CN117987505A - 对atp结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的抗肿瘤药物。具体而言，本发明提供血管内皮抑制素的突变体，所述突变体具有降低的ATPase活性和提高的新生血管生成抑制活性。本发明还提供所述突变体在治疗肿瘤等新生血管相关疾病中的用途。

Description

对ATP结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体
本申请是申请日为2012年9月10日，申请号为201280078261.4，发明名称为“对ATP结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的抗肿瘤药物。具体而言，本发明提供血管内皮抑制素的突变体，所述突变体具有降低的ATPase活性和提高的新生血管生成抑制活性。本发明还提供所述突变体在治疗肿瘤等新生血管相关疾病中的用途。
背景技术
1997年，美国哈佛大学Judah Folkman教授发现了内源性血管抑制剂——血管内皮抑制素(Endostatin，以下简称ES)。ES是胶原XVIII羧基端分子量为20kDa的酶切产物，具有抑制内皮细胞迁移、增殖和形成管腔的活性。重组血管内皮抑制素可以抑制甚至治愈多种小鼠肿瘤且不产生耐药性(Folkman J.et al.Cell 1997；88:277-285；Folkman J.etal.Nature 1997；390:404-407)。
ES抑制肿瘤的机理是抑制肿瘤新生血管生成、阻断肿瘤营养和氧气供给。在中国，大肠杆菌表达的重组人血管内皮抑制素(商品名：恩度)已成为抗肿瘤药物，其疗效在以非小细胞肺癌为主要适应症的临床试验中得到了广泛验证。恩度是一种N-末端带有附加氨基酸序列(MGGSHHHHH)的ES变体，和酵母表达的天然型人ES相比，具有更好的热动力学稳定性和生物学活性(Fu Y.et al.Biochemistry 2010；49:6420-6429)。另有报道显示，ES蛋白N-末端的27个氨基酸与完整ES相比具有相类似的抑制新生血管生成的活性(Robert TjinTham Sjin,et al.,Cancer Res.2005；65(9):3656-63)，因此，也有很多研究者以N-末端27个氨基酸的活性为基础进行药物设计。
除此之外，为了延长ES在体内的药代半衰期，本领域研究人员还对ES进行了多种分子改造和药物设计，其中包括单点或多点的PEG修饰以及和抗体Fc片段的融合(Tong-Young Lee,et al.,Clin Cancer Res 2008；14(5):1487-1493)。ES的多位点PEG修饰通常通过修饰Lys侧链ε氨基实现，虽然延长了药代半衰期但ES的生物学活性却明显地降低(牟国营，山东大学博士论文，CNKI，2005)。与这种修饰技术相比，N-末端单一定点PEG修饰不但增强了ES的体内稳定性，还提高了ES的生物学活性(ZL200610011247.9)，其相关产品已经进入临床试验阶段。
ES被发现至今，不同实验室对ES抑制肿瘤活性的研究得到了不同的结果。Folkman教授实验室利用ES完全治愈了小鼠肿瘤(Folkman J.et al.,1997,Nature,390:404-407)，然而很多实验室无法重复此结果(News Focus,2002,Science,295:2198-2199)。同时，由于原核表达ES产生的包含体极难复性，很多人利用酵母表达可溶的ES，但效果却不甚理想。后续研究发现，酵母表达的ES在N-末端发生氨基酸缺失，主要缺失形式是N-1，N-3和N-4。而N-末端的完整性对于ES的稳定性和生物学活性至关重要，这在很大程度上解释了利用酵母表达的ES得到的令人困惑的结果(Fu Y.et al.Biochemistry 2010；49:6420-6429)。
ES的主要生物学功能是抑制内皮细胞活性，包括抑制内皮细胞迁移、增殖和形成管腔以及诱导内皮细胞凋亡等。ES分子作用机理研究显示，细胞膜表面的核仁素(Nucleolin)作为ES的功能性受体，可介导ES在内皮细胞中的内吞和下游信号通路(ShiHB,et al.,Blood,2007,110:2899-2906)。另有报道显示，核仁素在旺盛增值的乳腺癌细胞MDA-MB-435膜表面也有表达，并可以介导其配体蛋白在MDA-MB-435中的内吞作用(SvenChristian,et al.,JCB,2003,163(4):871-878)。其他研究还发现了包括integrins，tropomyosin，glypicans，laminin以及matrix metalloproteinase 2(MMP-2)等在内可作为潜在ES受体的ES结合蛋白(Sudhakar,A.,et al.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:4766–4771；Javaherian,K.,et al.,2002,J.Biol.Chem.,277:45211–45218；Karumanchi,S.,et al.,2001,Mol.Cell,7:811–822；Lee,S.J.,et al.,2002,FEBS Lett.,519:147–152；MacDonald,N.J.,et al.,2001,J.Biol.Chem.,276:25190–25196；Kim,Y.M.,et al.,2002,J.Biol.Chem.,277:27872–27879)。此外，制霉菌素(Nystatin)的处理可显著增加ES在内皮细胞中的内吞和摄取，从而增强ES抑制内皮细胞迁移和抑制动物肿瘤生长的生物学活性(Chen Y,et al.,2011,Blood,117:6392-6403)。
经典的ES生物学活性测定方法以其抑制内皮细胞的活性为基础，主要包括抑制内皮细胞迁移、增殖和形成管腔等实验。采用的内皮细胞主要包括人微血管内皮细胞(HMEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。然而，这些方法由于对细胞培养状态要求高、操作复杂和主观性强，准确度和重现性都比较差(Li YH，et al.，2011,Chin J Biologicals March,Vol.24No.3:320-323)。因此，寻找和改进ES及其变体的生物学活性评价方法对于ES药物研发和质量监控具有重要意义。
三磷酸腺苷(ATP)是生命体最基本的能量物质，参与生物体内的多种生理生化反应，对于维持正常的生命活动具有非常重要的意义。ATP可通过多种细胞代谢途径产生：最典型的如真核生物在正常生理条件下主要在线粒体中通过氧化磷酸化由三磷酸腺苷合酶合成，或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成。ATP合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸，正常生理条件下，ATP在细胞和血液中的摩尔浓度分别是1-10mM和100μM。
