CN101812438B - 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 - Google Patents
一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101812438B CN101812438B CN201010132859.XA CN201010132859A CN101812438B CN 101812438 B CN101812438 B CN 101812438B CN 201010132859 A CN201010132859 A CN 201010132859A CN 101812438 B CN101812438 B CN 101812438B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- arginine deiminase
- leu
- mutant
- glu
- lys
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明涉及一种部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用。本发明的精氨酸脱亚胺酶突变体具有降解精氨酸为胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列与具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的精氨酸脱亚胺酶相比，含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突变中的一种或多种的组合。本发明的精氨酸脱亚胺酶突变体相比天然精氨酸脱亚氨酶，经PEG修饰后，活性残留保持率提高，且由于赖氨酸的数目减少，产物更均一，可应用于肝细胞瘤、黑色素瘤等的临床治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用。
背景技术
正常细胞的生长不需要精氨酸，因为它们能通过由精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase，ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，AL)催化的一个两步反应从胍氨酸合成精氨酸：然而肝细胞瘤(hepatocellularcarcinomas，HCC)、黑色素瘤(melanomas)和其他一些的肉瘤不表达精氨琥珀酸合成酶，因而它们是精氨酸的营养缺陷型，只能在含有精氨酸的环境中生长；在降解精氨酸的酶类存在条件下，精氨酸被清除使得这类肿瘤细胞进入“饥饿”状态，进而其生长被抑制。因此，精氨酸降解酶可以作为肝癌、黑色素瘤等疾病的潜在临床药物。精氨酸脱亚氨酶(argininedeiminase，ADI)能催化精氨酸向胍氨酸的转化，可被用来清除精氨酸。从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中提取的精氨酸脱亚胺酶(pADI)，在体外可以有效杀死肿瘤细胞(JonesJB，The effect of arginine deiminase on murine leukemia lymphoblasts(Ph.D.dissertation)，Oklahoma City，OK，University of Oklahoma，1981)，特别是肝癌和黑色素瘤相关的肿瘤细胞，但是从恶臭假单胞菌中提取的pADI在体内却没能表现出其应有的作用，研究发现是因为pADI在中性pH下几乎没有酶活性，并且因为恶臭假单胞菌中提取的pADI对实验动物来说具有很强的免疫原性，进入机体后以后很容易诱导生成抗体，形成抗原-抗体免疫复合物从实验动物的血液循环中被快速清除。
Takaku等(Haruo Takaku et al.，In vivo anti-tumor activity of arginine deiminase purifiedfrom Mycoplasma arginini，Int J Cancer.，51：244-249，1992)从支原体(Mycoplasma arginini)中分离出另一种精氨酸脱亚胺酶(aADI)。与恶臭假单胞菌来源的pADI不同，aADI在pH6.0-7.5表现出最高活性，并且在中性pH下非常稳定。但是，与pADI一样，来源于低等微生物的精氨酸脱亚胺酶由于具有很强的抗原性，易于被人体通过循环系统迅速清除。
蛋白质经化学修饰(如PEG修饰、明胶、多糖修饰等)后，可以有效地屏蔽蛋白质表面的抗原表位，降低或消除蛋白质本身固有的免疫原性，且修饰后的蛋白质分子量增大，可延长体内的清除速率，提高其半衰期，因而蛋白质修饰是解决免疫原性的优选方法。聚乙二醇PEG(Polyethylene glycol)已被确认为一种安全的蛋白质化学修饰试剂，一些用PEG修饰的药物已在临床上使用。但是，对于用PEG修饰的蛋白，包括精氨酸脱亚胺酶，L-天冬酰胺酶等都会导致酶活性的下降，甚至完全丧失(Mehvar R，Modulation of thepharmacokinetics and pharmacodynamics of proteins by polyethylene glycol conjugation，J.Pharm Pharmaceut Sci.，3：125-136，2000)。Holtsberg FW等(Holtsberg FW et al.，Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase：effects of PEG formulations on itspharmacological properties，J Control Release.80：259-271，2002)在研究聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶时发现，当一个精氨酸脱亚氨酶结合8-10个PEG20000分子时，其酶活性仅保留了不到50％，进一步修饰，当结合的PEG分子超过20个时，其活性基本完全丧失，因此，对于该类蛋白质，需在活性保留和蛋白质PEG修饰率之间进行优选和平衡，才能达到药物的临床要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的问题，提供一种Mycoplasma arginini来源的部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用。
常规的PEG修饰不但导致被修饰蛋白活性的下降，而且由于不能控制修饰的位点，导致产物都是不均一的混合物。Wang YS等(Wang YS et al.，Structural and biologicalcharacterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications，Adv Drug Deliv Rev.，54：547-570，2002)研究重组人干扰素α2a(IFNα2a)的PEG修饰时发现，当用12KD succinimidyl carbonate PEG(SC-PEG)修饰时，IFNα2a分子中包括N端氨基，Lys，His等共有14个基团可能被修饰，对于单修饰的PEG-IFNα2a，最终分析证明修饰制备所得的PEG-IFNα2a是由14种不同位点结合有一个PEG分子组成的混合物，而且这14种PEG-IFNα2a的活性是不一致的，其相对生物学活性最高保留了37％，最低仅保留了6％。因而，一个可能实施的方案，是通过基因突变，尽量减少精氨酸脱亚胺酶上赖氨酸残基的数目，减少PEG修饰后活性大量损失的可能性以及不均一带来的产物批次间的差异。
