CN112442496B - 精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 - Google Patents

精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了精氨酸脱亚胺酶的突变体，特别是精氨酸脱亚胺酶突变体的设计与制备，以及其聚乙二醇修饰产物在药物制备中的应用。本发明的ADI突变体是通过氨基酸的突变破坏ADI同源二聚体亚基间相互作用力，而不能形成二聚体的单体形式ADIm。本发明的突变设计于Loop或者二级结构α‑Helix和β‑sheet边缘的氨基酸突变；且突变前后氨基酸结构相似，例如突变前为Arg，可突变成与Arg结构最相似的脂肪族氨基酸，如Leu等。本发明提供的ADIm不仅是精氨酸脱亚胺酶单体突变体，而且最大程度保留了ADI活性；同时，在此基础上得到的聚乙二醇修饰的ADIm，在具有长效等优点的基础上，更大程度的降低了其免疫原性，从整体来说提高了疗效。

Description

精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及精氨酸脱亚胺酶的突变体，特别是精氨酸脱亚胺酶突变体的设计与制备，以及其聚乙二醇修饰产物在药物制备中的应用。
背景技术
研究报道许多癌细胞因缺失了正常细胞中参与精氨酸合成的关键酶精氨琥珀酸合成酶，自身不能合成生长所需的精氨酸，这类癌细胞统称为精氨酸营养缺陷型。精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI，EC3.5.3.6)能将L-精氨酸不可逆地水解为L-瓜氨酸和氨，可快速分解血浆中的精氨酸从而抑制精氨酸营养缺陷型癌细胞的生长，达到杀死癌细胞和治疗癌症的目的。然而ADI蛋白主要来源于支原体及其他微生物，具有极强的免疫原性，在体内的半衰期短，仅为4-5小时。
聚乙二醇(PEG)是一种生物相容性极好的高分子聚合物，同时是极少数FDA批准的可作为体内注射药物的合成聚合物之一。PEG修饰技术已在生物医学和生物技术领域获得了广泛的应用。PEG修饰可有效降低药物的免疫降解和酶解作用，延长药物的循环半衰期，降低药物在肾脏中的代谢速率，是目前公认安全，应用广泛的改善蛋白药物生理稳定性的有效手段之一。Phoenix公司基于这一原理开发了PEG修饰化精氨酸脱亚胺酶药物产品ADI-PEG20，目前该产品正在进行多项临床研究。
ADI-PEG20在临床研究使用过程中暴露出免疫原性仍然较高的瓶颈问题，极大限制了其应用，文献报道病人给药约一个月后体内即有抗药抗体产生，并且影响药物药效，血浆中精氨酸水平逐步升高(Lowery MA，Cancer，2017(123)：4556-4565；Tomlinson BK，ClinCancer Res，2015(21)：2480-2486)。
发明内容
本发明的目的在于解决精氨酸脱亚胺酶免疫原性高的问题。晶体结构分析显示ADI蛋白是同源二聚体结构，发明人研究发现PEG修饰时由于空间位阻效应，二聚体作用界面周围难以被PEG分子修饰，是影响药物免疫原性的关键因素之一；另外二聚体结构相互作用界面不涉及共价键，只有氢键及疏水相互作用，在体内复杂条件下有解聚可能，从而造成作用界面抗原表位的暴露，也是造成药物免疫原性高的关键因素。本发明基于精氨酸脱亚胺酶三维结构进行分子设计与改造，得到精氨酸脱亚胺酶ADI单体突变体ADIm，以解决原始ADI二聚体作用界面难以被PEG修饰、体内解聚后抗原表位暴露、免疫原性高的问题。
本发明的第一目的是提供一种ADI突变体，其为单亚基蛋白。以下称为精氨酸脱亚胺酶单体突变体ADIm。
优选的，ADI突变体是通过氨基酸的突变破坏ADI同源二聚体亚基间相互作用力而不能形成二聚体的，单体形式。
优选的，所述相互作用力为氢键作用力。
优选的，所述突变位点是将原有氨基酸突变为无法形成氢键的氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸等。
优选的，所述突变位点优选位于Loop或者二级结构α-Helix和β-sheet边缘的氨基酸突变；且突变前后氨基酸结构相似，例如突变前为Arg，可突变成与Arg结构最相似的脂肪族氨基酸，如Leu等。这样可以尽可能少地影响蛋白二级结构。
优选的，1)当精氨酸脱亚胺酶是人支原体来源时，取代位置是由SEQ ID NO:2表示序列的第343或386位中的至少一个。
优选的，上述第343位精氨酸被亮氨酸或丙氨酸取代。
优选的，上述第386位天冬酰胺被丙氨酸取代。
或者2)当精氨酸脱亚胺酶是其他来源时，取代位置是1)中第343、386位相应位置中的至少一个。
具体地，本发明还提供了精氨酸脱亚胺酶单体突变体编码的基因，它们的出发精氨酸脱亚胺酶的基因序列为序列表中的SEQ ID NO:1，其编码SEQ ID NO:2所示的精氨酸脱亚胺酶。当SEQ ID NO:2所示序列的部分氨基酸残基被“另一种氨基酸”残基取代时，SEQ IDNO:1对应部分由编码“另一种氨基酸残基”的核苷酸取代。
本发明的第二目的是提供免疫原性降低的ADIm的聚乙二醇修饰物。
优选的，是聚乙二醇随机修饰，其中一分子的ADIm与3-5分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量为10-20KDa的直链聚乙二醇。
优选的，聚乙二醇通过与ADIm的游离氨基形成酰胺键或脲烷键共价连接。所述游离氨基酸包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基。
所述聚乙二醇随机修饰的ADIm的结构通式如下所示：
Figure BDA0002182242850000021
其中R为H或C1-C4的烷基；n为225到453的整数值；p为1-3的整数；s为3-5的整数。
优选地，所述烷基为甲基，n为224到453之间的整数值，p为2，s为4。
本发明的第三个目的是提供上述聚乙二醇修饰的ADIm在治疗精氨酸缺陷型肿瘤疾病的药物中的应用。所述精氨酸缺陷型肿瘤疾病如原发性肝癌、黑色素瘤、肾癌、间皮瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乙肝、丙肝、急性髓细胞白血病、恶性毒瘤、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤等。
有益效果：本发明提供的ADIm不仅是精氨酸脱亚胺酶单体突变体，而且最大程度保留了ADI活性；同时，在此基础上得到的聚乙二醇修饰的ADIm，在具有长效等优点的基础上，更大程度的降低了其免疫原性，从整体来说提高了疗效。
附图说明
图1 ADI及其突变体分子筛(SEC)分子量分析
图2 ADI-PEG修饰样品分子筛(SEC)纯度检测
图3 ADIm-PEG偶联物免疫原性ADA水平检测
图4 ADIm-PEG偶联物药效PD(精氨酸水平)检测
