CN112679615B - 一种融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白通过柔性连接将肿瘤靶向IgG抗体与IL15或其变体或/和IL15α受体胞外段或“sushi domain”或变体进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白。所述融合蛋白增强了细胞和细胞因子介导的免疫，可用于治疗肿瘤性和感染性疾病，具有治疗肿瘤、提高组织特异性、降低副作用以及提高药效的作用。

Description

一种融合蛋白
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合蛋白。
背景技术
免疫逃逸是肿瘤细胞逃生的一个非常重要的机制，PD-L1(程序性死亡配体1)以及其与受体PD-1的结合就是其中一个重要路径，因此靶向PD-L1/PD-1的抗体药成为热门的免疫抑制解除剂，和治疗肿瘤的药物。
PD-L1即CD274或者B7H1，属于I型跨膜配体，包含IgV和IgC样结构，大部分位于胞外，小部分位于细胞质。PD-L1的受体PD-1存在于T细胞表面，两者结合会抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生，这种机制作为自然选择的一种方式使肿瘤在免疫反应的环境中得到进化。PD-L1与B7-1也有结合，B7-1是另一种T细胞激活的负性调节者，PD-L1异常表达于多种肿瘤细胞，而且在多种癌症中PD-L1表达的增加与不良的预后有关系。随着免疫的活化和促炎因子的产生，在肿瘤微环境的免疫细胞和其他细胞中，PD-L1也会上调，进一步促进了肿瘤微环境T细胞的抑制。阻断PD-L1可以促进与肿瘤反应的T细胞重新激活，恢复其发现和杀死肿瘤细胞的功能。PD-L1及其受体PD-1(programmed death-1)的信号途径被认为与一直排斥反应、自身免疫疾病、慢性病毒感染、肿瘤免疫逃逸等疾病密切相关。肿瘤细胞及其微环境通过上调PD-L1表达并与肿瘤特异的CD8+T细胞表面的PD-1结合，来限制宿主的免疫反应，从而产生免疫逃逸。因此利用PD-1或PD-L1的单抗针对性阻断PD-1/PD-L1信号通路可恢复T细胞对肿瘤的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果。虽然以PD-1与PD-L1单抗为核心的肿瘤免疫疗法在临床应用中取得不错的效果，但是仍具有一定的局限性：PD-1/PD-L1单抗不能无差别治疗肿瘤病人，使用PD-1/PD-L1单抗治疗的肿瘤病人需先进行生物标记物；通过PD-1/PD-L1信号通路治疗肿瘤的机理研究还不完全明了；此外还有严重的致命并发症，如免疫性肝炎、免疫性肺炎、免疫性肠癌、免疫性心脏炎症甚至免疫性神经系统炎症。
白细胞介素IL-15是趋化因子家族的一种细胞因子，属于四个小a螺旋束细胞因子家族成员，由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15具有和IL-2相类似的分子结构，并通过与IL-2受体的β链(CD122)和γ链(gc，CD132)与靶细胞结合，发挥类似IL-2的生物学活性。IL-15可诱导B细胞增殖和分化，是唯一能部分取代IL-2诱导初期抗体产生的细胞因子；IL-15能够刺激T细胞和NK细胞增殖，诱导LAK细胞活性，还能与IL-12协同刺激NK细胞产生IFN-γ。白介素15受体由α受体、β受体(CD122)以及γ受体(CD132)组成，其IL-15Rα链与IL-2Rα链的结构相似，为补体调节蛋白(CCP)结构。与IL-2Rα不同，结合力较IL-15R有所不同，IL-15α受体仅具有一个细胞因子结合域“sushi domain”，且IL-15Rα单体与IL15具有较高的亲和力。IL-15/IL-1 5α受体复合物可与免疫细胞表面的IL2/15βc和γc共同作用，通过β、γ受体亚单位能结合并活化酪氨酸激酶Jak-1和Jak-3，导致转录因子STAT-3和STAT-5活化并向细胞核定位；还能诱导B淋巴细胞瘤-2基因，活化丝裂原激酶信号通路，以及非受体型蛋白激酶lck和syk激酶的磷酸化，最终实现对剌激记忆性CD8+T淋巴细胞和NT/NKT细胞增殖。
自从IL15被发现以来，其在诊断、肿瘤筛查、治疗等很多领域都有所应用；随着研究的不断深入，IL15在肿瘤治疗方面展现非常乐观的前景。但是重组的IL15由于其自身固有的半衰期短、剂量控制难、副作用等缺点，使得其在临床应用受到了限制；在后续的研究中，人们通过融合技术来改善这些不足；专利CN1942481A、专利CN100334112C等中设计通过Fc融合手段来研究IL15的应用；专利CN101360827B、专利WO2015/103928A1中设计通过IL15α受体与IL15融合方式探索IL15的应用。近年来IL15靶点与免疫检测点等治疗性抗体联合应用，优良的结果展示出广阔的应用可能性。IL15联合PD-L1抗体和CTLA4抗体在小鼠CT26结肠癌模型中显著的减少肿瘤肺转移结节、延长模型动物的生存期；IL15超级激动剂(ALT-803)与nivolumab(PD-1抗体)联合治疗非小细胞肺癌已进入临床IIIb/IV期研究。
CN105263521A公开了一种免疫调节剂，该发明提供了一种特异性结合PD-L1的抗体和包含利用IL15受体结合结构域构建的PD-L1结合蛋白的融合分子、编码所述抗体或融合分子的核酸分子以及其治疗性组合物。所述试剂抑制PD-L1介导的免疫抑制并且增强细胞和细胞因子介导的免疫，以用于治疗肿瘤性和感染性疾病。