ATP酶(ATPase)又称三磷酸腺苷酶，是一类可以催化ATP水解产生二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子(Pi)的酶，同时释放能量。在大多数情况下，反应产生的能量可以通过传递而被用于驱动另一个需要能量的化学反应，这一过程被所有已知的生命形式广泛利用。除此之外，三磷酸鸟苷(GTP)所含的高能键也可以为蛋白质的生物合成提供能量。包括Hsp90，myosin等在内的许多蛋白在行使生物学活性时都依赖于ATP，因此这些蛋白本身通常都具有ATP酶(ATPase)活性。尽管各种ATPase在序列和三级结构上各异，但通常都含有P-loop结构作为结合ATP的部位(binding motif)(Andrea T.Deyrup,et al.,1998,JBC,273(16):9450-9456)，而这个P-loop结构主要有以下几种典型序列：GXXGXXK(Driscoll,W.J.,et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:12328–12332)，(G/A)XXXXGK(T/S)(Walker,J.,et al.,1982,EMBO J.,1:945–951)，GXXXXGKS(Satishchandran,C.,et al.,1992,Biochemistry,31:11684–11688)和GXXGXGKS(Thomas,P.M.,et al.,1995,Am.J.Hum.Genet.,59:510–518)。其中，没有用X取代的氨基酸残基相比之下更加保守。通常，这些ATPase中的ATP结合部位也可以结合GTP，因此ATPase和GTPase在很多情况下具有通用性。
癌细胞和处于旺盛增殖期的细胞包括内皮细胞的代谢异常旺盛，且代谢方式和正常成熟细胞相比也存在着很大差异。一方面，癌细胞和增殖期的细胞需要消耗大量ATP；另一方面，癌细胞和增殖期的细胞利用葡萄糖产生ATP的效率却很低。这是由于大多数癌细胞和增殖期的细胞通过有氧糖酵解的方式(the Warburg effect)产生ATP。虽然这种方式产生ATP的效率很低，但由于该过程中会产生大量可用于细胞结构组装的堆砌单位(buildingblocks)，反而更有利于细胞增殖(Matthew G.,et al.,2009,Science,324:1029-1033)。
发明概述
本发明涉及蛋白ES的新活性，即ATP酶活性，即ATPase活性。并公开了以该种新活性为基础的新用途和ES药物设计。
本发明发现，ES具有很强的ATPase活性。在体外生化试验中，ES的ATPase酶活水平和自然界已知具有高ATPase活性的Myosin(猪心提取)相比仅略有降低，但二者降解内皮细胞裂解物中ATP的活性没有显著差异。
基于ES的ATPase活性，本发明公开了一种新的ES生物学活性检测及评价方法，该方法可通过在胞外检测ES的ATPase活性这样的生物化学手段来判断重组制备的ES的构象和生物学活性。和现有的ES细胞学测活方法相比，该酶活检测方法灵敏准确，操作快捷，重现性好，可以广泛适用于ES及其变体的生物学活性及质量评价研究。
因此，本发明提供检测血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的生物学活性的方法，其步骤包括检测所述血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的ATPase活性。例如，可以利用孔雀绿磷酸盐检测法或ATP生物发光检测法检测血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物等产品的ATPase活性，由此判断重组制备的ES产品的构象和生物学活性。
现有技术表明，ES可以经核仁素内吞进入血管内皮细胞。为检测ES是否可以在细胞中发挥ATPase活性，本发明的一个实施例检测了ES在内皮细胞裂解物这种类体内环境下的ATPase活性。结果表明，ES在内皮细胞裂解物中同样可以行使ATPase活性。
本发明发现天然ES序列(SEQ ID NO.1)中第89-95位氨基酸Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys具有ATP经典结合基序(ATP-binding motif)的保守氨基酸序列GXXGXXK(Driscoll,W.J.,et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:12328–12332)。其中，三个氨基酸残基(2个G和1个K)在各种属生物中高度保守。通过对该ATP结合基序中的氨基酸进行定点突变，可以改变ES的ATPase活性。尽管ES的晶体结构已知，但是目前并没有ES与ATP或GTP结合的复合物的晶体结构。所以，在以后的研究中，很可能可以通过共结晶等手段发现ES蛋白中除该经典结合基序以外的与ATP或GTP相互作用的氨基酸位点，通过对这些位点进行删除、替换等改造同样可以得到改变ES的ATPase活性及抑制内皮细胞活性的效果。
基于已知ES晶体结构，我们发现ES的ATP结合部位在三级结构上与ES的C-末端邻近，而ES的N-末端在三级结构上与C-末端也非常靠近。因此，本发明在一个实施例中对于具有不同N-末端序列的ES变体蛋白做了比较。发现N-末端缺失4个氨基酸残基的ES(N-4)具有显著高于全长ES的ATPase活性，而N-4在以往报道中具有显著低于ES的细胞学活性及抑制动物肿瘤的活性(Fu Y.et al.Biochemistry 2010；49:6420-6429)。
以往报道显示，鼠源的ES可以完全治愈小鼠肿瘤(Folkman J.et al.Nature1997；390:404-407)。然而我们通过氨基酸序列比对发现，鼠源ES(MM)并不含有人ES中的经典ATP结合基序(图1)。因此，我们首先检测了MM的ATPase活性，发现MM的ATPase活性与人ES相比明显降低，只有人ES的大约1/5的活性，但抑制肿瘤的活性却高于人ES。
因此，为了进一步验证ATPase活性与ES细胞学活性的关系，我们对人ES的ATP结合位点中的某些氨基酸残基进行了定点突变。发现，这些突变不但可以改变ES的ATPase活性，还可以改变ES抑制内皮细胞迁移的活性。而且，多个ES的突变体尽管ATPase活性降低，但抑制内皮细胞迁移的活性却显著提高，除个别情况外，ATPase活性与细胞学活性负相关。
在本发明的一些实施例中，具有SEQ ID NO.6-11、13、14、15-27和30-31所示序列的ES突变体均显示出低于ES的ATPase活性和相当于或显著高于ES的抑制内皮细胞迁移的活性。根据现有技术，即ES是一个血管抑制剂蛋白，其最基本的功能是通过抑制内皮细胞活性来抑制新生血管生成，从而治疗与新生血管生成相关的疾病(如肿瘤、视网膜黄斑变性、肥胖症和糖尿病等等)，我们认为这些ES突变体可以具有更强的抑制新生血管生成相关疾病(如肿瘤)的活性。
此外，基于ES的抗新生血管活性与其ATPase活性相关性的发现，可以利用分子克隆手段进一步通过改变(如降低)ATPase活性来设计ES突变体，从而得到更好的抑制肿瘤和新生血管相关疾病的ES药物。
因此，本发明还提供提高血管内皮抑制素的生物学活性的方法，其包括降低血管内皮抑制素或其变体的ATPase活性。具体地，可以通过基因工程手段对血管内皮抑制素或其变体的ATP结合基序GXXGXXK进行突变，从而获得具有降低的ATPase活性的血管内皮抑制素突变体，所述血管内皮抑制素突变体具有提高的生物学活性，例如提高的抑制内皮细胞迁移的活性和提高的抑制肿瘤的活性。
本发明还提供血管内皮抑制素突变体，所述突变体具有提高的抗新生血管生成的活性，其中所述突变体在其ATP结合位点包含突变，且与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低。
优选地，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约30％，例如降低至少大约50％，降低至少大约70％，或降低至少大约90％。例如，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性仅保留至多大约60-70％，例如保留至多大约50-60％，保留至多大约40-50％，保留至多大约30-40％，保留至多大约20-30％，保留至多大约10-20％，或保留不足10％或更低。在一个实施方式中，所述突变体不具有ATPase活性。
