CN103923898A - 一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，属于医药生物工程技术领域。本发明采用PEG修饰ADI，得到的ADI-PEG在体外和小鼠血浆中的稳定性得到明显提高。药代动力学/药效学研究表明：与修饰前的游离ADI相比，ADI-PEG在小鼠体内半衰期提高11倍以上；单次注射5UADI-PEG可降低并维持血浆中精氨酸浓度在极限水平5天以上，而未修饰的ADI仅能维持1天；对H22肝癌模型小鼠进行治疗，在15天的疗程后，ADI-PEG（15U）治疗组对癌细胞的抑制率达到95.02%，与使用5-氟尿嘧啶治疗的阳性对照组（抑制率98.34%）接近。本发明的PEG修饰酶ADI-PEG具有较高的体内半衰期和较低的免疫原性，是一种优良的治疗或抑制肿瘤的药物。

Description

一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，包括对重组蛋白精氨酸脱亚胺酶（ADI）的PEG化修饰方法及其修饰产物的体内外活性研究，还包括PEG化修饰方法的优化，修饰酶的体内外稳定性和肿瘤治疗方面的研究应用，属于医药生物工程技术领域。
背景技术
精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase，EC 3.5.3.6，简称ADI）是一种极具潜力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药，包括目前尚缺乏有效药物的肝细胞瘤（hepatocellular carcinomas，简称HCCs）以及黑素瘤（melanomas）。正常细胞所需精氨酸可经体内的尿素循环由精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）与精氨琥珀酸裂合酶（argininosuccinate lyase，ASL）共同作用催化瓜氨酸而生成。而精氨酸是生物体内合成绝大部分多肽及蛋白质的重要氨基酸。对于一些肿瘤细胞，因其缺少ASS而自身无法正常合成精氨酸，因此必须从外部环境中摄取精氨酸从而进行生长繁殖，这一类细胞被称之为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。
肝细胞瘤是世界第五大人类常见癌症，全世界每年约有60万人死于肝细胞癌。在中国，肝癌死亡率位居肿瘤死因第2位。其高死亡率的原因在于HCC易转移、易复发、诊断不及时和治疗手段不彻底等。肝癌患者在确诊后没有经过治疗其生存期平均为1-4个月。通过手术治疗HCC效果不佳，且术后易复发，因此临床上迫切需要一种治疗肝癌的新方法。
ADI应用于癌症治疗最近二十年来为人们所广泛关注并接受。2002年，Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇（PEG）化提高了ADI在体内的半衰期。2004年，他们将ADI-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为零。目前，美国凤凰公司开发的支原体来源的ADI-PEG-20制剂用于肝细胞癌和黑素瘤（药品名称分别为Hepacid和Melanocid）的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验正在全球多个中心进行。
本研究室通过筛选得到一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌（P. plecoglossicida）CGMCC No.2039，对该ADI编码基因进行克隆和重组表达，并对重组ADI进行蛋白质工程改造以改善其酶活和酶学性质（包括Km和最适pH等），获得了多个更适合于生理中性条件的ADI突变株。为进一步解决ADI蛋白在体内半衰期短的问题，本发明对ADI突变株进行PEG修饰，以获得在体内具有更高稳定性和持久半衰期的ADI-PEG酶。
发明内容
本发明的目的是提供具有良好的抗肿瘤活性，延长半衰期的PEG修饰的精氨酸脱亚胺酶。主要针对精氨酸脱亚胺酶在体内半衰期短的问题，提供一种新的精氨酸脱亚胺酶修饰酶ADI-PEG。
本发明的技术方案：本发明所涉及的精氨酸脱亚胺酶为来源于变形假单胞菌（P. plecoglossicida）CGMCC No.2039，在中国专利200710107822.X “一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用” 中已公开。精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中进行重组表达。
一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG；其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；ADI的基因全长1,254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa，重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。
所述ADI-PEG为ADI亚基与5-15个PEG分子的共价结合物；分别命名为ADI-SS-PEG20，ADI-SC-PEG20，ADI-SPA-PEG20；具有30%-70%的平均修饰率。
所述PEG修饰剂为mPEG-SS20 kDa，SS为琥珀酰亚胺琥珀酸酯；mPEG-SC20 kDa，SC为琥珀酰亚胺碳酸酯；mPEG-SPA20 kDa，SPA为琥珀酰亚胺丙酸酯。
所述PEG修饰剂的平均分子量为20000 Da。
所述PEG修饰的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，步骤为：