本申请通过柔性连接将PD-L1抗体与IL15或/和IL15α受体胞外段进行融合，以构建具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白，利用PD-L1在肿瘤细胞上的高表达将IL15的效应聚焦到肿瘤微环境，减轻IL15对多种组织器官的副作用，是一种治疗效果良好的抗体融合蛋白。
发明内容
术语：
sushi domain：具有人白介素15受体α活性的胞外域片段的缩短形式。
Knob into Hole结构：杵臼结构，可以使异源抗体重链有效异源二聚化。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供的一种融合蛋白，采用如下技术方案：
本发明所述融合蛋白包含一种肿瘤靶向抗体、柔性连接以及IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述抗体重链单臂与IL15或其变体和/或IL15α受体胞外段或“sushi domain”或其变体通过柔性连接进行融合。其中，所述抗体包括抗体、片段抗体、纳米抗体，以及药学上可接受的载体，所述IL15包括IL15或其变体；所述IL15α受体胞外段包括IL15α受体胞外段、“sushi domain”或其变体。
优选地，所述抗体重链上具有Knob into Hole结构。
根据本发明的一个实施方案，所述抗体为PD-L1抗体。
本发明提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含PD-L1抗体、IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述PD-L1抗体与IL15和/或IL15α受体胞外段通过柔性连接进行融合。
进一步地，所述PD-L1抗体的重链包括SEQ ID NO：1。
优选地，所述PD-L1抗体重链上具有Knob into Hole结构，其中含有Knob突变点S378C和T390W的重链具体序列为SEQ ID NO：2；含有Hole突变位点Y373C、T390S、L392A和Y431V的重链具体序列为SEQ ID NO：3。
进一步地，所述PD-L1抗体的轻链具有以下序列：SEQ ID NO：4。
进一步地，所述柔性连接具有以下序列：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
进一步地，IL15胞外段具有SEQ ID NO：7，IL15α受体胞外段具有SEQ ID NO：8的序列。
进一步地，本发明所述融合蛋白为所述PD-L1抗体重链分别与所述IL15和/或IL15α受体胞外段通过所述的柔性连接串联表达为融合蛋白，包括图7中(a)-(e)所示结构中的一种。
优选地，PD-L1抗体重链单臂与IL15和IL15α受体胞外段串联，具体为图7中(d)和(e)所示结构中的一种。
优选地，所述融合蛋白中一条重链的串联重组序列为SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQ ID N：8-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7，另一条重链的重组序列为SEQ ID NO：2，轻链为SEQ ID NO：4，其具体结构如图7中(e)所示。
本发明还提供了一种融合蛋白的构建表达方法，具体步骤如下：
1.构建载体：将本发明所述重组序列构建到哺乳动物表达载体中，哺乳动物表达载体为pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5，优选neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5，尤其优选pcDNA3.1或neo基因已敲除的pcDNA3.1；具体地，本发明提供以下一种构建方法：
将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V41、3.4-V41或5-V41；
将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V44、3.4-V44或5-V44；
将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V42、3.4-V42或5-V42；
将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V43、3.4-V43或5-V43；
将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：7串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V82、3.4-V82或5-V82；
将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：7串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V83、3.4-V83或5-V83；
将重链重组序列SEQ ID NO：3构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V85、3.4-V85或5-V85；
将重链重组序列SEQ ID NO：2构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V84、3.4-V84或5-V84。