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
定义：
本发明使用的缩写含义如下：
PEG，聚乙二醇。聚乙二醇(PEG，HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH)是一种两端带羟基的线型聚合物，有分支型，直链型和多臂型。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，这种衍生物是蛋白质聚乙二醇修饰技术中最常用到。
PEG修饰剂：聚乙二醇修饰剂。聚乙二醇修饰剂是经过活化的带有官能团的聚乙二醇衍生物，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰。
ADI：精氨酸脱亚胺酶。
ADIm：精氨酸脱亚胺酶的单体突变体。
本申请中所用，术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶后得到的修饰产物。
M-SPA-20K-ADI：用M-SPA-20K修饰ADI后纯化得到的修饰产物。
M-SPA-20K-ADIm：用M-SPA-20K修饰ADIm后纯化得到的修饰产物。
在本发明中，所修饰的ADIm是ADI同源二聚体经分子设计与突变后以单体形式存在，在本发明的偶联物的特定实施方式中，ADI亚基与包含SEQ ID NO:2的序列的蛋白具有至少约70％的序列同源性。
实施例1精氨酸脱亚胺酶单体突变体ADIm的构建及制备
在野生型ADI(氨基酸序列如SEQ ID NO.2)的基础上，进行如表1所示的ADIm突变体设计，并进行基因优化和合成：
表1
ADIm 突变方式 基因序列
ADI(M01) Glu146Ala SEQ ID NO.3
ADI(M02) Arg343Ala SEQ ID NO.4
ADI(M03) Arg343Leu SEQ ID NO.5
ADI(M04) Glu146Ala、Arg343Ala SEQ ID NO.6
ADI(M05) Glu146Ala、Arg343Leu SEQ ID NO.7
ADI(M06) Glu367Ala SEQ ID NO.8
ADI(M07) Asn386Ala SEQ ID NO.9
以重组质粒pET28-rADI为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用PrimeSTAR HS高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。
以上各基因上下游引物序列如下：
M01上游引物如SEQ ID NO.10所示；
M02上游引物如SEQ ID NO.11所示；
M03上游引物如SEQ ID NO.12所示；
M04上游引物如SEQ ID NO.11所示；
M05上游引物如SEQ ID NO.11所示；
M06上游引物如SEQ ID NO.13所示；
M07上游引物如SEQ ID NO.14所示；
M01下游引物如SEQ ID NO.15所示；
M02下游引物如SEQ ID NO.16所示；
M03下游引物如SEQ ID NO.17所示；
M04下游引物如SEQ ID NO.16所示；
M05下游引物如SEQ ID NO.16所示；
M06下游引物如SEQ ID NO.18所示；
M07下游引物如SEQ ID NO.19所示；
扩增体系为：PrimeSTAR Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸7分钟(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Thermo公司)在37℃条件下消化胶回收产物2小时，降解初始模板。消化产物转化至E.coliBL21(DE3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到ADIm的重组菌。
通过发酵重组菌制备ADIm包涵体，制备过程参见公开专利(CN108265068A)。
将上述ADIm包涵体进行变性和复性，所采用的变性缓冲液主要组分包括：8-10M脲，20-50mM Tris-HCl，8-10mM DTT，0-1mM EDTA，pH8.0-10.0；所采用的复性缓冲液主要组分包括：8-12mM PB，0-1mM EDTA，pH 7.2。
再使用离子交换层析纯化法进行ADIm包涵体复性后样品的纯化，最终得到纯度近100％的ADIm样品。
按照上述流程制备表1所示的各ADIm突变体：
突变体蛋白样品经分子筛SEC(Superdex 75)分子量检测判断蛋白聚体形式，结果如图1所示，上表中除了ADI(M01)和ADI(M06)以外其余5个突变体的保留时间均明显大于ADI野生型(分子量92KDa)，同时也大于对照蛋白牛血清蛋白BSA(分子量66.4Kda)。上述结果表明ADI(M02)等5个突变体是单体形式(分子量46Kda)。
实施例2聚乙二醇随机修饰ADI、ADIm偶联物的制备
选用M-SPA-20K PEG(购自北京键凯)作为修饰剂，利用疏水层析法进行分离纯化。
1、修饰反应
将纯化好的ADIm蛋白样品浓缩、置换修饰缓冲液(配比：100mM磷酸缓冲液，pH8.0)，浓度约为20mg/ml；按照ADIm:PEG质量比1:6称取PEG。修饰反应在4℃下进行，反应时间12小时。
2、修饰样品纯化
色谱法条件：流动相A为20mM PB(pH7.2)含3M NaCl，流动相B为20mM PB(pH7.2)。
上样：上述修饰反应产物用A液稀释10倍，10mL/min上样，结合至疏水柱(购自GE公司，Phenyl HP)。
平衡，上样结束后，用A液冲洗3～5个柱体积。
洗脱，0-100％B液洗脱，洗脱体积为2个柱体积，收集洗脱样品M-SPA-20K-ADIm。
按照上述流程制备M-SPA-20K-ADI(M03)、M-SPA-20K-ADI(M07)。
按照上述流程制备M-SPA-20K-ADI。
实施例3样品活性检测
1、溶液的配制
0.03mol/L硫酸铵标准溶液：取适量硫酸铵固体于干燥箱恒重后，取1.982g用双蒸水定容至50mL。
硫酸铵对照品溶液：取0.03mol/L硫酸铵标准溶液50μL稀释至1mL，得0.0015mol/L的对照品溶液。
10×缓冲液：精密称取磷酸二氢钠47.3g和磷酸氢二钠22.4g，加入水600mL溶解，调至pH6.0，加水定容至1L，混匀，过0.22μm滤膜。
20mmol/L的精氨酸溶液：精密称取精氨酸0.3484g，加至100mL 10×缓冲液中，混匀。
30％三氯乙酸溶液：称取30g三氯乙酸，用双蒸水稀释至100mL，于4℃放置保存。
2、酶活性检测方法
用1×缓冲液将样品稀释成每1mL中约含1.5个单位的供试品溶液；
取1.5mL离心管，加入20mmol/L的精氨酸溶液0.6mL，于37℃水浴锅中预热5分钟；
上述离心管中加入供试品溶液0.2mL，于37℃水浴锅中精确反应10分钟；