本发明的第一个方面是提供一种精氨酸脱亚胺酶突变体，具有降解精氨酸为胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列与氨基酸序列为SEQ ID NO：1的精氨酸脱亚胺酶相比，含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突变中的一种或多种的组合。例如，对于K9N突变，可以是精氨酸脱亚胺酶含有单独的K9N突变，也可以是含有K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突变中的一种或多种与K9N突变的组合。
更佳的，所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I，K209G，K243E，K249D，K279Y突变。优选的，所述精氨酸脱亚胺酶突变体具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
本发明实施例具体列举了同时含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突变及各点单突变的突变体，鉴于同时发生这15个赖氨酸突变的突变体仍能保持降解精氨酸的活性，本技术领域的技术人员可知，这些突变对精氨酸脱亚胺酶的降解精氨酸活性基本没有影响，因此即使只发生了这15个赖氨酸中的一种或多种的突变，获得的突变体也仍然能保持降解精氨酸的酶活性。
进一步的，上述精氨酸脱亚胺酶突变体经一种低免疫原性或无免疫原性的聚合物修饰，从而获得一种低/无免疫原性的聚合物-精氨酸脱亚胺酶突变体。
所述无免疫原性的聚合物可以是天然来源的，如明胶，葡聚糖，也可以是人工合成的，如聚乙二醇。
在本发明的实施例中，聚乙二醇的分子量为从约5000到40,000。优选地，从约20,00到40,000，最优选地为20,000。上述这些聚合物能够通过连接基团与精氨酸脱亚胺酶突变体序列中的Lys的ε-氨基和N端的α-氨基结合。连接基团可以是任何生物相容性基团，包括但不限于：EDC、戊二醛、酯基、醛基、酰胺基、氨基甲酸酯基、顺丁烯二酰亚胺基团等。在本发明的实施例中，生物相容性基团是羟琥珀酰亚胺或醛基。
采用本发明的方法，上述聚合物可以通过连接基团与精氨酸脱亚胺酶突变体序列中的所有Lys的ε-氨基和N端的α-氨基结合，具有SEQ ID NO：2序列的精氨酸脱亚胺酶突变体经线性PEG20000修饰后(结合了约11个PEG20000分子)，其酶活性约为17U/mg，活性保留率为55％，远高于同样条件下未突变精氨酸脱亚胺酶被同样条件修饰后的活性，具体见实施例5。
本发明第二方面，公开了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述精氨酸脱亚胺酶突变体。
进一步的，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
本发明第三方面，公开了含有前述的多核苷酸的序列的表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含精氨酸脱亚胺酶突变体的编码序列和合适的转录/翻译控制信号的重组表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。重组表达载体可以是本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。本发明实施例具体列举了以pET39b作为载体。
本发明第四方面，公开了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有前述表达载体、或者染色体中整合有前述多核苷酸。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；CHO等。用重组表达载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用如CaCl2等法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。本发明实施例具体列举了以大肠杆菌BL21DE3作为宿主细胞。
本发明第五方面，公开了一种制备所述精氨酸脱亚胺酶突变体的方法，该方法包括：：(1)用含有编码精氨酸脱亚胺酶突变体的多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
宿主细胞可以用常规方法培养表达本发明的精氨酸脱亚胺酶突变体。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理、离心、渗透破菌、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的第六个方面，公开了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的精氨酸脱亚胺酶突变体(修饰或未修饰聚合物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：缓冲液、氨基酸、糖类、注射用水及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。此外，本发明的聚合物-raADI还可与其他治疗剂一起使用。
本发明第七个方面提供了上述精氨酸脱亚胺酶突变体(修饰或未修饰聚合物)在制备治疗病毒感染、肿瘤以及阿尔茨海莫氏病的药物中的应用。
本发明的化合物的治疗有效量是能有效地抑制肿瘤生长的量。通常，治疗以小剂量开始，然后逐渐增加剂量直至达到完全分解机体内的精氨酸。通常，本发明的化合物的治疗剂量可以是从约5到30U/kg，每2天一次到大约每两周一次。
已有报道表明ADI通过降解精氨酸而体现出抗病毒的效果(Clark MikeA.，United StatesPatent 7204980：Methods for inhibiting viral replication in vivo)以及阿尔茨海莫氏病的治疗(Louw C et al.，Arginine deiminases：Therapeutic tools in the etiology and pathogenesis ofAlzheimer’s disease，J Enzyme Inhib Med Chem.，22：121-126，2007)，而本发明所制备的raADI-Lys-和PEG-raADI-Lys-具有相同的效果，而且具有更好的安全性，因此同样的，本发明所制备的raADI-Lys-和PEG-raADI-Lys-也可以用于这些领域。
本发明的突变体与天然精氨酸脱亚氨酶相比，不但在复性后有很高的体外活性，更重要的是在PEG修饰后仍有很高的活性保留率，且产物均一度更高。
附图说明
图1表示天然支原体(mycoplasm arginini)来源的精氨酸脱亚胺酶(raADI)与精氨酸脱亚胺酶突变体(raADI-Lys-15)之间氨基酸序列比对。
图2精氨酸脱亚胺酶突变体的诱导表达SDS-PAGE图。泳道1为天然ADI(raADI)未诱导空白对照，2号样品为天然ADI(raADI)诱导3小时样品，3-5号泳道为ADI突变体(raADI-lys-15)诱导3小时后样品，6号泳道为未诱导的ADI突变体(raADI-Lys-15)空白对照。突变后的ADI在SDS-PAGE上的表观分子量偏大。