将轻链序列SEQ ID NO：4构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V24、3.4-V24或5-V24；
将轻链重组序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V8、3.4-V8或5-V8；
将轻链重组序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8串联构建到哺乳动物表达载体neo基因已敲除的pcDNA3.1、pcDNA3.4或ptt5中，并将重组质粒分别命名为3.1-V31、3.4-V31或5-V31；
优选地，使用neo基因已敲除的pcDNA3.1载体构建上述重组质粒。
2.融合蛋白表达与纯化
将3.1-V41、3.1-V44、3.1-V24在哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到41-44-24融合蛋白；将3.1-V42、3.1-V43、3.1-V24在哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到42-43-24融合蛋白；将3.1-V41、3.1-V42、3.1-V8在哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到41-42-8融合蛋白。将3.1-V43、3.1-V44、3.1-V31哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到43-44-31融合蛋白；将3.1-V82、3.1-V83、3.1-V24在哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到82-83-24融合蛋白；将3.1-V82、3.1-V85、3.1-V24哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到83-85-24融合蛋白；将3.1-V83、3.1-V84、3.1-V24哺乳动物表达细胞中293F或Expi CHO-S中共转染，得到83-84-24融合蛋白。
优选地，将上述重链和轻链重组载体以1:1的比例转染哺乳动物表达细胞293F中进行表达，收样后进行蛋白纯化。
本发明所述的融合蛋白，通过柔性连接将人源抗体与IL15或/和IL15α受体胞外段进行融合，构建了具有靶向、免疫调节等功能的融合蛋白。
本发明将IL15或者IL15/IL15α受体胞外段与PD-L1抗体融合，靶向肿瘤抗原，将IL15的效应聚焦到肿瘤微环境，减轻IL15对多种组织器官的副作用。IL15α受体的加入促进IL15优先结合CD8+T细胞，而不是调节性T细胞Treg上IL15α受体。在体外具有促进CTLL2细胞和Mo-7e细胞增殖的作用，降低PD-L1的亲和力，阻断PD1与PD-L1的结合，利用PD-L1在肿瘤细胞上的高表达将IL15的效应聚焦到肿瘤微环境，减轻IL15对多种组织器官的副作用；由IL-15带来的特异性活化效应T细胞Teff和NK细胞(自然杀伤性细胞)，正向调节肿瘤微环境中炎症型免疫细胞亚群；PD-L1抗体解除免疫抑制，IL15增强免疫系统杀伤肿瘤的功能，二者协同从免疫正常化和免疫增强化两方面增强免疫系统的功能；引入PD-L1抗体可延长IL15半衰期，从而治疗肿瘤。
附图说明
图1为融合蛋白41-44-24的蛋白纯度HPLC SEC分析图，从图中可以得知提取得到的融合蛋白中含有少量的杂质。
图2为融合蛋白41-44-24的在非还原(NR)或还原(R)的条件下用4％-12％梯度SDS-PAGE电泳展开并用考马斯蓝染色图。
图3为融合蛋白42-43-24、82-83-24、83-84-24以及82-85-24的蛋白纯度HPLC SEC分析图，从图中可以得知提取得到的融合蛋白中含有少量的杂质。
图4为融合蛋白42-43-24、82-83-24、83-84-24以及82-85-24的非还原(NR)或还原(R)的条件下用4％-12％梯度SDS-PAGE电泳展开并用考马斯蓝染色图。
图5为融合蛋白31-6、23-33、30-24以及30-8的蛋白纯度HPLC SEC分析图，从图中可以得知提取得到的融合蛋白中含有少量的杂质。
图6为融合蛋白31-6、23-33、30-24以及30-8的非还原(NR)或还原(R)的条件下用4％-12％梯度SDS-PAGE电泳展开并用考马斯蓝染色图。
图7为融合蛋白的结构示意图。其中，为PD-L1抗体重链上的Knob into Hole结构。
图8为融合蛋白83-84-24，33-23对小鼠肿瘤生长情况的影响结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
所述融合蛋白可具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加。在某些实施方案中，所述抗体包含上述重链可变结构域中的一个和上述轻链可变结构域中的一个。在某些实施方案中，所述PD-L1抗体或其片段抗体、纳米抗体以及药学上可接受的载体所示序列具有至少85％的同一性的氨基酸序列。
一般而言，本发明的融合蛋白的制备可通过本发明公开的程序和重组DNA技术来制备，例如，重组质粒制备、宿主细胞的转化或转染、宿主细胞的培养等。此外，融合蛋白可利用适当试剂盒熟知的方法分离纯化。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得；若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议条件。