取出后立即加入30％三氯乙酸溶液各0.2mL，摇匀；
分别精确移取对照品溶液、供试品溶液0.3mL，置于10mL试管中，加入4mL纯化水及0.6mL萘氏试剂溶液，混匀；
另取10mL试管，精确移取1×缓冲液0.3mL，加入4mL纯化水及0.6mL萘氏试剂溶液，混匀，作为空白对照管；
室温放置10分钟后，在405nm处测定吸光度值。
按照下述计算公式得出样品的酶活：
Figure BDA0002182242850000061
样品活性测定的结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002182242850000062
Figure BDA0002182242850000071
实施例4样品纯度检测
色谱方法纯度检测：
色谱法条件：HPLC(Waters，e2695 HPLC)，BEH SEC 450 3.5μm(购自Waters)，流动相为乙腈/水体系，流速为1mL/min，检测波长为280nm，进样量10μg，检测时间为25min。
分析结果见图2所示。结果显示M-SPA-20K-ADI(M03)、M-SPA-20K-ADI(M07)以及M-SPA-20K-ADI的纯度均高于98％。
实施例5 ADIm-PEG偶联物体外药效评价
(1)体外抑制肝癌细胞(HCC)增殖实验
收获处于对数生长期的HCC细胞，包括JHH-7、HLE、Li-7和等细胞株，用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μL细胞悬液至96孔板培养。样品经梯度稀释，在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μL样品溶液，每个样品浓度设置三个复孔，以Cisplatin为阳性对照药。将已加样品的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行细胞增殖抑制的检测。
表3的结果显示，M-SPA-20K-ADI、M-SPA-20K-ADI(M03)和M-SPA-20K-ADI(M07)对JHH-7、HLE和Li-7三株肝癌细胞有较明显的抑制作用，IC50值显著低于或与阳性药相近。M-SPA-20K-ADI(M03)单体突变体PEG偶联物的肿瘤细胞抑制活性与野生型ADI(二聚体)PEG修饰物相似。
表3对HCC细胞的抑制情况
Figure BDA0002182242850000072
Figure BDA0002182242850000081
(2)体外抑制黑色素瘤(Melanoma)增殖实验
收获处于对数生长期的Melanoma细胞，包括A2058、A-875、WM-266-4、SK-MEL-28和SK-MEL-5等细胞株，用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μL细胞悬液至96孔板培养。样品经梯度稀释，在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μL样品溶液，每个样品浓度设置三个复孔，以Cisplatin为阳性对照药。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行细胞增殖抑制的检测。
和肝癌细胞的体外抑制结果类似，M-SPA-20K-ADI、M-SPA-20K-ADI(M03)和M-SPA-20K-ADI(M07)对五株黑色素瘤细胞均有较明显的抑制作用，且优于阳性药，具体结果如表4所示，其中M-SPA-20K-ADI(M03)偶联物的肿瘤细胞抑制活性与野生型ADI(二聚体)PEG修饰物的相似。
表4对Melanoma细胞的抑制情况
Figure BDA0002182242850000082
实施例6偶联物的PEG结合数测定
采用HPLC反向定量检测方法，以BSA作为标准品，准确测定PEG偶联物中的蛋白含量；采用中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法的原理检测PEG偶联物中的PEG含量。通过两者的摩尔比值计算偶联物的PEG结合数。
检测结果参见表5，单体突变体经PEG修饰后相比野生型具有更高的PEG修饰度，预期蛋白表面抗原表位可能被更好的遮蔽，从而获得更低的免疫原性。
表5修饰样品PEG结合数测定
样品名称 批号 PEG结合数(按单亚基计算)
M-SPA-20K-ADI(M03) 20190325 3.95
M-SPA-20K-ADI 20190325 3.55
实施例7 ADIm-PEG免疫原性、药效评价
本实施例测定了不同PEG修饰偶联物对SD大鼠(动物购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)的免疫原性。试验分M-SPA-20K-ADI(M03)和M-SPA-20K-ADI两组，以每周1次的频率连续8周的方法给大鼠腿部肌肉注射10mg/kg的上述蛋白。每次给药前从眼眶取血，收集血清。血清样品检测药物免疫原性即抗药抗体ADA的产生以及药物药效PD即精氨酸水平。ADA水平检测采用双抗原夹心间接ELISA方法；血清中精氨酸含量测定采用UPLC衍生检测。
从ADA检测结果(图3)可以得出单体突变体的PEG偶联物M-SPA-20K-ADI(M03)对SD大鼠的抗体滴度显著低于野生型ADI的PEG偶联物M-SPA-20K-ADI。同时药效PD检测结果(图4)显示两个样品组药效维持能力无显著性差异，给药后可始终维持精氨酸在较低水平。综上所述单体突变体的PEG偶联物免疫原性更低，且具有与野生型PEG偶联物相似的药效，具有更好的应用优势。
                         序列表
<110>  江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120>  精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
<130>  精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
<160>  19
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  1230
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  1
atgagcgtgt ttgattctaa attcaacggc attcatgttt actctgaaat cggtgaactg  60
gaaacggttc tggtccacga accgggccgc gaaattgatt acatcacccc ggcccgtctg 120
gacgaactgc tgttttcagc aattctggaa tcgcatgatg ctcgcaaaga acaccagtca 180