图3层析后的样品SDS-PAGE图。泳道1为ADI突变体(raADI-Lys-15)，泳道2为天然ADI(raADI)，泳道3为低分子量蛋白MARKER。
图4表示精氨酸脱亚胺酶(raADI)和精氨酸脱亚胺酶突变体(raADI-Lys-15)的PEG修饰产物10％SDS-PAGE图。泳道1为ADI突变体(raADI-Lys-15)，泳道2为天然ADI(raADI)，泳道3为ADI突变体的PEG化产物mPEG20000-raADI-Lys-15，泳道4为天然ADI的PEG化产物mPEG20000-raADI，泳道5为高分子量蛋白MARKER。
图5表示mPEG20000-raADI-Lys-15及raADI对荷瘤小鼠生长的影响。横坐标为时间(周)，纵坐标为存活率(％)。
序列说明
SEQ ID NO：1天然精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列，其氨基酸序列系克隆自精氨酸支原体(mycoplasm arginini)
SEQ ID NO：2含15个赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：3含12个赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：4天然精氨酸脱亚胺酶的DNA编码序列
SEQ ID NO：5含15个赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的DNA编码序列
SEQ ID NO：6含12个赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的DNA编码序列
具体实施方式
在本发明的公开中，以下的缩写可能被应用：
ADI，精氨酸脱亚胺酶；raADI，重组支原体(mycoplasm arginini)来源的精氨酸脱亚胺酶；raADI-Lys-15，含15个赖氨酸突变的重组精氨酸脱亚胺酶突变体；raADI-Lys-12，含12个赖氨酸突变的重组精氨酸脱亚胺酶突变体；PEG，聚乙二醇(Polyethylene glycol)；mPEG，甲氧基聚乙二醇；mPEG20000-raADI，分子量为20,000的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶；mPEG20000-raADI-Lys-15，分子量为20,000的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶突变体(含15个赖氨酸突变)；mPEG20000-raADI-Lys-12，分子量为20,000的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶突变体(含12个赖氨酸突变)；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；SPA，琥珀酰亚胺丙酸酯；PB，磷酸缓冲液；PBS，磷酸盐缓冲液。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：重组精氨酸脱亚胺酶突变体的表达，纯化与鉴定
1.1重组精氨酸脱亚胺酶突变体的表达与复性
为了获得高生物活性的赖氨酸部分突变的重组精氨酸脱亚胺酶，本发明的研究者从对于赖氨酸随机点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体中，筛选出了一种赖氨酸部分突变的精氨酸脱亚胺酶的突变体，与原序列SEQ ID NO：1相比，部分点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体仅保留了部分不显著影响活性的Lys残基。
测序表明，上述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其中有15个赖氨酸被其他氨基酸所替代，命名为raADI-Lys-15，具体突变位点分别是：K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I，K209G，K243E，K249D，K279Y。其DNA编码序列参见SEQ ID NO：5。用常规方法构建于pET39b表达载体上，鉴定后常规转化表达宿主菌BL21DE3。并参照Misawa S等的方法进行复性和纯化(Misawa S et al.，High-level expressionof Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as ananti-tumor enzyme，J Biotechnol.，36：145-55，1994)。其复性和纯化方法进行了适当改进，具体方法简述如下：
raADI-Lys-15重组菌经37度高密度发酵，1mM IPTG诱导表达3小时(参见图2)，离心，收集菌体，高压匀浆破碎菌体，离心收集包涵体并洗涤。1g包涵体溶解在15ml的增溶液(6M盐酸胍，5mM EDTA，10mM Tris，pH 8.5)中，室温搅拌3小时。加入75μl β-巯基乙醇继续搅拌30min。然后将增溶液用1800ml的复性液(10mM PB，pH至7.2)缓慢稀释，复性溶液在15℃缓慢搅拌复性48小时。
1.2重组精氨酸脱亚胺酶突变体的纯化
DEAE阴离子层析柱经10mM PB(pH 7.2)缓冲液充分平衡后将复性液上样，经10倍柱床体积的0.5mol/L的NaCl梯度洗脱，收集活性raADI-Lys-15峰，然后在raADI-Lys-15目标峰中加入硫酸铵至1.0mol/L，Phenyl-Spharose HP疏水层析柱经1.0mol/L的硫酸铵(含10mM PB，pH 7.2)充分平衡后，将已加入硫酸铵DEAE目标峰上柱，硫酸铵由1.0mol/L降至0.1mol/L线性洗脱纯化。疏水层析洗脱峰经脱盐柱G25脱盐除去硫酸铵，再次上DEAE阴离子层析柱纯化，以除去样品中含有的微量硫酸铵，并浓缩样品。每克包涵体最终获得约80毫克蛋白，经测序验证，序列符合SEQ ID NO：2。
raADI基因序列(SEQ ID NO：4)通过全合成获得，与raADI-Lys-15一样，构建于pET39b表达载体并转化BL21DE3宿主菌。蛋白表达，复性及纯化步骤亦同raADI-Lys-15一致。最终每克包涵体最终获得约30毫克蛋白。
1.3重组精氨酸脱亚胺酶突变体的酶活性测定
ADI以精氨酸(Arg)为底物，产物胍氨酸能与血尿氮试剂(BUN)在100℃高温下反应显红色。反应体系中加入终浓度10mM的Arg，5μgADI，补充20mM PB(pH 7.2)至500ul，37℃准确反应30min后，取50ul反应液加入5ml血尿氮试剂(BUN)中，混匀，沸水浴10min，最后测OD540，以胍氨酸为标准品作标准曲线。空白对照为不加ADI的血尿氮试剂(BUN)。从标准曲线上换算反应底物胍氨酸的含量(μmol)。酶活力单位的定义：1个酶活力单位(U)定义为37℃，1min内催化1μmol精氨酸完全转化为1μmol胍氨酸的ADI酶量。
用考马斯亮蓝法测定ADI蛋白含量，计算ADI酶的比活力。最后测得纯化后的各种ADI比活如下：
raADI和raADI-Lys-15比活力分别约为33U/mg，30U/mg。
实施例2：
根据实施例1中获得的突变体中的突变位点，参考实施例1的方法制备15个突变点单点突变后的蛋白，检验各突变点单突变后的活性残留，结果如下表所示：