术语：
Mabselect Sure：耐强碱的蛋白A亲和层析介质
SP-HP：高分辨率强阳离子填料
Q-HP：高分辨率强阳离子填料
HPLC SEC：尺寸排阻色谱法
SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
GE 8K：GE BiacoreTM 8K新一代分子相互作用分析仪
HBS-EP+：HEPES缓冲液
Biacore：大分子相互作用仪
Glycine-HCl：甘氨酸-盐酸缓冲液。
FBS培养基：胎牛血清培养基
ONE-GloTM Luciferase：ONE-GloTM荧光素酶检测试剂盒
SEC after protein A：尺寸排阻色谱法检测protein A亲和层析后样品
SyproOrange：宝石橙蛋白染色试剂
实施例1 41-44-24融合蛋白的制备
(1)载体构建：将轻链序列SEQ ID NO：4构建到neo基因已敲除的pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V24；将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8构建到neo基因已敲除的pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V41；将与V41对应的重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V44。
(2)融合蛋白表达与纯化：使用OPM-293CD05培养基培养293F细胞准备转染，转染前一天细胞计数，密度2.59×106/mL，活率98.1％，用新鲜培养基稀释细胞至1.5×106/mL；转染当天细胞计数，密度3.01×106/mL，活率98.8％，用新鲜培养基稀释细胞至2.78×106/mL，取1/10转染体积的OPM-293CD05培养基，先以0.5:0.5:1比例加入3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒至质粒浓度为1.5μg/mL(其中重链和轻链重组质粒的比例为1:1)，再加入3倍质粒量的PEI，室温孵育15min；向上述处理好的细胞中加入孵育混合物，边加边混匀，放入摇床培养，培养条件37℃，90rpm，8％CO2，转染后第一天和第四天分别加入补料，转染后第6天收上清备用。
首先使用亲和层析，用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料Mabselect Sure，各处理1小时控内毒素，用20mM PB，150mM NaCl，pH7.2平衡填料。将瞬转表达上清过滤后上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM PB，150mM NaCl洗至UV280峰变水平，再用20mMPB，1M NaCl，pH6.5洗至峰变水平，最后用20mM Cit-Na3Cit，pH3.5洗脱，用1M Tris pH9.0中和。
接下来为阳离子层析，用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料SP-HP，各处理2小时，用20mM PB，pH6.0平衡填料。将亲和层析得的蛋白样品调节pH至6.0并稀释调整电导＜3μS/cm进行上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM PB，pH6.0缓冲液冲洗至UV280基线，再用20mM PB，1M NaCl，pH6.0进行线性梯度洗脱(0％-30％B，20CV)，按峰收集洗脱样品。
最后一步为阴离子层析，用0.5M NaOH冲洗系统，0.1M NaOH冲洗填料Q-HP，各处理2小时，用20mM Tris，pH9.0平衡填料。将亲和层析得的融合蛋白样品调节pH至9.0并稀释调整电导＜3μS/cm进行上样，控制流速1mL/min，上样结束后先用20mM Tris，pH9.0洗至UV280基线，再用20mM Tris，1M NaCl，pH9.0进行线性梯度洗脱(0％-30％B，20CV)，按峰收集洗脱样品即为融合蛋白41-44-24。
(3)融合蛋白确认：使用HPLC SEC分析融合蛋白41-44-24的蛋白纯度，如图1所示，可知提取得到的融合蛋白中含有少量的杂质；其次，通过SDS-PAGE4％-12％梯度胶分析融合蛋白41-44-24，如图2所示，在非还原性SDS-PAGE泳道的150kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约60kDa处可观察到两条主要条带，同时在约25kDa处有一个条带，实验结果表明，通过哺乳动物细胞表达和亲和纯化，得到了单一均质的融合蛋白，且这些蛋白以IgG抗体形式存在。
实施例2