在一些实施方式中，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体在其ATP结合基序中包含突变。例如，所述突变体在相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列中包含突变，其中所述突变选自一或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加或其组合，其中所述突变导致所述突变体的ATPase活性降低或消除。
在一些实施方式中，所述突变体的相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列被部分或全部缺失。
优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含以下突变：(a)相应于SEQ ID NO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸或芳香族的氨基酸取代或被缺失；或(b)相应于SEQ ID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自带正电荷的氨基酸或不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或(d)(a)-(c)的任意组合。
更优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含以下突变：(a)相应于SEQ IDNO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自Ala和Pro的氨基酸取代或被缺失；或(b)相应于SEQID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由Ala取代或被缺失；或(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自Arg和Gln的氨基酸取代或被缺失；或(d)(a)-(c)的任意组合。
当然，在不影响突变体蛋白质分子的电荷分布和构象的前提下，也可以选取带电荷的氨基酸进行上述的取代。
在具体的实施方式中，本发明的血管内皮抑制素突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6-11、13、14、15-27和30-31。优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.30。
优选地，本发明的上述血管内皮抑制素突变体是人血管内皮抑制素的突变体。
本发明还提供药物组合物，其包含如上所述的本发明的血管内皮抑制素突变体。在本发明的药物组合物中，所述血管内皮抑制素可以共价连接于PEG分子。所述PEG分子的分子量例如为5-40kD，例如5-20kD，或者20-40kD，优选地所述PEG分子的分子量为20kD，例如为20kD的单甲氧基聚乙二醇，例如单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。优选地，所述PEG分子共价连接于所述血管内皮抑制素的N-末端α氨基。
本发明还提供治疗肿瘤的方法，包括给肿瘤患者施用如上所述的本发明的血管内皮抑制素突变体或如上所述的本发明的药物组合物。
本发明还涉及如上所述的血管内皮抑制素突变体在制备治疗新生血管相关疾病的药物中的用途。优选地，所述新生血管相关疾病是肿瘤。
附图说明
图1：人和鼠ES的序列比对。
图2：ES、ES突变体、ES变体及它们的mPEG修饰产物的制备。
(A)工程菌表达；
(B)包含体蛋白纯化；
(C)复性蛋白纯化；
(D)修饰后蛋白纯化；
图3：ES，ES变体及它们的mPEG修饰产物具有ATPase活性。
图4：ES，ES变体及它们的mPEG修饰产物在内皮细胞全细胞裂解液中具有ATPase活性。
(A)ES和mPEG-ES可降解内皮细胞全细胞裂解液中的ATP。
(B)ES，Endu及它们的mPEG修饰产物可降解内皮细胞全细胞裂解液中的ATP。
图5：利用ATPase活性检测可以快捷准确的对ES、ES变体及其mPEG修饰产物进行生物学活性测定。
(A)基于ATPase活性检测ES和Endu活性的标准曲线。
(B)基于ATPase活性检测mPEG-ES和mPEG-Endu活性的标准曲线。
图6：ES突变体的ATPase活性比较。
图7：ES突变体降解内皮细胞全细胞裂解液中ATP的活性比较。
图8：ES突变体抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图9：Endu突变体的ATPase活性及抑制内皮细胞迁移活性的比较。
(A)Endu突变体的ATPase活性比较。
(B)Endu突变体抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图10：天然人ES序列。
图11：大肠杆菌重组表达的人ES序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图12：大肠杆菌重组表达的人N-4序列，其中N-末端第一个氨基酸M和C-末端最后一个氨基酸K可在重组表达时被随机删除。
图13：大肠杆菌重组表达的Endu序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图14：大肠杆菌重组表达的ES001序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图15：大肠杆菌重组表达的ES003序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图16：大肠杆菌重组表达的ES004序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图17：大肠杆菌重组表达的ES005序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图18：大肠杆菌重组表达的ES006序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图19：大肠杆菌重组表达的ES007序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图20：大肠杆菌重组表达的ES008序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图21：大肠杆菌重组表达的Endu001序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图22：大肠杆菌重组表达的Endu003序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图23：大肠杆菌重组表达的Endu008序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图24：大肠杆菌重组表达的ES010序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图25：大肠杆菌重组表达的ES011序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