表1精氨酸脱亚胺酶突变体单点突变后的活性残留
| 氨基酸 | 突变后氨基酸 | 比活残留率 | 氨基酸 | 突变后氨基酸 | 比活残留率 |
| K9 | N | 90％ | K126 | E | 89％ |
| K59 | Q | 85％ | K178 | I | 112％ |
| K66 | R | 103％ | K196 | I | 100％ |
| K93 | E | 105％ | K209 | G | 90％ |
| K111 | R | 90％ | K243 | E | 95％ |
| K119 | Q | 105％ | K249 | D | 85％ |
| K121 | Q | 85％ | K279 | Y | 96％ |
| K122 | E | 96％ |
结果表明，上述单点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体也能保留85％以上的活性残留。鉴于实施例1和2的结果，本技术领域的技术人员可知，这些突变点无论是单突变还是多突变对精氨酸脱亚胺酶的降解精氨酸活性均基本没有影响，因此即使只发生了这15个赖氨酸中的部分突变，获得的突变体也仍然能保持降解精氨酸的酶活性，且本技术领域的技术人员根据本文记载的方法，也能获得这15个赖氨酸突变任意组合的突变体。
实施例3
根据实施例2的结果，人工合成另一段精氨酸脱亚胺酶突变体，氨基酸与DNA序列分别参见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6，与SEQ ID NO：2相比，此突变体序列只发生了K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I，K209G突变，共12个，命名为raADI-Lys-12。其表达、复性、纯化与活性测定与实施例1相同，比活力仍为30U/mg左右。证明实施例1中发生的15个赖氨酸突变可以随即组合，而并不显著影响其活力。
实施例4：精氨酸脱亚胺酶突变体的PEG化修饰
取实施例1和实施例3制得的100mL 4mg/mL的raADI或raADI-Lys-15、raADI-Lys-12突变体溶液(缓冲体系为100mM Bicine，pH8.0)，按1∶40摩尔比加入PEG试剂(mPEG-SPA-20KD，北京凯正公司)。室温下搅拌反应2小时。修饰后的产物用Phenyl-Sepharose HP纯化，收集相应目标峰，最后用G25脱盐柱除去(NH4)2SO4。以raADI和raADI-Lys-15、raADI-Lys-12突变体制备所得产物分别命名为mPEG20000-raADI和mPEG20000-raADI-Lys-15、mPEG20000-raADI-Lys-12。
实施例5：PEG化ADI的分析与鉴定
精氨酸脱亚胺酶的修饰程度的测定参照Nag A等描述的方法(Nag A et al.，Acolorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethyleneglycolated protein using ammonium ferrothiocyanate，Anal Biochem.，237(2)：224-231，1996)有所改进：50ul修饰产物经蛋白酶K酶切1小时后，加入1ml硫氰酸铁/氯仿(1∶1)试剂，剧烈振荡半小时，测510nm的吸光度值。以不同浓度的mPEG-20kD的吸光度值做标准曲线，计算出样品中PEG的含量。酶活性测定方法同ADI活性的测定。结果见表2。
表2精氨酸脱亚胺酶和精氨酸脱亚胺酶突变体的PEG修饰产物的活性保留情况
从表2中可见，天然的ADI在不同批次间平均修饰数目与比活之间的差异较大，而ADI突变体不同批次间的差异较小，且ADI突变体结合了约11个mPEG20000分子后，保留了45-55％的体外活性，活性残留率明显较天然ADI高。
对于实施例2制备的单突变突变体也采用同样的方法经PEG修饰后检测活性残留，其活性残留与天然ADI相比略有提高。
实施例6：H22移植瘤模型药效试验
为验证mPEG20000-raADI-Lys-15抑制肝细胞性肝癌的作用，随机选取40只6周龄Balb/C小鼠制备荷瘤鼠模型，每只鼠于背部皮下注射5×105个小鼠肝癌细胞H22，荷瘤后让瘤体生长到大约直径0.5cm，分成4组，分别为mPEG20000-raADI-Lys-15治疗组、mPEG20000-raADI治疗组、raADI治疗组、生理盐水对照组。分别肌注10U mPEG20000-raADI-Lys-15，10UmPEG20000-raADI、10U raADI以及生理盐水0.02ml/次只。每周给药一次，共给药二周，停药后小鼠继续饲养观察10周。与raADI治疗组、mPEG20000-raADI治疗组和生理盐水对照组比较，mPEG20000-raADI-Lys-15对H22荷瘤小鼠生存率明显提高，至观察期结束，荷瘤小鼠60％存活，在统计学上均有显著差异(图5)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>江苏泰康生物医药有限公司
<120>一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用
<130>100304
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>410
<212>PRT
<213>Mycoplasma arginini
<400>1
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val
100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Lys Leu Val
115 120 125
Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210>2
<211>410
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列
<400>2
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly lle His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Arg Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Glu Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Arg Val
100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Gln Ala Gln Glu Thr Ser Arg Glu Leu Val
115 120 125
Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Ile Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Ile Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Gly Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Glu Asn Ile Val Ala Asn Asp Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Tyr Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210>3