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ccgctgtccc gtaaagatgt gaaatggtaa 1230
<210>  2
<211>  409
<212>  PRT
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  2
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
            20                  25                  30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile
    50                  55                  60
Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65                  70                  75                  80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu
        115                 120                 125
Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu
    130                 135                 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr
                165                 170                 175
Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn
            180                 185                 190
His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys
        195                 200                 205
Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu
    210                 215                 220
Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val
                245                 250                 255
Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp
            260                 265                 270
Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn
        275                 280                 285
Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu
    290                 295                 300
Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser
305                 310                 315                 320
Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala
                325                 330                 335
Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr
            340                 345                 350
Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys
        355                 360                 365
Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
    370                 375                 380
Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
                405
<210>  3
<211>  1230
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  3
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<210>  4
<211>  1230
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  4
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<211>  1230
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  5
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<211>  1230
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  7
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<400> 8
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<400> 9
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cgtgaaaccc tgttcgcccg ctttgtcttc cgtaatcacc cgaaactggt gaaaaccccg 600
tggtattacg atccggcaat gaaaatgccg attgaaggcg gtgacgtctt tatctacaac 660
aatgaaacgc tggtcgtggg cgtgtccgaa cgtaccgatc tggacaccat tacgctgctg 720
gcaaaaaaca tcaaagctaa caaagaagtt gaatttaaac gtattgttgc catcaacgtc 780
ccgaaatgga ccaatctgat gcatctggat acctggctga cgatgctgga caaaaacaaa 840
ttcctgtata gcccgatcgc aaacgatgtt ttcaaattct gggattacga cctggtcaac 900
ggcggtgctg aaccgcagcc gcaactgaat ggtctgccgc tggataaact gctggcgtct 960
attatcaata aagaaccggt gctgattccg atcggcggtg caggcgctac cgaaatggaa 1020
attgcgcgcg aaacgaactt tgatggtacc aattatctgg ccattaaacc gggcctggtg 1080
atcggttacg accgtaacga aaaaacgaat gcagctctga aagcggccgg catcaccgtt 1140
ctgccgtttc acggtgccca actgagcctg ggcatgggta atgcacgctg catgagtatg 1200
ccgctgtccc gtaaagatgt gaaatggtaa 1230
<210>  10
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  10
ggtgtggaat ctgaaaacgc actgatcgtt gatccgatg 39
<210>  11
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  11
taccgaaatg gaaattgcgg ccgaaacgaa ctttgatggt 40
<210>  12
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  12
accgaaatgg aaattgcgct ggaaacgaac tttgatggta 40
<210>  13
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
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atcggttacg accgtaacgc aaaaacgaat gcagctctg                         39
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
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cgttctgccg tttcacggtg cccaactgag cctgggcatg                        40
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
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catcggatca acgatcagtg cgttttcaga ttccacacc                         39
<210>  16
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  16
accatcaaag ttcgtttcgg ccgcaatttc catttcggta                        40
<210>  17
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
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taccatcaaa gttcgtttcc agcgcaattt ccatttcggt                        40
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<213>  Mycoplasma hominis
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cagagctgca ttcgtttttg cgttacggtc gtaaccgat                         39
<210>  19
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<212>  DNA
<213>  Mycoplasma hominis
<400>  19
catgcccagg ctcagttggg caccgtgaaa cggcagaacg                        40

Claims (5)

1.精氨酸脱亚胺酶单体突变体，其特征在于，1)当精氨酸脱亚胺酶是人支原体来源时，突变位点是SEQ ID NO:2表示序列的第386位；或者2)当精氨酸脱亚胺酶是其他来源时，突变位点是1)中第386位相应位置；上述第386位天冬酰胺被丙氨酸取代。
2.一种精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，所述精氨酸脱亚胺酶为如权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶单体突变体。
3.如权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述修饰物是聚乙二醇随机修饰，其中一分子的ADIm与3-5分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量为10-20KDa的直链聚乙二醇。
4.如权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述聚乙二醇随机修饰的ADIm的结构通式如下所示：
Figure FDA0004053877770000011
其中R为甲基，n为224到453之间的整数值，p为2，s为4。
5.如权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰物，在制备治疗精氨酸缺陷型肿瘤疾病的药物中的应用。
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