图26：大肠杆菌重组表达的ES012序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图27：大肠杆菌重组表达的S01序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图28：大肠杆菌重组表达的S02序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图29：大肠杆菌重组表达的S09序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图30：大肠杆菌重组表达的S10序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图31：大肠杆菌重组表达的S12序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图32：大肠杆菌重组表达的Z005序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图33：大肠杆菌重组表达的Z006序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图34：大肠杆菌重组表达的Z008序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图35：大肠杆菌重组表达的Z009序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图36：大肠杆菌重组表达的Z101序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图37：大肠杆菌重组表达的Z103序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图38：大肠杆菌重组表达的Z104序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图39：大肠杆菌重组表达的ZN1序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图40：大肠杆菌重组表达的ZN2序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图41：大肠杆菌重组表达的ZN3序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图42：大肠杆菌重组表达的ZN4序列，其中N-末端第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。
图43：ES突变体ES010、ES011、ES012抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图44：ES突变体S01、S02、S09、S10抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图45：ES突变体S12抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图46：ES突变体Z005、Z006、Z008、Z009抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图47：ES突变体Z101、Z103、Z104、ZN1、ZN2、ZN3、ZN4抑制内皮细胞迁移活性的比较。
图48：ES突变体在动物体水平上对非小细胞肺癌A549肿瘤生长的抑制效果，(A)肿瘤体积，(B)肿瘤重量。
发明详述
除非另有说明，否则本说明书中所使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。通常，本说明书中所使用的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学有关的命名及其技术是本领域公知和常用的。
除非另有说明，否则本说明书中所使用的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法和本说明书中所阐述的或引用的各种参考文献中所述的方式来进行。例如参见Sambrook J.及Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。
在本说明书及权利要求书中，“包含”一词应理解为既可表示仅包括所述的元件或元件的组，也可表示在所述的元件或元件的组的基础上不排除任何其它元件或元件的组。除非另有说明，否则当本说明书使用术语“一”、“一个”或“一种”时，其意味着“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。
本说明书中所引用的所有出版物、专利及专利申请均以全文引用的方式并入本说明书中。
ES、ES变体、ES突变体及PEG修饰产物
ES(Endostatin)指天然的血管内皮抑制素，例如具有SEQ ID NO.1的序列的人血管内皮抑制素(图10)。ES变体指在天然ES序列的基础上，其N-末端或C-末端添加或缺失1-15个氨基酸的形式。ES变体可以是天然产生的，例如，当人ES在大肠杆菌中重组表达时，其第一个氨基酸M可被随机删除，产生具有SEQ ID NO.2的序列的ES变体(图11)。再例如，当ES在酵母中重组表达时，由于N-末端发生随机剪切，可产生N-末端缺失4个氨基酸的ES变体(N-4)，具有SEQ ID NO.3所示的序列(图12)，进一步地，其中C-末端的K还可被随机删除。ES变体也可以是人工产生的，例如，为了促进蛋白表达和提高稳定性，恩度(Endu)在天然ES的N-末端添加了序列为MGGSHHHHH的9个附加氨基酸残基，该变体具有SEQ ID NO.4所示的序列(图13)，其中第一个氨基酸M可在重组表达时被随机删除。在本申请中，ES变体是指与相应的天然ES具有相同或相似的抑制新生血管生成的活性，且与相应的天然ES具有相同的ATP结合基序以及相同或相似的ATP酶活性的天然存在的或人工产生的ES变体。
在本申请中，ES的突变体指的是对天然ES或ES变体的ATP结合位点进行改造，例如对ATP结合基序进行氨基酸定点突变，而获得的突变蛋白质。
本发明中使用的ES、ES变体及ES突变体蛋白除Endu购自先声麦得津公司，其余均由北京普罗吉公司提供。
聚乙二醇(PEG)修饰的ES、Endu和N-4分别命名为mPEG-ES、mPEG-Endu和mPEG-N-4，它们分别是一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个ES、Endu或N-4分子得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与ES、Endu或N-4的N-末端α-氨基。
ATP生物发光检测试剂盒(Sigma-Aldrich)
这是一种被广泛认可和使用的ATP检测方法，具有极高的灵敏度。原理如下：萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)通过催化其底物荧光素(luciferin)氧化发射出光子，该过程需利用ATP的能量。因此，萤火虫荧光素酶催化的发光反应中，发光强度与被检测体系中的ATP浓度具有很好的线性依赖关系。所以，我们利用生物发光分析仪(BertholdTechnologies Centro LB 960)检测各组反应物中的发光反应强度，就可以准确计算出反应体系中的ATP浓度。