<211>410
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列
<400>3
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Arg Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Glu Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Arg Val
100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Gln Ala Gln Glu Thr Ser Arg Glu Leu Val
115 120 125
Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Ile Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Ile Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Gly Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210>4
<211>1233
<212>DNA
<213>Mycoplasma arginini
<400>4
atgtctgtat ttgacagtaa atttaaagga attcacgttt attcagaaat tggtgaatta 60
gaatcagttc tagttcacga accaggacgc gaaattgact atattacacc agctagacta 120
gatgaattat tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga acacaaacaa 180
ttcgtagcag aattaaaagc aaacgacatc aatgttgttg aattaattga tttagttgct 240
gaaacatacg atttagcatc acaagaagct aaagataaat taatcgaaga atttttagaa 300
gactcagaac cagttctatc agaagaacac aaagtagttg taagaaactt cttaaaagct 360
aaaaaaacat caagaaaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcacaaa atacgattta 420
ggtatcgaag cagatcacga attaatcgtt gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480
gacccatttg catcagtagg taatggtgta acaatccact acatgcgtta caaagttaga 540
caacgtgaaa cattattctc aagatttgta ttctcaaatc accctaaact aattaacact 600
ccatggtact acgacccttc actaaaatta tcaatcgaag gtggagacgt atttatctac 660
aacaatgaca cattagtagt tggtgtttct gaaagaactg acttacaaac agttacttta 720
ttagctaaaa acattgttgc taataaagaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaattaac 780
gttccaaaat ggacaaactt aatgcactta gacacatggc taacaatgtt agacaaggac 840
aaattcctat actcaccaat cgctaacgac gtatttaaat tctgggatta tgacttagta 900
aacggtggag cagaaccaca accagttgaa aacggattac ctctagaagg attattacaa 960
tcaatcatta acaaaaaacc agttttaatt cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020
gaaatcgaaa gagaaacaca cttcgatggt acaaactact tagcaattag accaggtgtt 1080
gtaattggtt actcacgtaa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagctgc aggcattaaa 1140
gttcttccat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200
atgcctttat cacgtaaaga tgttaagtgg taa 1233
<210>5
<211>1233
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的DNA编码序列
<400>5
atgtctgtat ttgacagtaa atttaacgga attcacgttt attcagaaat tggtgaatta 60
gaatcagttc tagttcacga accaggacgc gaaattgact atattacacc agctagacta 120
gatgaattat tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga acaccagcaa 180
ttcgtagcag aattacgtgc aaacgacatc aatgttgttg aattaattga tttagttgct 240
gaaacatacg atttagcatc acaagaagct aaagatgaat taatcgaaga atttttagaa 300
gactcagaac cagttctatc agaagaacac cgtgtagttg taagaaactt cttacaggct 360
caggaaacat caagagaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcactaa atacgattta 420
ggtatcgaag cagatcacga attaatcgtt gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480
gacccatttg catcagtagg taatggtgta acaatccact acatgcgtta catcgttaga 540
caacgtgaaa cattattctc aagatttgta ttctcaaatc accctatcct aattaacact 600
ccatggtact acgacccttc actaggttta tcaatcgaag gtggagacgt atttatctac 660
aacaatgaca cattagtagt tggtgtttct gaaagaactg acttacaaac agttacttta 720