（1）重组ADI粗酶液的制备：取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6-8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量︰缓冲液重量比为1︰2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；超声波破碎过程为400W，超声1s，停止3s；
（2） 重组ADI的纯化：
a、HiTrapTM DEAE FF阴离子交换层析：使用HiTrapTM DEAE FF阴离子交换层析柱，平衡液为10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，洗脱液为10-100 mmol/L、pH 6.0-8.0磷酸钠缓冲液，其中含NaCl 0.1-1.0 mol/L；
洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度0.1-1.0 mol/L；确定目的蛋白峰，收集蛋白样品；
b、SuperdexTM 200凝胶过滤层析：采用SuperdexTM 200凝胶预装柱进行纯化，使用10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，其中含NaCl 0.05-0.5 mol/L；
取步骤a所得蛋白样品上样500μL，洗脱1.0-3.0个柱体积，确定目的蛋白峰并收集，得到重组ADI纯酶液；
（3）PEG修饰反应：用10-50mmol/L PBS缓冲液调整步骤（2）所得重组ADI纯酶液浓度为0.1-1.0mg/mL、pH 6.0-10.0；按照摩尔比1︰30-120分别加入三种PEG修饰剂，即mPEG-SS20 kDa，mPEG-SC20 kDa，mPEG-SPA20 kDa，于室温下搅拌反应1-4 h；将反应液加入100kDa的超滤管中，4000 r/min冷冻离心，每隔10 min加入10-100mmol/L PBS、pH 6.0-8.0进行滤洗，重复3-5次以除去游离PEG分子，即得产品PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG。
所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，所得到的ADI-SS-PEG20，ADI-SC-PEG20，ADI-SPA-PEG20，与未修饰的ADI相比，修饰酶体外酶活稳定性良好，在小鼠血浆中稳定性显著提高。
所述ADI-SPA-PEG20在15 U的注射剂量下对H22肝癌表现出95%以上的抑制率。
本发明的有益效果：本发明对来源于变形假单胞菌（P. plecoglossicida）的、在大肠杆菌中重组表达的ADI的多个优良突变株进行PEG修饰，可得到修饰度较均一的修饰产物ADI-PEG，反应产率接近100%。采用mPEG-SPA20 kDa修饰获得的ADI-SPA-PEG20具有较好的体外稳定性；在小鼠体内的PD/PK实验表明，ADI-SPA-PEG 20的血浆消除半衰期较ADI提高了11倍（单次静脉注射，5 U）。
本发明为获得优良的PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶提供了有效的制备方法，并对修饰酶ADI-PEG在小鼠体内的PD/PK和抗肝癌活性进行了研究，结果表明本发明的ADI-PEG是一种优良的治疗或抑制肿瘤的药物。
附图说明
图1是PEG修饰重组ADI反应产物SDS-PAGE图。M：蛋白marker，1：ADI-SPA-PEG20，2：ADI-SS-PEG20，3：ADI-SC-PEG20。
图2是单次静脉注射ADI和ADI-SPA-PEG20（5 U）的药代动力学图。
图3是各实验组小鼠H22肝肿瘤大小图。
具体实施方式
实施例1 ADI重组蛋白的纯化
（1）重组ADI粗酶液的制备：取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6-8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量︰缓冲液重量比为1︰2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；超声波破碎过程为400W，超声1s，停止3s；
（2）重组ADI的纯化：
溶液A：20 mmol/L、pH 7.0 磷酸钠缓冲液；
溶液B：20 mmol/L、pH 7.0 磷酸钠缓冲液，含1 mol/L NaCl；
溶液C：20 mmol/L、pH 7.0 磷酸钠缓冲液，含0.15 mol/L NaCl。
a、HiTrapTM DEAE FF阴离子交换层析：用溶液A平衡5个柱体积，上样完毕后用溶液A冲洗10个柱体积至基线。洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度500 mmol/L。收集洗脱峰，并检测各峰的ADI酶活，确定目的蛋白峰。纯化过程流速均为2.5 mL/min。
收集目的蛋白峰样品，使用10 kDa超滤管在4℃下离心浓缩10倍。
b、SuperdexTM 200凝胶过滤层析：使用溶液C平衡2个柱体积，取步骤a所得蛋白样品上样500 μL，使用溶液C洗脱1.5个柱体积，流速均为0.5 mL/min。收集各洗脱峰，跟踪测定各峰酶活，确定目的蛋白峰并收集。
（3）ADI酶活测定方法：
在980μL精氨酸底物溶液中加入20μL ADI酶液，在37℃水浴锅中反应30 min，随后迅速进行10 min沸水浴以终止酶促反应。
取20μL反应液加入1980μL去离子水中，再添加3mL混酸溶液及500μL二乙酰一肟-硫胺脲溶液，沸水浴显色反应10 min，结束后立即冷却。采用分光光度法测定反应液的OD530值，以空白对照样品标零。按照瓜氨酸标准曲线计算OD530对应的瓜氨酸含量，并计算酶活。
酶活力单位定义：37 ℃条件下，每分钟转化1μmol精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸所需的酶量定义为1 U。
 