孔雀绿磷酸盐检测试剂盒(Malachite Green Phosphate Assay Kits，BioAssaySystems)
这是一种被广泛认可和使用的ATP酶活性检测方法。原理是在酸性条件下孔雀绿、钼酸盐和无机磷酸反应形成绿色的物质，可在600～660nm的波长范围内检测，其吸光值与磷酸盐含量在一定范围内呈很好线性关系。ATP酶在催化ATP水解的过程中释放出ADP和磷酸(Pi)，利用该试剂盒测得的磷酸含量计算ATP酶的活性。这种方法既方便又迅速，被广泛应用于磷酸酯酶(Phosphatase)活性、脂肪酶(Lipase)活性、三磷酸核苷酶(NucleosideTriphosphatase)活性和无机磷酸盐(Phosphate)含量分析以及大通量药物筛选。ATP结合基序(ATP-binding motif)
指具有ATPase活性的蛋白分子中与ATP结合的典型一级序列。ATP结合基序通常具有P-loop结构，这个P-loop结构主要有以下几种典型序列：GXXGXXK，(G/A)XXXXGK(T/S)，GXXXXGKS和GXXGXGKS。对人ES而言，ATP结合基序指GXXGXXK这段序列。其中，没有用X取代的氨基酸残基相比之下更加保守。通常，这些ATP结合基序也可以结合GTP。
ATP结合位点(ATP-binding site)
指具有ATPase活性的蛋白分子中可以结合ATP的部位，包括经典的ATP结合基序(ATP-binding motif)和ATP结合基序以外参与ATP结合的氨基酸位点。这些氨基酸在蛋白一级序列上可以远离上述ATP结合基序，但在三级结构上参与ES与ATP/GTP相互作用的氨基酸，或者这些氨基酸位点的取代或缺失可以通过影响蛋白构象间接影响到ES与ATP/GTP相互作用，从而改变ES的ATPase活性。
本发明基于对ES新活性(ATPase活性)的发现，公开了一种评价ES生物学活性的新方法，与现有利用内皮细胞迁移测活的方法相比具有更加便捷、准确和重复性好的特点。这为ES及其变体、突变体的机理研究、药物研发和质量控制提供了重要研究方法。
因此，本发明提供检测血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的生物学活性的方法，其步骤包括检测所述血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的ATPase活性。例如，可以利用孔雀绿磷酸盐检测法或ATP生物发光检测法检测血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物等产品的ATPase活性，由此判断重组制备的ES产品的构象和生物学活性。
同时，通过与现有报道的几种作为ATP结合基序(ATP-binding motif)的P-loop结构氨基酸序列比较，我们发现ES一级序列中第89-95位氨基酸Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys具有符合GXXGXXK的典型ATP结合基序，可作为ES行使ATPase活性的结构基础(图10)。
基于ES的晶体结构信息，我们发现由于ES的ATP结合基序在三维结构上距离N-末端较近，所以N-末端序列改变带来的空间位阻变化可能会影响到ES的ATPase活性。因此，在本发明的一个实施例中，我们检测了ES变体Endu(N-末端带有9个附加氨基酸残基)以及N-4(N-末端缺失4个氨基酸残基的ES)的ATPase活性。结果显示，ES及其变体Endu、N-4都具有ATPase活性。其中，Endu的ATPase活性与ES相比有明显降低，但N-4的ATPase活性与N-末端完整的ES相比显著升高(图3)。这一结果说明，N-末端完整性不同导致的局部空间位阻变化对于ES的ATPase活性的确有影响。因此，通过共结晶解析获悉的除GXXGXXK这一典型ATP结合基序以外的ES与ATP相互作用位点将是潜在的ATPase活性改造位点。
由于已有数据报道，ES和Endu的N-末端α-氨基在被mPEG单一定点修饰后，抑制内皮细胞迁移的活性得到了显著的增强(ZL200610011247.9)。因此，本发明的一个实施例中，同时检测了mPEG-ES，mPEG-Endu和mPEG-N-4的ATPase活性，发现与修饰前相比都显著降低(图3)。因此，我们发现这一组ES、ES变体及它们的mPEG修饰产物的ATPase活性与抑制内皮细胞迁移的活性负相关，即ATPase活性越高，抑制内皮细胞迁移的活性越低。这一结果在ES变体N-4中已得到验证：N-4的ATPase活性高于ES和Endu(图3)，而其细胞学活性与ES和Endu相比显著降低(Fu Y.et al.Biochemistry2010；49:6420-6429)。
从以上数据中，我们发现了所检测的ES、ES变体及它们的mPEG修饰产物的ATPase活性与抑制内皮细胞迁移的活性负相关的规律。基于此项发现，为了得到具有更高抗内皮细胞迁移活性的ES，我们可以通过对ES的ATP结合位点进行氨基酸定点突变的方法降低ES的ATPase活性。
因此，本发明还提供提高血管内皮抑制素的生物学活性的方法，其包括降低血管内皮抑制素或其变体的ATPase活性。具体地，可以通过基因工程手段对血管内皮抑制素或其变体的ATP结合基序GXXGXXK进行突变，从而获得具有降低的ATPase活性的血管内皮抑制素突变体，所述血管内皮抑制素突变体具有提高的生物学活性，例如提高的抑制内皮细胞迁移的活性和提高的抑制肿瘤的活性。
因此，在本发明的一个实施例中，针对ES中的ATP结合位点引入了如下突变形式：
ES001——ES-K96R(SEQ ID NO.5)(图14)
ES003——ES-G90A(SEQ ID NO.6)(图15)
ES004——ES-G93A&K96R(SEQ ID NO.7)(图16)
ES005——ES-G90A&G93A&K96R(SEQ ID NO.8)(图17)
ES006——ES-G93A(SEQ ID NO.9)(图18)
ES007——ES-G90A&E92K&G93A&K96R(SEQ ID NO.10)(图19)
ES008——ES-E92Q&P94Q&K96Q(SEQ ID NO.11)(图20)
利用生化方法检测ATPase活性时，突变体的ATPase活性与ES相比明显升高，而突变体ES003，ES004，ES005，ES006，ES007和ES008的ATPase活性和ES相比则发生显著降低(图6)。虽然ES可以被内皮细胞内吞，从而降解细胞内的ATP，但活细胞可以迅速代偿ATP的消耗，现有技术通常通过检测全细胞裂解液的ATP降解情况来代替活细胞内的ATP含量检测。在全细胞裂解液的条件下，突变体ES003，ES006，ES007和ES008的ATPase活性仍然明显低于ES(图7A)。但是突变体ES001，ES004和ES005的ATPase活性却和ES相当(图7B)。这也许由于突变造成的P-loop结构的改变影响了整个蛋白与ATP的相互作用所致。
接下来，我们继续验证了这些ES突变体抑制内皮细胞迁移的活性，发现与预期基本吻合，即除个别例外，多数ES突变体的ATPase活性与其抑制内皮细胞迁移的活性负相关(图8)。
此外，在本发明的一个实施例中，还对于ES的变体Endu也进行了相同方式的突变：
Endu001——Endu-K104R(SEQ ID NO.12)(图21)
Endu003——Endu-G98A(SEQ ID NO.13)(图22)
Endu008——Endu-E100Q&P102Q&K104Q(SEQ ID NO.14)(图23)
发现ATP结合位点突变对Endu的ATPase活性和抑制内皮细胞迁移活性的改变与相同突变方式对ES相关活性的改变相类似。因此，我们认为针对ES的ATP结合位点进行突变，改变ES的ATPase活性及抑制内皮细胞迁移活性的方法也适用于ES变体。
因此，本发明还提供血管内皮抑制素突变体，所述突变体具有提高的抗新生血管生成的活性，其中所述突变体在其ATP结合位点包含突变，且与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低。
优选地，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约30％，例如降低至少大约50％，降低至少大约70％，或降低至少大约90％。例如，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性仅保留至多大约60-70％，例如保留至多大约50-60％，保留至多大约40-50％，保留至多大约30-40％，保留至多大约20-30％，保留至多大约10-20％，或保留不足10％或更低。在一个实施方式中，所述突变体不具有ATPase活性。
在一些实施方式中，与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体在其ATP结合基序中包含突变。例如，所述突变体在相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列中包含突变，其中所述突变选自一或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加或其组合，其中所述突变导致所述突变体的ATPase活性降低或消除。
在一些实施方式中，所述突变体的相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列被部分或全部缺失。
优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含以下突变：(a)相应于SEQ ID NO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸或芳香族的氨基酸取代或被缺失；或(b)相应于SEQ ID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自带正电荷的氨基酸或不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或(d)(a)-(c)的任意组合。
更优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含以下突变：(a)相应于SEQ IDNO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自Ala和Pro的氨基酸取代或被缺失；或(b)相应于SEQID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由Ala取代或被缺失；或(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自Arg和Gln的氨基酸取代或被缺失；或(d)(a)-(c)的任意组合。
在具体的实施方式中，本发明的血管内皮抑制素突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6-11、13、14、15-27和30-31。优选地，本发明的血管内皮抑制素突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.30。
优选地，本发明的上述血管内皮抑制素突变体是人血管内皮抑制素的突变体。
本发明还提供药物组合物，其包含如上所述的本发明的血管内皮抑制素突变体。在本发明的药物组合物中，所述血管内皮抑制素可以共价连接于PEG分子。所述PEG分子的分子量例如为5-40kD，例如5-20kD，或者20-40kD，优选地所述PEG分子的分子量为20kD，例如为20kD的单甲氧基聚乙二醇，例如单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。优选地，所述PEG分子共价连接于所述血管内皮抑制素的N-末端α氨基。
本发明还提供治疗肿瘤的方法，包括给肿瘤患者施用如上所述的本发明的血管内皮抑制素突变体或如上所述的本发明的药物组合物。
本发明还涉及如上所述的血管内皮抑制素突变体在制备治疗新生血管相关疾病的药物中的用途。优选地，所述新生血管相关疾病是肿瘤。
通过以下非限制性的实施例进一步阐述本发明，应该理解，本发明并不限于这些实施例中。
实施例
实施例1：构建ES重组菌株
本实施例中，从人肝癌细胞A549的cDNA中克隆出Endostatin，并连接到pET30a质粒中。基因扩增使用的5’端引物为GGAATTCCATATGCACAGCCACCGCGACTTC，3’端引物为CCGCTCGAGT TACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG。内切酶分别是NdeI和XhoI。
将上述重组质粒按照常规技术转化到大肠杆菌中，并进行表达。
实施例2：构建ATP结合位点突变的ES或Endu突变体菌株
本实施例中，对野生型人ES的ATP结合位点进行突变改造，具体方法以及上、下游引物及转化方法同实施例1。突变体编号如下：
ES001——ES-K96R(SEQ ID NO.5)(图14)
ES003——ES-G90A(SEQ ID NO.6)(图15)
ES004——ES-G93A&K96R(SEQ ID NO.7)(图16)
ES005——ES-G90A&G93A&K96R(SEQ ID NO.8)(图17)
ES006——ES-G93A(SEQ ID NO.9)(图18)
ES007——ES-G90A&E92K&G93A&K96R(SEQ ID NO.10)(图19)
ES008——ES-E92Q&P94Q&K96Q(SEQ ID NO.11)(图20)
同时，作为对照，我们还以Endu的序列为基础，用上述同样方法构建了ATP结合位点的突变体：Endu001，Endu003和Endu008。
Endu001——Endu-K104R(SEQ ID NO.12)(图21)
Endu003——Endu-G98A(SEQ ID NO.13)(图22)
Endu008——Endu-E100Q&P102Q&K104Q(SEQ ID NO.14)(图23)
实施例3：重组ES及其突变体、Endu突变体的表达制备
本实施例中，以ES003为例简述ES及其突变体、Endu突变体的表达及制备方法如下：ES及其突变体的菌种经LB培养基摇瓶扩培过夜后接种到5L发酵罐(Sartorius)发酵，适时加入IPTG诱导，培养约4小时后收集菌体(图2A)。菌体用缓冲液重悬，并用高压均质机彻底破碎，反复破碎3次，每一次均离心留沉淀。然后用DEAE或者Q柱(GE Healthcare)，CM或者SP柱(GE Healthcare)，在pH 4.0～10.0的范围梯度洗脱，分别纯化复性前后的蛋白样品，得到纯度大于95％的复性蛋白(图2B、C)。将复性蛋白浓缩后对PBS或者NaAc-HAc透析，用平均分子量为20kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD，20kDa，北京键凯科技有限公司)按照产品说明书提示的操作方法对复性蛋白进行N-末端单修饰，修饰产物用CM或者SP柱(GEHealthcare)纯化，并在pH4.0～10.0的范围梯度洗脱，得到目标组分(图2D)。