ttagctgaaa acattgttgc taatgacgaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaattaac 780
gttccaaaat ggacaaactt aatgcactta gacacatggc taacaatgtt agactacgac 840
aaattcctat actcaccaat cgctaacgac gtatttaaat tctgggatta tgacttagta 900
aacggtggag cagaaccaca accagttgaa aacggattac ctctagaagg attattacaa 960
tcaatcatta acaaaaaacc agttttaatt cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020
gaaatcgaaa gagaaacaca cttcgatggt acaaactact tagcaattag accaggtgtt 1080
gtaattggtt actcacgtaa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagctgc aggcattaaa 1140
gttcttccat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200
atgcctttat cacgtaaaga tgt taagtgg taa 1233
<210>6
<211>1233
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>部分赖氨酸突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的DNA编码序列
<400>6
atgtctgtat ttgacagtaa atttaacgga attcacgttt attcagaaat tggtgaatta 60
gaatcagttc tagttcacga accaggacgc gaaattgact atattacacc agctagacta 120
gatgaattat tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga acaccagcaa 180
ttcgtagcag aattacgtgc aaacgacatc aatgttgttg aattaattga tttagttgct 240
gaaacatacg atttagcatc acaagaagct aaagatgaat taatcgaaga atttttagaa 300
gactcagaac cagttctatc agaagaacac cgtgtagttg taagaaactt cttacaggct 360
caggaaacat caagagaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcactaa atacgattta 420
ggtatcgaag cagatcacga attaatcgtt gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480
gacccatttg catcagtagg taatggtgta acaatccact acatgcgtta catcgttaga 540
caacgtgaaa cattattctc aagatttgta ttctcaaatc accctatcct aattaacact 600
ccatggtact acgacccttc actaggttta tcaatcgaag gtggagacgt atttatctac 660
aacaatgaca cattagtagt tggtgtttct gaaagaactg acttacaaac agttacttta 720
ttagctaaaa acattgttgc taataaagaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaattaac 780
gttccaaaat ggacaaactt aatgcactta gacacatggc taacaatgtt agacaaggac 840
aaattcctat actcaccaat cgctaacgac gtatttaaat tctgggatta tgacttagta 900
aacggtggag cagaaccaca accagttgaa aacggattac ctctagaagg attattacaa 960
tcaatcatta acaaaaaacc agttttaatt cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020
gaaatcgaaa gagaaacaca cttcgatggt acaaactact tagcaattag accaggtgtt 1080
gtaattggtt actcacgtaa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagctgc aggcattaaa 1140
gttcttccat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200
atgcctttat cacgtaaaga tgttaagtgg taa 1233
Claims (11)
1.一种精氨酸脱亚胺酶突变体，具有降解精氨酸为胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列为SEQID NO:3或SEQ ID NO:2。
2.如权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体经一种低免疫原性或无免疫原性的聚合物修饰,所述低免疫原性或无免疫原性的聚合物为聚乙二醇。
3.如权利要求2所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为5000到40,000。
4.如权利要求3所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为20,000。
5.如权利要求2-4任一所述精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶突变体经低免疫原性或无免疫原性的聚合物修饰后，活性保留率高于同样条件下未突变精氨酸脱亚胺酶被同样条件修饰后的活性保留率。
6.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1-5任一权利要求所述精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列。
7.一种表达载体，它含有权利要求6所述的多核苷酸序列。
8.一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求7所述表达载体，或者染色体中整合有权利要求6所述多核苷酸。
9.一种制备权利要求1-5任一权利要求所述精氨酸脱亚胺酶突变体的方法，该方法包括：
1）用含有编码精氨酸脱亚胺酶突变体的多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
3)从培养基或细胞中分离和纯化蛋白质。