将轻链序列SEQ ID NO：4构建到neo基因已敲除的pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V24；将轻链重组序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V8；将轻链重组序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6-SEQ IDNO：8串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V31；将重链重组序列SEQID NO：2-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V41；将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V44；将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQID NO：8串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V42；将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V43；将重链重组序列SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V82；将重链重组序列SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V83；将重链重组序列SEQ ID NO：3构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V85；将重链重组序列SEQ ID NO：2构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V84。
使用3.1-V42、3.1-V43、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得42-43-24融合蛋白。使用3.1-V41、3.1-V42、3.1-V8重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得41-42-8融合蛋白。使用3.1-V43、3.1-V44、3.1-V31重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得43-44-31融合蛋白。使用3.1-V82、3.1-V83、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得82-83-24融合蛋白。使用3.1-V82、3.1-V85、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得82-85-24融合蛋白。使用3.1-V83、3.1-V84、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1中融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述的蛋白纯化分离方法，可获得83-84-24融合蛋白。
在使用41-42-8、43-44-31这两种融合蛋白在后期进行体外试验时，发现其瞬转量太小，无法进行后续试验，所以没有对其进行进一步的鉴定。此外，我们分别使用HPLC SEC和SDS-PAGE的实验方法对43-44-31、82-83-24、82-85-24或83-84-24融合蛋白进行了鉴定，如图3所示，42-43-24、82-83-24、83-85-24或83-84-24融合蛋白中均含少量杂质，如图4所示，42-43-24融合蛋白在非还原性SDS-PAGE泳道的150kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约60kDa处可观察到两条主要条带，同时在约25kDa处有一个条带；82-83-24融合蛋白在非还原性SDS-PAGE泳道的240kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约70kDa处可观察到两条主要条带，同时在约25kDa处有一个条带；82-85-24或83-84-24融合蛋白在非还原性SDS-PAGE泳道约220kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约90kDa处可观察到一个条带，在50kDa处有一个条带，同时在约25kDa处有一个条带；这些结果表明通过哺乳动物细胞表达和亲和纯化，我们得到了单一均质的融合蛋白，且这些蛋白以IgG抗体形式存在。
对比例1
将重链序列SEQ ID NO：1构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V23；将轻链序列SEQ ID NO：4构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V24；将轻链重组序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V33；将重链重组序列SEQ ID NO：1-SEQID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V32；将重链重组序列SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V6；将重链重组序列SEQ ID NO：1-SEQID NO：6-SEQ ID NO：8串联构建到neo基因已敲除pcDNA3.1载体中，并命名为3.1-V30。
使用3.1-V31、3.1-V23重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到31-23融合蛋白。使用3.1-V31、3.1-V6重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到31-6融合蛋白。使用3.1-V30、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到30-24融合蛋白。使用3.1-V30、3.1-V8重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到30-8融合蛋白。使用3.1-V32、3.1-V24重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到32-24融合蛋白。使用3.1-V33、3.1-V23重组质粒分别替换实施例1融合蛋白表达步骤中3.1-V41、3.1-V44和3.1-V24重组质粒，并使用实施例1所述蛋白纯化分离方法，分别得到33-23融合蛋白。
使用HPLC SEC分析融合蛋白31-23、31-6、30-24、30-8、32-24或33-23的蛋白纯度，如图5所示，可知提取得到的融合蛋白中含有少量的杂质。其次，通过SDS-PAGE 4％-12％梯度胶分析融合蛋白30-24以及30-8，如图6所示，31-6在非还原性SDS-PAGE泳道约240kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约70kDa处可观察到一条条带，同时在约30kDa处有一个条带；31-23在非还原性SDS-PAGE泳道约230kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约50kDa处可观察到一条主要条带，同时在约30kDa处有一个条带；30-24在非还原性SDS-PAGE泳道的150kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约60kDa处可观察到一条条带，同时在约25kDa处有一个条带；30-8在非还原性SDS-PAGE泳道约240kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约60kDa处可观察到一条条带，同时在约37kDa处有一个条带；32-24在非还原性SDS-PAGE泳道约240kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约75kDa处可观察到一条条带；33-23在非还原性SDS-PAGE泳道约240kDa处可观察到单一条带，在还原性SDS-PAGE泳道约50kDa处可观察到一条条带；实验结果表明，通过哺乳动物细胞表达和亲和纯化，得到了单一均质的融合蛋白，且这些蛋白以IgG抗体形式存在。
试验例1融合蛋白PD-L1亲和力测定
采用实施例1、实施例2和对比例1中所制备的融合蛋白，用GE 8K进行Biacore亲和力测定，HBS-EP+为实验缓冲液进行，在25℃条件下进行，将实施例2所得融合蛋白稀释到5μg/mL，以流速10μL/min固定20s至Protein A芯片上。将分析物PD-L1梯度稀释至0、1、3、9、27、81nM以流速30μL/min，结合300s，解离900s，用pH 1.5的10mM Glycine-HCl再生，流速为100μL/min，时间30s，重复一次，结果如表1所示仅有82-83-24、82-85-24、83-84-24融合蛋白的亲和力均大于5E-10KD。
试验例2PD1/PD-L1结合阻断活性测定
采用实施例1、实施例2和对比例1中所制备的融合蛋白，将培养在F12K+10％FBS培养基中的GS-C2/PD-L1细胞100μL，密度为5×105铺板于96孔白板，37℃，5％CO2培养过夜，弃上清加入50μL/孔预先梯度稀释好的融合蛋白，再加入50μL密度为1×106/mL的GS-J2/PD-1细胞，37℃、5％CO2培养6h后每孔加入80μL ONE-GloTM Luciferase，室温反应5min后读取荧光信号，实验结果如表1所示，仅有31-23、31-6、30-24、32-24、41-44-24、42-43-24、82-83-24、82-85-24、83-84-24融合蛋白PD-1/PD-L1的阻断活性EC50均小于16nM。
试验例3CTLL-2细胞增殖活性测定
采用实施例1、实施例2和对比例1中所制备的融合蛋白，CTLL-2细胞来自白血病细胞免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞，属于细胞毒性T细胞亚群，是白介素2(IL-2)依赖性细胞株。取生长状态良好的CTLL-2细胞铺板于96孔板中，将PD-L1抗体/IL-15融合蛋白样品、IL15以及IL-2以相同摩尔浓度梯度稀释，以IL15、IL2为阳性对照，以PD-L1抗体为阴性对照；72小时后用CCK8方法检测CTLL-2细胞增殖情况，实验结果如表1所示，仅有30-8、32-24、23-33、82-83-24、82-85-24、83-84-24融合蛋白的CTLL-2增殖活性EC50均小于30nM。
试验例4Mo-7e细胞增殖活性测定
采用实施例1、实施例2和对比例1中所制备的融合蛋白，Mo-7e细胞来自国家实验细胞资源共享服务平台。取Mo-7e细胞铺板于96孔板中，将PD-L1抗体/IL-15融合蛋白样品以及IL-15以相同摩尔浓度梯度稀释，以IL15为阳性对照，以抗PD-L1抗体为阴性对照，72小时后用CCK8方法检测Mo-7e细胞增殖情况，实验结果如表1所示，仅有30-24、32-24、23-33、82-83-24、82-85-24、83-84-24融合蛋白Mo-7e细胞增殖活性EC50均小于0.4nM。
试验例5瞬转表达量测定