实施例2  PEG修饰反应
用20 mmol/L PBS缓冲液调整ADI纯酶液浓度为0.5 mg/mL、pH 8.0。按照摩尔比1︰120分别加入三种PEG修饰剂（mPEG-SS20 kDa，mPEG-SC20 kDa，mPEG-SPA20 kDa），于室温下搅拌反应2 h。修饰产物SDS-PAGE分析见图1。
对修饰产物进行酶活测定和修饰率测定，分子量测定（SDS-PAGE），结果见表1。
表1  不同ADI-PEG的酶活及修饰率
实施例3  ADI-SPA-PEG20 的PD/PK研究
ADI-SPA-PEG20药理学参数测定：
（1）实验组设置：
ADI：静脉注射组，肌肉注射组，皮下注射组；
ADI-SPA-PEG20：静脉注射组；肌肉注射组；皮下注射组。
每组3只小鼠作为平行实验，注射3种药剂量，分别为5 U/只，1 U/只，0.2 U/只。取样时间为注射后1小时，之后每天固定时间点取样一次，连续7天。
采血部位：尾静脉。
（2）药效动力学（Pharmacodynamics）参数测定
血清样品处理：在血清样品中按1︰1体积比加入10%磺基水杨酸溶液，搅拌混匀，于4℃中静置6 h，10000 r/min离心10 min，取上清。
检测方法：使用氨基酸分析仪检测样品中精氨酸与瓜氨酸浓度。
（3）药代动力学（Pharmacokinetics）参数测定
检测方法：测定血清样品中ADI残余酶活。
于昆明小鼠体内单次注射5 U ADI及ADI-SPA-PEG20，分析ADI及ADI-SPA-PEG20对小鼠血液中精氨酸的降解作用，结果见图2。
于各别昆明小鼠体内分别单次注射5 U ADI及ADI-SPA-PEG20，分析ADI与ADI-SPA-PEG20在小鼠体内的残余酶活，通过软件分析其药代动力学参数，结果见表2。
表2  ADI与ADI-SPA-PEG20的药代动力学参数（单次注射5 U）
实施例4小鼠异位移植性肝细胞癌（H22）模型的治疗
小鼠H22肝癌模型的建立与治疗：
（1）细胞株复苏
从液氮罐中取出肝癌细胞（H22）腹水冻存管，迅速放入37℃水浴中，摇动30 s至1 min，使其快速融化。用70%酒精擦拭消毒冻存管，用灭菌后吸管将细胞悬液吸入一个无菌离心管中，再往离心管中加入无菌生理盐水，调整浓度为1×107细胞/mL。
（2）体内传代培养
取0.3 mL（3.0×106细胞）注入昆明小鼠腹腔内，7天后形成腹水，置于显微镜下观察细胞形态，进行分类计数，其中瘤细胞数应>95%，用无菌生理盐水进行稀释，将细胞浓度调整为1×107细胞/mL。
（3）接种
取60只昆明小鼠，6周龄左右，每只小鼠于右腋皮下接种0.2 mL（2×106细胞）细胞悬液，整个过程均在无菌环境下操作完成，接种后回笼继续饲养。
2-3天后，观察肿瘤大小长到5 mm（直径）左右时，将未接种成功小鼠挑出，最终留用48只接种成功的荷瘤小鼠进行分组并用苦味酸溶液标记。每组8只荷瘤小鼠，最终每组取5-6只作为有效数据。
（4）小鼠治疗方案：
治疗药物：5-氟尿嘧啶（5-FU），ADI，ADI-SPA-PEG20
实验组设置如下：
模型组：不注射药物治疗；阳性组：注射5-FU化疗药物；ADI组：注射ADI蛋白；ADI-SPA-PEG20组：高（15 U）、中（3 U）、低（0.6 U）三个剂量组，注射相应剂量ADI-SPA-PEG20。另一组正常组小鼠未接种肝癌细胞，作为平均体重对照组。
给药方式：根据药物半衰期进行连续给药，ADI与化疗药物5-氟尿嘧啶为每天给药一次，ADI-SPA-PEG20为5天给药一次。
于给药15天后对小鼠禁食，停药24 h后引颈处死荷瘤小鼠，剥离瘤块，称重并计算肿瘤抑制率。
瘤重的测量中，每组舍弃2只瘤重严重偏离平均重量的小鼠，尽可能降低因接种过程中瘤细胞分布不均造成的误差。
表3  H22肝细胞癌体内实验实验组设置
 
根据图3中各组别肿瘤重量，计算出ADI及ADI-SPA-PEG20对H22肿瘤的抑制率，如表4。
表4  ADI-SPA-PEG20不同给药剂量对肿瘤的抑制
<160> 5
<210>  SEQ ID NO: 1
<211>  417
<212>  PRT
<213> ADI突变株M314
 
<400>  1
Met Ser Ala Glu Lys  Gln Lys Tyr Gly Val  His Ser Glu Ala Gly
                  5                   10                   15
Lys Leu Arg Lys Val  Met Val Cys Ala Pro  Gly Leu Ala His Lys
                 20                   25                   30
Arg Leu Thr Pro Ser  Asn Cys Asp Glu Leu  Leu Phe Asp Asp Val
                 35                   40                   45
Ile Trp Val Asp Gln  Ala Lys Arg Asp His  Phe Asp Phe Val Thr
                 50                   55                   60
Lys Met Arg Glu Arg  Gly Val Asp Val Leu  Glu Met His Asn Leu
                 65                   70                   75
Leu Thr Asp Ile Val  Gln Asn Pro Glu Ala  Leu Lys Trp Ile Leu
                 80                   85                   90
Asp Arg Lys Ile Thr  Pro Asp Thr Val Gly  Val Gly Leu Thr Asn
                 95                  100                  105
Glu Val Arg Ser Trp  Leu Glu Gly Gln Glu  Pro Arg His Leu Ala
                110                  115                  120
Glu Phe Leu Ile Gly  Gly Val Thr Gly Gln  Asp Leu Pro Glu Ser
                125                  130                  135
Glu Gly Ala Ser Val  Val Lys Met Tyr Asn  Asp Tyr Leu Gly His
                140                  145                  150
Ser Ser Phe Ile Leu  Pro Pro Leu Pro Asn  Thr Gln Phe Thr Arg
                155                  160                  165
Asp Thr Thr Cys Trp  Ile Tyr Gly Gly Val  Thr Leu Asn Pro Met
                170                  175                  180
Tyr Trp Pro Ala Arg  Arg Gln Glu Thr Leu  Leu Thr Thr Ala Ile
                185                  190                  195
Tyr Lys Phe His Pro  Glu Phe Thr Lys Ala  Asp Phe Gln Val Trp
                200                  205                  210
Tyr Gly Asp Pro Asp  Gln Glu His Gly Gln  Ala Thr Leu Glu Gly
                215                  220                  225
Gly Asp Val Met Pro  Ile Gly Lys Gly Ile  Val Leu Ile Gly Met
                230                  235                  240
Gly Glu Arg Thr Ser  Arg Gln Ala Ile Gly  Gln Leu Ala Gln Asn
                245                  250                  255
Leu Phe Ala Lys Gly  Ala Val Glu Gln Val  Ile Val Ala Gly Leu
                260                  265                  270
Pro Lys Ser Arg Ala  Ala Met His Leu Asp  Thr Val Phe Ser Phe
                275                  280                  285
Cys Asp Arg Asp Leu  Val Thr Val Phe Pro  Glu Val Val Arg Glu
                290                  295                  300
Ile Val Pro Phe Ile  Ile Arg Pro Asp Glu  Ser Lys Pro Tyr Gly
                305                  310                  315
Met Asp Val Arg Arg  Glu Asn Lys Ser Phe  Ile Glu Val Val Gly
                320                  325                  330
Glu Gln Leu Gly Val  Lys Leu Arg Val Val  Glu Thr Gly Gly Asn
                335                  340                  345
Ser Phe Ala Ala Glu  Arg Glu Gln Trp Asp  Asp Gly Asn Asn Val
                350                  355                  360
Val Ala Leu Glu Pro  Gly Val Val Ile Gly  Tyr Asp Arg Asn Thr
                365                  370                  375
Tyr Thr Asn Thr Leu  Leu Arg Lys Ala Gly  Ile Glu Val Ile Thr
                380                  385                  390
Ile Ser Ala Gly Glu  Leu Gly Arg Gly Arg  Gly Gly Gly Arg Cys
                395                  400                  405
Met Thr Cys Pro Leu  Val Arg Asp Pro Ile  Asn  Tyr  *
                410                  415       417
 