10.一种药物组合物，它含有安全有效量的权利要求1-5任一所述精氨酸脱亚胺酶突变体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
11.权利要求1-5任一所述精氨酸脱亚胺酶突变体在制备治疗病毒感染、肿瘤或阿尔茨海莫氏病的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010132859.XA CN101812438B (zh) | 2010-03-25 | 2010-03-25 | 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010132859.XA CN101812438B (zh) | 2010-03-25 | 2010-03-25 | 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101812438A CN101812438A (zh) | 2010-08-25 |
| CN101812438B true CN101812438B (zh) | 2014-08-27 |
Family
ID=42619805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010132859.XA Active CN101812438B (zh) | 2010-03-25 | 2010-03-25 | 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101812438B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104130996B (zh) * | 2013-05-03 | 2017-05-10 | 上海医药工业研究院 | 关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 |
| CN105018454A (zh) * | 2014-04-30 | 2015-11-04 | 重庆派金生物科技有限公司 | 一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法 |
| SG10202002557SA (en) * | 2014-09-16 | 2020-04-29 | Tdw Group | Arginine deiminase with reduced cross-reactivity toward adi - peg 20 antibodies for cancer treatment |
| CN104560927B (zh) * | 2015-01-09 | 2017-07-14 | 石药集团中诺药业（石家庄）有限公司 | 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 |
| CN108265068B (zh) * | 2016-12-31 | 2021-06-15 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用 |
| CN106591270B (zh) * | 2017-01-23 | 2018-09-21 | 江南大学 | 一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶 |
| CN106591271B (zh) * | 2017-03-02 | 2019-07-16 | 江南大学 | 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 |
| CN109652400B (zh) * | 2017-10-12 | 2022-10-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株 |
| CN112442496B (zh) * | 2019-08-28 | 2023-05-12 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 |
| CN112094837B (zh) * | 2020-08-28 | 2022-05-17 | 浙江大学 | 一种重组精氨酸脱亚胺酶突变体、其制备方法及应用 |
| CN113481174B (zh) * | 2021-07-01 | 2022-08-19 | 温州医科大学 | 核酸连接酶 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6183738B1 (en) * | 1997-05-12 | 2001-02-06 | Phoenix Pharamacologics, Inc. | Modified arginine deiminase |
| CN1518595A (zh) * | 2000-11-28 | 2004-08-04 | 凤凰药理学公司 | 修饰的精氨酸脱亚胺酶 |
-
2010
- 2010-03-25 CN CN201010132859.XA patent/CN101812438B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6183738B1 (en) * | 1997-05-12 | 2001-02-06 | Phoenix Pharamacologics, Inc. | Modified arginine deiminase |
| CN1518595A (zh) * | 2000-11-28 | 2004-08-04 | 凤凰药理学公司 | 修饰的精氨酸脱亚胺酶 |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| arginine deiminase [Mycoplasma arginini];Ohno,T. et al.;《NCBI GenBank: CAA38210.1》;20100205;全文 * |
| CharlesMarkEnsoretal..PegylatedArginineDeiminase(ADI-SSPEG20 000 mw) Inhibits Human Melanomas and Hepatocellular Carcinomas in Vitro and in Vivo.《CANCER RESEARCH》.2002 |
| cient human epidermal growth factor variants for directional conjugation as targeting ligands.《Protein Engineering》.2003,第16卷(第12期),全文. * |
| Frederick W. Holtsberg et al..Poly(ethylene glycol) (PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties.《Journal of Controlled Release》.2002,第80卷(第1-3期),摘要、第261页左栏第3段、图1、第263页右栏第2段至第270页右栏第2段. |
| Miriam Bach et al..Isolation from phage display libraries of lysine-de& * |
| Miriam Bach et al..Isolation from phage display libraries of lysine-de® |