取实施例1、实施例2和对比例1中的融合蛋白的表达上清，经高速冷冻离心机离心后，取上清，通过Protein A-HPLC进行测定，缓冲液PB+150mM NaCl，pH7.0为A流动相；缓冲液150mM NaCl，pH2.9为B流动相。中性条件下，样品溶液通过Protein A柱时可与protein A特异性结合，然后通过B流动相对结合的蛋白进行洗脱，280nm波长下检测并通过外标法进行定量，实验结果如表1所示，所述融合蛋白瞬时表达量均符合实验要求。
试验例6SEC after protein A测定
取实施例1、实施例2和对比例1中亲和层析后的样品，用HPLC进行检测，50mM PB+300mM NaCl为流动相。取≥50μg样品进行上样检测，流速为0.5mL/min，280nm波长下检测，检测时间为30min。检测后，相对比例的单体、高分子量物质及低分子量物质通过紫外检测的峰图进行量化，实验结果如表1所示，除41-42-8和43-44-31外的其他融合蛋白的活性系数AC值均大于50，认为除41-42-8和43-44-31外的其他融合蛋白具有生物活性，可以发挥相关生物学功能。
试验例7TM值测定
采用实施例1、实施例2和对比例1中制备的融合蛋白，运用SyproOrange荧光染料可以检测蛋白的折叠状态，SyproOrange染料在水环境中以致荧光信号淬灭，当蛋白在较高温度下解析折叠时，可暴露疏水基与疏水残基，染料则可以结合疏水区或疏水残基从而增加荧光，利用荧光强度粗略判断蛋白熔点温度。取待检测蛋白，用超纯水稀释到1mg/mL，将染料Orange protein gel stain(5000×)稀释至10×，与稀释好的蛋白等体积混合，分装到96孔荧光PCR板中，用荧光PCR仪器设定加热程序，检测荧光变化，推算蛋白TM值，结果如表1所示。
表1不同分子构型融合蛋白功能分析
试验例8：动物实验
将1×107个/mL MC38细胞，以0.2mL/只接种于5-6周SPF级C57BL/6J小鼠右侧腋窝皮下。待平均肿瘤体积为100mm3左右时，挑选肿瘤生长旺盛且无溃破、健康情况良好的荷瘤动物进行分组。将小鼠分成6组(N＝8)，使得所有组的平均肿瘤尺寸相似，并且起始通过肌肉注射处理(第0天)。各组具体处理方式见下表：
以上各组注射完毕后每周检测体重两次以监测毒性。采用以下公式确定不同时间点的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2×长径×短径2。根据肿瘤生长情况来判断抗肿瘤功效。全部处理均良好耐受。不同处理对肿瘤生长的抑制示于图8。结果表明抗PD-L1/IL-15/IL15Ra显示出有力的抗肿瘤功效：给1mg/kg抗PD-L1/IL-15/IL15Ra组(83-84-24)显著抑制肿瘤生长(P<0.05)，远比相同剂量单独给1mg/kg PD-L1(33-23)抗体更加有效。
综上所述，本发明发明所述的融合蛋白，在体外具有促进CTLL2细胞和Mo-7e细胞增殖的作用，提高了融合蛋白与PD-L1的亲和力，阻断PD1与PD-L1的结合，利用PD-L1在肿瘤细胞上的高表达将IL15的效应聚焦到肿瘤微环境，减轻IL15对多种组织器官的副作用；由IL-15带来的特异性活化Teff和NK细胞，正向调节肿瘤微环境中炎症型免疫细胞亚群；PD-L1抗体解除免疫抑制，IL15增强免疫系统杀伤肿瘤的功能，二者协同从免疫正常化和免疫增强化两方面增强免疫系统的功能；引入PD-L1抗体可延长IL15半衰期，从而治疗肿瘤。
本发明的技术方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 瑞阳(苏州)生物科技有限公司
<120> 一种融合蛋白
<130> 20200429
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
100 105 110
Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 8
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
1 5 10 15
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
20 25 30
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
35 40 45
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
50 55 60
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro
65 70 75

Claims (1)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含一种肿瘤靶向IgG抗体、柔性连接以及IL15和/或IL15α受体胞外段，其中所述IgG抗体重链单臂与IL15和/或IL15α受体胞外段通过柔性连接进行融合；
所述融合蛋白中一条串联重组序列为SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：8-SEQID NO：5-SEQ ID NO：7，另一条重链序列为SEQ ID NO：2，轻链序列为SEQ ID NO：4。
CN202010485056.6A 2019-10-17 2020-06-01 一种融合蛋白 Active CN112679615B (zh)

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