 
<210>  SEQ ID NO: 2
<211>  417
<212>  PRT
<213> ADI突变株M13
 
<400>  2
Met Ser Ala Glu Lys  Gln Lys Tyr Gly Val  His Ser Glu Ala Gly
                     5                       10                       15
Lys Leu Arg Lys Val  Met Val Cys Ala Pro  Gly Leu Ala His Lys
                    20                       25                      30
Arg Leu Thr Pro Ser  Asn Cys His Glu Leu  Leu Phe Asp Asp Val
                    35                       40                      45
Ile Trp Val Asp Gln  Ala Lys Arg Asp His  Phe Asp Phe Val Thr
                    50                       55                      60
Lys Met Arg Glu Arg  Gly Val Asp Val Leu  Glu Met His Asn Leu
                    65                       70                      75
Leu Thr Asp Ile Val  Gln Asn Pro Glu Ala  Leu Lys Trp Ile Leu
                    80                       85                      90
Asp Arg Lys Ile Thr  Pro Asp Thr Val Gly  Val Gly Leu Thr Asn
                    95                      100                     105
Glu Val Arg Ser Trp  Leu Glu Gly Gln Glu  Pro Arg His Leu Ala
                   110                      115                     120
Glu Phe Leu Ile Gly  Gly Val Thr Gly Gln  Asp Leu Pro Glu Ser
                   125                      130                     135
Glu Gly Ala Ser Val  Val Lys Met Tyr Asn  Asp Tyr Leu Gly His
                   140                     145                      150
Ser Ser Phe Ile Leu  Pro Pro Leu Pro Asn  Thr Gln Phe Thr Arg
                   155                     160                      165
Asp Thr Thr Cys Trp  Ile Tyr Gly Gly Val  Thr Leu Asn Pro Met
                   170                     175                      180
Tyr Trp Pro Ala Arg  Arg Gln Glu Thr Leu  Leu Thr Thr Ala Ile
                   185                     190                      195
Tyr Lys Phe His Pro  Glu Phe Thr Lys Ala  Asp Phe Gln Val Trp
                   200                     205                      210
Tyr Gly Asp Pro Asp  Gln Glu His Gly Gln  Ala Thr Leu Glu Gly
                   215                     220                      225
Gly Asp Val Met Pro  Ile Gly Lys Gly Ile  Val Leu Ile Gly Met
                   230                     235                      240
Gly Glu Arg Thr Ser  Arg Gln Ala Ile Gly  Gln Leu Ala Gln Asn
                   245                     250                      255
Leu Phe Ala Lys Gly  Ala Val Glu Gln Val  Ile Val Ala Gly Leu
                   260                     265                      270
Pro Lys Ser Arg Ala  Ala Met His Leu Asp  Thr Val Phe Ser Phe
                   275                     280                      285
Cys Asp Arg Asp Leu  Val Thr Val Phe Pro  Lys Val Val Arg Glu
                   290                     295                      300
Ile Val Pro Phe Ile  Ile Arg Pro Asp Glu  Ser Lys Pro Tyr Gly
                   305                     310                      315
Met Asp Val Arg Arg  Glu Asn Lys Ser Phe  Ile Glu Val Val Gly
                   320                     325                      330
Glu Gln Leu Gly Val  Lys Leu Arg Val Val  Glu Thr Gly Gly Asn
                   335                     340                      345
Ser Phe Ala Ala Glu  Arg Glu Gln Trp Asp  Asp Gly Asn Asn Val
                   350                     355                      360
Val Ala Leu Glu Pro  Gly Val Val Ile Gly  Tyr Asp Arg Asn Thr
                   365                     370                      375
Tyr Thr Asn Thr Leu  Leu Arg Lys Ala Gly  Ile Glu Val Ile Thr
                   380                     385                      390
Ile Ser Ala Gly Glu  Leu Gly Arg Gly Arg  Gly Gly Gly Arg Cys
                   395                     400                      405
Met Thr Cys Pro Leu  Val Arg Asp Pro Ile  Asn  Tyr  *
                   410                     415         417
 
 
<210>  SEQ ID NO: 3
<211>  417
<212>  PRT
<213> ADI突变株M13-1
 
<400>  3
Met Ser Ala Glu Lys  Gln Lys Tyr Gly Val  His Ser Glu Ala Gly
                     5                       10                       15
Lys Leu Arg Lys Val  Met Val Cys Ala Pro  Gly Leu Ala His Lys
                    20                      25                        30
Arg Leu Thr Pro Ser  Asn Cys His Glu Leu  Leu Phe Asp Asp Val
                    35                       40                      45
Ile Trp Val Asp Gln  Ala Lys Arg Asp His  Phe Asp Phe Val Thr
                    50                       55                      60
Lys Met Arg Glu Arg  Gly Val Asp Val Leu  Glu Met His Asn Leu
                    65                       70                      75
Leu Thr Asp Ile Val  Gln Asn Pro Glu Ala  Leu Lys Trp Ile Leu
                    80                       85                      90
Asp Arg Lys Ile Thr  Pro Asp Thr Val Gly  Val Gly Leu Thr Asn 
                    95                      100                     105
Glu Val Arg Ser Trp  Leu Glu Gly Gln Glu  Pro Arg His Leu Ala
                   110                      115                     120
Glu Phe Leu Ile Gly  Gly Val Thr Gly Gln  Asp Leu Pro Glu Ser
                   125                      130                     135
Glu Gly Ala Ser Val  Val Lys Met Tyr Asn  Asp Tyr Leu Gly His
                   140                      145                     150
Ser Ser Phe Ile Leu  Pro Pro Leu Pro Asn  Thr Gln Phe Thr Arg
                   155                     160                      165
Asp Thr Thr Cys Trp  Ile Tyr Gly Gly Val  Thr Leu Asn Pro Met
                   170                     175                      180
Tyr Trp Pro Ala Arg  Arg Gln Glu Thr Leu  Leu Thr Thr Ala Ile
                   185                     190                      195
Tyr Lys Phe His Pro  Glu Phe Thr Lys Ala  Asp Phe Gln Val Trp
                   200                     205                      210
Tyr Gly Asp Pro Asp  Gln Glu His Gly Gln  Ala Thr Leu Glu Gly
                   215                     220                      225
Gly Asp Val Met Pro  Ile Gly Lys Gly Ile  Val Leu Ile Gly Met
                   230                     235                      240
Gly Glu Arg Thr Ser  Arg Gln Ala Ile Gly  Gln Leu Ala Gln Asn
                   245                     250                      255
Leu Phe Ala Lys Gly  Ala Val Glu Gln Val  Ile Val Ala Gly Leu
                   260                     265                      270
Pro Arg Ser Arg Ala  Ala Met His Leu Asp  Thr Val Phe Ser Phe
                   275                     280                      285
Cys Asp Arg Asp Leu  Val Thr Val Phe Pro  Lys Val Val Arg Glu
                   290                     295                      300
Ile Val Pro Phe Ile  Ile Arg Pro Asp Glu  Ser Lys Pro Tyr Gly
                   305                     310                      315
Met Asp Val Arg Arg  Glu Asn Lys Ser Phe  Ile Glu Val Val Gly
                   320                     325                      330
Glu Gln Leu Gly Val  Lys Leu Arg Val Val  Glu Thr Gly Gly Asn
                   335                     340                      345
Ser Phe Ala Ala Glu  Arg Glu Gln Trp Asp  Asp Gly Asn Asn Val
                   350                     355                      360
Val Ala Leu Glu Pro  Gly Val Val Ile Gly  Tyr Asp Arg Asn Thr
                   365                     370                      375
Tyr Thr Asn Thr Leu  Leu Arg Lys Ala Gly  Ile Glu Val Ile Thr
                   380                     385                      390
Ile Ser Ala Gly Glu  Leu Gly Arg Gly Arg  Gly Gly Gly Arg Cys
                   395                     400                      405
Met Thr Cys Pro Leu  Val Arg Asp Pro Ile  Asn  Tyr  *
                   410                     415        417
 
 
<210>  SEQ ID NO: 4
<211>  417
<212>  PRT
<213> ADI突变株M13-2
 
<400>  4
Met Ser Ala Glu Lys  Gln Lys Tyr Gly Val  His Ser Glu Ala Gly
                     5                       10                       15
Lys Leu Arg Lys Val  Met Val Cys Ala Pro  Gly Leu Ala His Lys
                    20                       25                       30
Arg Leu Thr Pro Ser  Asn Cys His Glu Leu  Leu Phe Asp Asp Val
                    35                       40                       45
Ile Trp Val Asp Gln  Ala Lys Arg Asp His  Phe Asp Phe Val Thr
                    50                       55                      60
Lys Met Arg Glu Arg  Gly Val Asp Val Leu  Glu Met His Asn Leu
                    65                       70                      75
Leu Thr Asp Ile Val  Gln Asn Pro Glu Ala  Leu Lys Trp Ile Leu
                    80                       85                      90
Asp Arg Lys Ile Thr  Pro Asp Thr Val Gly  Val Gly Leu Thr Asn
                    95                      100                     105
Glu Val Arg Ser Trp  Leu Glu Gly Gln Glu  Pro Arg His Leu Ala
                   110                     115                      120
Glu Phe Leu Ile Gly  Gly Val Thr Gly Gln  Asp Leu Pro Glu Ser
                   125                     130                      135
Glu Gly Ala Ser Val  Val Lys Met Tyr Asn  Asp Tyr Leu Gly His
                   140                     145                      150
Ser Ser Phe Ile Leu  Pro Pro Leu Pro Asn  Thr Gln Phe Thr Arg
                   155                     160                      165
Asp Thr Thr Cys Trp  Ile Tyr Gly Gly Val  Thr Leu Asn Pro Met
                   170                     175                      180
Tyr Trp Pro Ala Arg  Arg Gln Glu Thr Leu  Leu Thr Thr Ala Ile
                   185                     190                      195
Tyr Lys Phe His Pro  Glu Phe Thr Lys Ala  Asp Phe Gln Val Trp
                   200                     205                      210
Tyr Gly Asp Pro Asp  Gln Glu His Gly Gln  Ala Thr Leu Glu Gly
                   215                     220                      225
Gly Asp Val Met Pro  Ile Gly Lys Gly Ile  Val Leu Ile Gly Met
                   230                     235                      240
Gly Glu Arg Thr Asp  Arg Gln Ala Ile Gly  Gln Leu Ala Gln Asn
                   245                     250                      255
Leu Phe Ala Lys Gly  Ala Val Glu Gln Val  Ile Val Ala Gly Leu
                   260                     265                      270
Pro Lys Ser Arg Ala  Ala Met His Leu Asp  Thr Val Phe Ser Phe
                   275                     280                      285
Cys Asp Arg Asp Leu  Val Thr Val Phe Pro  Lys Val Val Arg Glu
                   290                     295                      300
Ile Val Pro Phe Ile  Ile Arg Pro Asp Glu  Ser Lys Pro Tyr Gly
                   305                     310                      315
Met Asp Val Arg Arg  Glu Asn Lys Ser Phe  Ile Glu Val Val Gly
                   320                     325                      330
Glu Gln Leu Gly Val  Lys Leu Arg Val Val  Glu Thr Gly Gly Asn
                   335                     340                      345
Ser Phe Ala Ala Glu  Arg Glu Gln Trp Asp  Asp Gly Asn Asn Val
                   350                     355                      360
Val Ala Leu Glu Pro  Gly Val Val Ile Gly  Tyr Asp Arg Asn Thr
                   365                     370                      375
Tyr Thr Asn Thr Leu  Leu Arg Lys Ala Gly  Ile Glu Val Ile Thr
                   380                     385                      390
Ile Ser Ala Gly Glu  Leu Gly Arg Gly Arg  Gly Gly Gly Arg Cys
                   395                     400                      405
Met Thr Cys Pro Leu  Val Arg Asp Pro Ile  Asn Tyr  *
                   410                     415       417
 
 
<210>  SEQ ID NO: 5
<211>  417
<212>  PRT
<213> ADI突变株M13-3
 
<400>  5
Met Ser Ala Glu Lys  Gln Lys Tyr Gly Val  His Ser Glu Ala Gly
                     5                       10                      15
Lys Leu Arg Lys Val  Met Val Cys Ala Pro  Gly Leu Ala His Lys
                    20                       25                      30
Arg Leu Thr Pro Ser  Asn Cys His Glu Leu  Leu Phe Asp Asp Val
                    35                       40                      45
Ile Trp Val Asp Gln  Ala Lys Arg Asp His  Phe Asp Phe Val Thr
                    50                       55                      60
Lys Met Arg Glu Arg  Gly Val Asp Val Leu  Glu Met His Asn Leu
                    65                       70                      75
Leu Thr Asp Ile Val  Gln Asn Pro Glu Ala  Leu Lys Trp Ile Leu
                    80                       85                      90
Asp Arg Lys Ile Thr  Pro Asp Thr Val Gly  Val Gly Leu Thr Asn
                    95                      100                     105
Glu Val Arg Ser Trp  Leu Glu Gly Gln Glu  Pro Arg His Leu Ala
                   110                     115                      120
Glu Phe Leu Ile Gly  Gly Val Thr Gly Gln  Asp Leu Pro Glu Ser
                   125                     130                      135
Glu Gly Ala Ser Val  Val Lys Met Tyr Asn  Asp Tyr Leu Gly His
                  140                      145                      150
Ser Ser Phe Ile Leu  Pro Pro Leu Pro Asn  Thr Ser Phe Thr Arg
                   155                     160                      165
Asp Thr Thr Cys Trp  Ile Tyr Gly Gly Val  Thr Leu Asn Pro Met
                   170                     175                      180
Tyr Trp Pro Ala Arg  Arg Gln Glu Thr Leu  Leu Thr Thr Ala Ile
                   185                     190                      195
Tyr Lys Phe His Pro  Glu Phe Thr Lys Ala  Asp Phe Gln Val Trp
                   200                     205                      210
Tyr Gly Asp Pro Asp  Gln Glu His Gly Gln  Ala Thr Leu Glu Gly
                   215                     220                      225
Gly Asp Val Met Pro  Ile Gly Lys Gly Ile  Val Leu Ile Gly Met
                   230                     235                      240
Gly Glu Arg Thr Ser  Arg Gln Ala Ile Gly  Gln Leu Ala Gln Asn
                   245                     250                      255
Leu Phe Ala Lys Gly  Ala Val Glu Gln Val  Ile Val Ala Gly Leu
                   260                     265                      270
Pro Lys Ser Arg Ala  Ala Met His Leu Asp  Thr Val Phe Ser Phe
                   275                     280                      285
Cys Asp Arg Asp Leu  Val Thr Val Phe Pro  Lys Val Val Arg Glu
                   290                     295                      300
Ile Val Pro Phe Ile  Ile Arg Pro Asp Glu  Ser Lys Pro Tyr Gly
                   305                     310                      315
Met Asp Val Arg Arg  Glu Asn Lys Ser Phe  Ile Glu Val Val Gly
                   320                     325                      330
Glu Gln Leu Gly Val  Lys Leu Arg Val Val  Glu Thr Gly Gly Asn
                   335                     340                      345
Ser Phe Ala Ala Glu  Arg Glu Gln Trp Asp  Asp Gly Asn Asn Val
                   350                     355                      360
Val Ala Leu Glu Pro  Gly Val Val Ile Gly  Tyr Asp Arg Asn Thr
                   365                     370                      375
Tyr Thr Asn Thr Leu  Leu Arg Lys Ala Gly  Ile Glu Val Ile Thr
                   380                     385                      390
Ile Ser Ala Gly Glu  Leu Gly Arg Gly Arg  Gly Gly Gly Arg Cys
                   395                     400                      405
Met Thr Cys Pro Leu  Val Arg Asp Pro Ile  Asn  Tyr  *
                   410                     415        417
 

Claims (6)

1.一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG；其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；ADI的基因全长1,254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa，重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。
2.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：所述ADI-PEG为ADI亚基与5-15个PEG分子的共价结合物；分别命名为ADI-SS-PEG20，ADI-SC-PEG20，ADI-SPA-PEG20；具有30%-70%的平均修饰率。
3.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：所述PEG修饰剂为mPEG-SS20 kDa，SS为琥珀酰亚胺琥珀酸酯；mPEG-SC20 kDa，SC为琥珀酰亚胺碳酸酯；mPEG-SPA20 kDa，SPA为琥珀酰亚胺丙酸酯；所述PEG修饰剂的平均分子量为20000 Da。
4.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）重组ADI粗酶液的制备：取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6-8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量︰缓冲液重量比为1︰2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；
（2）重组ADI的纯化：
a、HiTrapTM DEAE FF阴离子交换层析：使用HiTrapTM DEAE FF阴离子交换层析柱，平衡液为10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，洗脱液为10-100 mmol/L、pH 6.0-8.0磷酸钠缓冲液，其中含NaCl 0.1-1.0 mol/L；
洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度0.1-1.0 mol/L；确定目的蛋白峰，收集蛋白样品；
b、SuperdexTM 200凝胶过滤层析：采用SuperdexTM 200凝胶预装柱进行纯化，使用10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，其中含NaCl 0.05-0.5 mol/L；
取步骤a所得蛋白样品上样500μL，洗脱1.0-3.0个柱体积，确定目的蛋白峰并收集，得到重组ADI纯酶液；
（3）PEG修饰反应：用10-50mmol/L PBS缓冲液调整步骤（2）所得重组ADI纯酶液浓度为0.1-1.0mg/mL、pH 6.0-10.0；按照摩尔比1︰30-120分别加入三种PEG修饰剂，即mPEG-SS20 kDa，mPEG-SC20 kDa，mPEG-SPA20 kDa，于室温下搅拌反应1-4 h；将反应液加入100kDa的超滤管中，4000 r/min冷冻离心，每隔10 min加入10-100mmol/L PBS、pH 6.0-8.0进行滤洗，重复3-5次以除去游离PEG分子，即得产品PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG。
5.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于：所得到的ADI-SS-PEG20，ADI-SC-PEG20，ADI-SPA-PEG20，与未修饰的ADI相比，修饰酶体外酶活稳定性良好，在小鼠血浆中稳定性显著提高。
6.根据权利要求5所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于：所述ADI-SPA-PEG20在15 U的注射剂量下对H22肝癌表现出95%以上的抑制率。
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