| Ohno,T. et al..arginine deiminase [Mycoplasma arginini].《NCBI GenBank: CAA38210.1》.2010,全文. |
| Optimal site-specific PEGylation of mutant TNF-a improves its antitumor potency;Y. Yoshioka et al.;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20041231;全文 * |
| Pegylated Arginine Deiminase (ADI-SS PEG20,000 mw) Inhibits Human Melanomas and Hepatocellular Carcinomas in Vitro and in Vivo;Charles Mark Ensor et al.;《CANCER RESEARCH》;20021231;全文 * |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties;Frederick W. Holtsberg et al.;《Journal of Controlled Release》;20020423;第80卷(第1-3期);摘要、第261页左栏第3段、图1、第263页右栏第2段至第270页右栏第2段 * |
| reg * |
| Site-specific PEGylation of a lysine-deficient TNF-α with full bioactivity;Yoko Yamamoto et al.;《nature biotechnology》;20030330;第21卷;摘要、第546页左栏第2段至第547页左栏第1段、图1、第548页右栏第1段至第550页右栏第2段 * |
| Y. Yoshioka et al..Optimal site-specific PEGylation of mutant TNF-a improves its antitumor potency.《Biochemical and Biophysical Research Communications》.2004,全文. |
| Yoko Yamamoto et al..Site-specific PEGylation of a lysine-deficient TNF-α with full bioactivity.《nature biotechnology》.2003,第21卷摘要、第546页左栏第2段至第547页左栏第1段、图1、第548页右栏第1段至第550页右栏第2段. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101812438A (zh) | 2010-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101812438B (zh) | 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用 | |
| US8663967B2 (en) | Arginine deiminase mutant and preparation and application thereof | |
| CN1896231B (zh) | 分离四聚体尿酸氧化酶的方法 | |
| JP2003521937A (ja) | 非免疫原性ポリマー結合体の調製のための凝集体非含有尿酸オキシダーゼ | |
| CN106632682A (zh) | 融合蛋白ifn-elp及其应用 | |
| US20180282707A1 (en) | Mutant-type uricase, peg modified mutant-type uricase, and application thereof | |
| CA2710841C (en) | Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof | |
| CN1311035A (zh) | 重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂 | |
| CN103923209B (zh) | 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| BRPI0714380A2 (pt) | composiÇÕes anticocaÍna e tratamento | |
| CN102260653B (zh) | 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法 | |
| CN101591649B (zh) | 甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用 | |
| Berg et al. | Pharmacokinetics of PEG-L-asparaginase and plasma and cerebrospinal fluid L-asparagine concentrations in the rhesus monkey | |
| CN101163716B (zh) | 白细胞介素-6聚乙二醇结合物及其制备方法和应用 | |
| CN101928704A (zh) | 黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物及其制备方法 | |
| CN102453089A (zh) | 重组集成干扰素变异体聚乙二醇偶联物的制备和应用 | |
| CN108265044B (zh) | 聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用 | |
| CN103923898A (zh) | 一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用 | |
| CN105085658B (zh) | 一种白细胞介素29突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| EP4335454A1 (en) | Urate oxidase preparation and use thereof | |
| CN109652400A (zh) | 抗癌药物精氨酸脱亚胺酶半衰期的分子改造方法及突变株 | |
| CN105085657A (zh) | 一种干扰素突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| CN110121340B (zh) | 聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶的调配物 | |
| US20040001843A1 (en) | Peptides and DNA encoding the peptides useful for immunizations against Coccidioides spp. infections | |
| CN106749608A (zh) | 干扰素α缀合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |