备方法，包括如下步骤(B1)-(B2)：

(B1)按照如下(1)-(3)所示步骤从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出聚乙二醇修饰位点：(1)从所述野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中选出溶剂可及的精氨酸和组氨酸位点；(2)从(1)得到的氨基酸位点中选出突变为赖氨酸时ΔΔG<1.5kCa的氨基酸位点；(3)从(2)得到的氨基酸位点中选出pKa值小于10.7的氨基酸位点；

(B2)将所述野生型精氨酸脱亚胺酶中的所述聚乙二醇修饰位点处的全部或部分氨基酸突变为赖氨酸，得到所述精氨酸脱亚胺酶突变体B；

方法三：权利要求3中所述精氨酸脱亚胺酶突变体C的制备方法，包括如下步骤(C1)-(C2)：

(C1)从野生型精氨酸脱亚胺酶的所有氨基酸残基中筛选出表面活性剂耐受位点；

5.根据权利要求2或4所述的方法或权利要求3所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于：所述野生型精氨酸脱亚胺酶为来自于变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)的精氨酸脱亚胺酶；

具体的，所述野生型精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法或精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于：所述聚乙二醇修饰位点为所述野生型精氨酸脱亚胺酶的第299位精氨酸、第319位精氨酸、第338位精氨酸、第382位精氨酸、第55位组氨酸、第73位组氨酸、第118位组氨酸、第199位组氨酸和第218位组氨酸；

所述表面活性剂耐受位点为所述野生型精氨酸脱亚胺酶的第50、6、81、114、130、162、216、251、254、264、332和353位的谷氨酰胺。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法或精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于：所述精氨酸脱亚胺酶突变体A的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Gln130Arg/Gln216Arg/Gln353Arg/Arg299Lys；Gln264Arg/Gln332Arg/Arg382Lys；Gln50Arg/Arg299Lys/Arg382Lys；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体B的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Arg319Lys/His55Lys；Arg338Lys/His73Lys；Arg382Lys/His118Lys/His199Lys；Arg299Lys/Arg382Lys/His218Lys；

所述精氨酸脱亚胺酶突变体C的氨基酸序列与序列表中序列1相比，存在或仅存在如下任一所示突变组合：Gln6Pro/Gln50Arg；Gln50Arg；Gln81Arg/Gln114Arg/Gln251Arg；Gln130Arg/Gln216Arg/Gln353Arg；Gln162Arg/Gln254Arg；Gln264Arg/Gln332Arg；Gln50Arg/Gln162Arg/Gln353Arg。

8.精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，是通过将权利要求3-7任一中所述的精氨酸脱亚胺酶突变体A或精氨酸脱亚胺酶突变体B进行聚乙二醇修饰后得到的。

9.精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材料，为如下任一：

(I)权利要求3-7所述精氨酸脱亚胺酶突变体的编码基因；

10.应用，为如下A或B：

A、权利要求3-7中任一所述的精氨酸脱亚胺酶突变体或权利要求9所述的精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材在制备权利要求8所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物中的应用。

B、权利要求3-7中任一所述的精氨酸脱亚胺酶突变体或权利要求8所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物或权利要求9所述的精氨酸脱亚胺酶突变体相关生物材在制备抗癌药物中的应用。