实施例4：ES及其变体是高效的ATP酶
本实施例中，首先配制50mM HEPES，1mM EDTA，0.02％ NaN3，pH 7.4的样品稀释液，用样品稀释液将ES及其变体Endu，N-4稀释到终浓度500μg/mL。第一组：阴性对照组，样品稀释液加入等体积的无蛋白缓冲液；第二组，ES及其变体Endu，N-4，终浓度500μg/mL。
将配好的待测样品或对照样品中加入终浓度为500μM的ATP，置于37℃水浴中反应30min，然后冰浴5min终止反应。ES及其变体的样品处理操作同第一组，且与第一组平行进行。
以上操作完成后将两组样品分别稀释适当倍数，依次加入到96孔酶标板中，使用孔雀绿磷酸盐检测试剂盒(Malachite Green Phosphate Assay Kits，BioAssaySystems)，通过酶标仪(Multiskan mk3，Thermo Scientific)检测96孔板中各组样品的吸光度，计算出反应体系中的磷酸盐浓度，再根据生成的磷酸盐量计算出ES的ATP酶活性：
ATP酶活性(nM/mg/min)＝Δ磷酸盐浓度(nM/ml)/反应时间(30min)/ES或其变体浓度(mg/ml)
结果显示，ES，Endu和N-4都具有很强的ATPase活性，其中N-4的ATPase活性最高。
我们用同样的方法检测了经mPEG修饰的ES，Endu和N-4的ATPase活性，发现mPEG-ES，mPEG-Endu和mPEG-N-4的ATPase活性与ES，Endu和N-4相比均分别有所下降。
以上试验采用公认的自然界中具有较高ATPase活性的蛋白Myosin(提取自猪心，Sigma)作为阳性对照。结果显示，ES及其变体是高效的ATP酶(图3)。
实施例5：ES、Endu及其mPEG修饰产物能够显著降低人血管内皮细胞全细胞匀浆液中的ATP含量，从而发挥ATPase活性
本实施例中，人血管内皮细胞首先被收集，并使用细胞裂解液将细胞溶解成为溶液形式的全细胞裂解组分，低温离心去除细胞匀浆的沉淀、杂质和碎片等(以上操作在冰上低温条件下完成)；再将细胞裂解组分平均分成四组加以不同处理，处理分组方法如下。第一组：阴性对照组，加入等体积无蛋白缓冲液；第二组，加入ES(50μg/mL)处理；第三组，加入ES(100μg/mL)处理；第四组，加入ES(200μg/mL)处理。加入ES后立刻将各组放置于室温条件下进行反应，25分钟后再次放回冰上以终止反应。使用ATP生物发光检测试剂盒(Sigma-Aldrich)对各组细胞匀浆中的ATP含量进行检测。结果显示，与对照组相比，ES处理能够显著分解并降低人血管内皮细胞裂解组分中的ATP水平。这一结果与实施例4的发现相一致，这也证明了ES的降解ATP功能是可以在细胞裂解液这类较复杂体系中进行的。同时，我们发现聚乙二醇修饰的ES(mPEG-ES)也可以显著分解并降低人血管内皮细胞裂解组分中的ATP水平，只是在ES和mPEG-ES剂量相同(分别加入50，100，200μg/mL)、处理时间也相同的情况下，mPEG-ES降解ATP的活性稍低于ES(图4A)。
在本实施例中，ES还可以被替换为与ES作用机理相同的蛋白或其变体Endu。在Endu及其mPEG修饰产物(mPEG-Endu)(即在N-末端带MGGSHHHHH附加氨基酸的ES基础上再进行mPEG-ALD，20kDa修饰)的平行比较实验中，也观察到了类似的结果。利用本实施例中所述的相同实验方法获得人血管内皮细胞的全细胞裂解组分，并平均分成七组加以不同处理，处理分组方法如下。第一组：阴性对照组，无处理；第二组，阴性对照组，加入牛血清白蛋白BSA(100μg/mL)处理，BSA是一种已知的不具有ATP酶活性的蛋白质，常用作此类实验中的阴性对照蛋白；第三组，阳性对照组，加入猪心肌球蛋白Myosin(100μg/mL)处理，肌球蛋白是一种已知的具有很高ATP酶活性的蛋白质，用作阳性对照蛋白；第四组，加入ES(100μg/mL)处理；第五组，加入mPEG-ES(100μg/mL)处理；第六组，加入Endu(100μg/mL)处理；第七组，加入mPEG-Endu(100μg/mL)处理。分别加入ES、Endu或其mPEG修饰产物后立刻将各组放置于室温条件下进行反应，25分钟后再次放回冰上以终止反应。实验结果显示，在Myosin，BSA，ES，mPEG-ES，Endu及mPEG-Endu剂量相同、反应条件完全相同的情况下，Myosin的ATP降解活性即ATP酶活性最高，ES，mPEG-ES，Endu及mPEG-Endu也都显示出各自的ATP降解活性即ATP酶活性。在ES，mPEG-ES，Endu及mPEG-Endu之中：天然序列ES的ATP酶活性最高，接近Myosin；mPEG-ES的ATP酶活性第二高，比ES略有下降；Endu及mPEG-Endu的ATP酶活性分别更低一些(图4B)。
实施例6：ATPase活性评价是一种便捷准确、重现性好的ES的活性测定方法
本实施例中，采用实施例4所述的实验方法，建立了ES及其变体、PEG修饰产物ATPase活性测定的方法。其中，ES，Endu，mPEG-ES和mPEG-Endu分别在冰浴条件下用样品稀释液稀释成一系列浓度梯度的待测样品(具体浓度如图5所示)。以上操作完成后，将稀释后的样品加入到96孔酶标板中，使用孔雀绿磷酸盐检测试剂盒(Malachite Green PhosphateAssay Kits，BioAssay Systems)检测各样品OD630吸光值。根据样品稀释倍数计算出稀释后的样品浓度，并计算出对应的ΔOD630。
ΔOD630＝S1(OD630)-S2(OD630)
以样品浓度为横坐标，以对应的ΔOD630为纵坐标做曲线。以同样的步骤平行的对mPEG-ES、Endu、mPEG-Endu检测和作图，结果显示ES、mPEG-ES、Endu、mPEG-Endu四种样品浓度和ΔOD630之间均有良好的线性关系，其R2均大于0.99(图5)。因此，在确定线性范围的前提下，该方法可以广泛用于ES，ES变体及它们的PEG修饰产物的活性测定。
实施例7：ES中ATP结合位点的突变导致ES的生化ATPase活性发生改变
利用实施例4所述的方法，检测了ES的ATP结合位点发生突变后的ATP酶活。结果显示，除突变体ES001的酶活性较ES有所升高以外，突变体ES003-ES008的ATPase活性和ES相比都显著降低，与鼠血管内皮抑制素(MM)的ATPase活性相当(图6)。
实施例8：ES中ATP结合位点的突变导致ES在全细胞裂解液中的ATPase活性发生改变
利用实施例5中的实验方法，收集人血管内皮细胞，并使用细胞裂解液将细胞溶解成为溶液形式的全细胞裂解组分，低温离心去除细胞匀浆的沉淀、杂质和碎片等；再将细胞裂解组分平均分成数组加以不同处理，处理分组方法如下。第一组：阴性对照组，无ES(加入等量缓冲溶液)处理；第二组，加入ES(100μg/mL)处理；第三组，加入小鼠来源的血管内皮抑制素MM(100μg/mL)处理；第四组，加入ES突变体ES003(100μg/mL)处理；第五组，加入ES突变体ES006(100μg/mL)处理；第六组，加入ES突变体ES007(100μg/mL)处理；第七组，加入ES突变体ES008(100μg/mL)处理。使用ATP生物发光检测试剂盒(Sigma-Aldrich)对各组细胞匀浆中的ATP含量进行检测。结果显示，野生型人ES具有明显的ATP降解活性，而小鼠来源的MM由于没有典型的ATP结合区域，因而ATP酶活性天生就很低，ES突变体ES003、ES006、ES007、ES008由于ATP结合区域发生了不同程度的突变，其降解ATP的活性与野生型ES相比均显著下降，其中突变体ES003和ES008的ATPase活性降低幅度最为显著(图7A)。
另一组实验中，我们利用相同的方法检测了ES突变体ES001、ES004、ES005全细胞裂解液中的ATPase活性，发现它们具有与ES相当或略高的ATPase活性(图7B)。
实施例9：ATP结合位点的突变导致ES抑制内皮细胞迁移的活性发生改变
细胞迁移的测定方法：人微血管内皮细胞(HMEC，来自于ATCC)每孔2×104个细胞接种到TranswellTM吊篮(8μm孔径，Costar)的上层含1％胎牛血清的DMEM(Hyclone)培养基中。同时在吊篮的上层和下层加入相同浓度的ES(20μg/mL)。在37℃和5％ CO2条件下培养6小时使细胞迁移。然后，用戊二醛固定和结晶紫染色，每个孔随机选取5个放大视野，计算其中完全穿过膜迁移到板下层的细胞数并取平均值，再与对照组相比计算出细胞迁移数目减少的情况(即各组蛋白的抑制率)。每一组平行三个孔，实验独立重复至少两次。
本实施例中，内皮细胞HMEC被分成如下各组加以不同处理。第一组：阴性对照组，无ES(加入等量缓冲溶液)处理；第二组，加入ES(20μg/mL)处理；第三组，加入小鼠来源的血管内皮抑制素MM(20μg/mL)处理；第四组，加入ES突变体ES003(20μg/mL)处理；第五组，加入ES突变体ES006(20μg/mL)处理；第六组，加入ES突变体ES007(20μg/mL)处理；第七组，加入ES突变体ES008(20μg/mL)处理。结果显示，MM，突变体ES003、ES006、ES007、ES008抑制内皮细胞迁移的活性与ES相比显著增加(图8A)。
在另一组实验中，我们用相同方法比较了ES001，ES003，ES004和ES005抑制内皮细胞的活性，发现除ES003的活性比ES显著升高以外，其余突变体的活性都比ES有所降低(图8B)。
实施例10：ATP结合位点的突变导致Endu的ATPase活性和抑制内皮细胞迁移的活性发生改变
利用实施例4和实施例9中所述的方法，本实施例分别比较了Endu突变体的ATPase活性(图9A)和抑制内皮细胞迁移的活性(图9B)。结果显示，通过ATP结合位点突变带来的Endu的ATPase活性和抑制内皮细胞迁移活性的改变与相同突变方式对ES相关活性的改变具有相类似的效果。
实施例11：将野生型ES的ATP结合基序及其周边序列进行突变改造，得到不同ATP活性降低的突变体
本实施例中，利用两步PCR技术对ES的ATP结合基序进行突变改造，PCR循环以及两端引物同实施例1。突变位点归纳如下：
按照实施例4的方法测定了实施例2和实施例11中的ES变体、突变体及其mPEG修饰物的ATP酶活性，结果见表1。
表1
实施例12：ES突变体对HMEC细胞迁移的影响
细胞迁移试验采用实施例9中所述的Transwell Assay方法进行评价。由于很多突变体蛋白抑制内皮细胞迁移的活性增强显著，为了更明显地体现各突变体蛋白之间活性的差异，本实施例采用降低的剂量5μg/mL处理细胞，仍能够看到明显的抑制效果。实验结果见图43-47。除Z103、Z104、ZN3和ZN4的ATPase活性较ES降低，其抑制内皮细胞迁移的活性也发生了降低，其他各个突变体均显示了与ES相当或显著提高的抑制内皮细胞迁移的活性，符合ATPase活性与抑制内皮细胞迁移的活性负相关的规律。而上述四个突变体Z103、Z104、ZN3和ZN4的例外很可能是由于突变位点过多对蛋白整体结构造成影响所致。
实施例13：Endostatin突变体在动物体水平上对非小细胞肺癌A549细胞肿瘤生长的抑制效果
培养处于增殖状态的人源肺腺癌A549细胞(ATCC保藏号为CCL-185)接种至6～8周龄的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下。当肿瘤生长至体积约为80-100mm3时，开始给药。荷瘤裸鼠分为五组进行不同的给药处理。同样的，由于突变体抗新生血管活性增强，本实验采用了降低的剂量12mg/kg处理荷瘤鼠(通常剂量24mg/kg)。第一组：阴性对照Control组，无给药处理，仅注射等量生理盐水；第二组，mPEG-ES给药组，进行mPEG-ES给药处理；第三组，M003给药组，进行M003给药处理；第四组，M007给药组，进行M007给药处理；第五组，MZ101给药组，进行MZ101给药处理。上述四种Endostatin突变体mPEG-ES、M003(mPEG-ES003)、M007(mPEG-ES007)、MZ101(mPEG-Z101)的用药剂量均为12mg/kg，每周尾静脉注射给药一次，治疗时间为21天(3周)。在实验过程中使用电子游标卡尺对各组所有肿瘤的长径和短径，由公式计算出肿瘤体积＝0.5×长径×短径2(mm3)。
肿瘤体积生长测定实验的结果显示(如图48A所示)，与第一组对照组未经药物治疗的肿瘤体积相比较：第二组mPEG-ES给药的肿瘤体积抑制率为45％；第三组M003和第四组M007给药的肿瘤体积抑制率与mPEG-ES相近；第五组MZ101给药的肿瘤体积抑制率为71.2％，该组的肿瘤体积最小、药物抑瘤率最高。
实验结束后取出荷瘤裸鼠的肿瘤进行称重(如图48B所示)，各组药物治疗对于肿瘤重量的抑制效果与肿瘤体积测定实验的结果较为一致。与第一组对照组未经治疗的肿瘤重量相比较：第二组MS03给药的肿瘤重量抑制率为42％；第三组M003和第四组M007给药的肿瘤重量抑制率与mPEG-ES相近；第五组MZ101给药的肿瘤重量抑制率为64％，该组的肿瘤重量最小、药物抑瘤率最高。
本实施例的结果证明在荷瘤动物实验中，剂量为12mg/kg/week下的Endostatin突变体对肿瘤生长有良好的抑制效果。其中mPEG-ES的抑瘤率约为40％；M003和M007的抑瘤率接近并略低于mPEG-ES；MZ101的抑瘤效果优于mPEG-ES，疗效最好、抑瘤率最高(约为60-70％)。

Claims (37)

1.一种检测血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的生物学活性的方法，其步骤包括检测所述血管内皮抑制素、或其变体、突变体或PEG修饰产物的ATPase活性。
2.权利要求1的方法，其中所述的血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
3.权利要求1的方法，其中所述的血管内皮抑制素变体具有SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的序列。
4.权利要求1的方法，其中所述的血管内皮抑制素突变体具有选自SEQ ID NO.6-11、15-27和30-31的序列。
5.权利要求1的方法，其中所述的血管内皮抑制素变体的突变体具有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的序列。
6.权利要求1的方法，其中所述的血管内皮抑制素、变体或突变体的PEG修饰产物是血管内皮抑制素、变体或突变体被单甲氧基聚乙二醇进行N-末端单一定点修饰得到的产物。
7.权利要求6的方法，其中所述的单甲氧基聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
8.权利要求1方法，其中利用孔雀绿磷酸盐检测法或ATP生物发光检测法检测血管内皮抑制素的ATPase活性。
9.一种提高血管内皮抑制素的生物学活性的方法，其包括降低血管内皮抑制素或其变体的ATPase活性。
10.权利要求9所述的方法，包括通过基因工程手段对血管内皮抑制素或其变体的ATP结合基序GXXGXXK进行突变，从而获得具有降低的ATPase活性的血管内皮抑制素突变体。
11.权利要求9或10的方法，其中所述血管内皮抑制素突变体具有提高的抑制内皮细胞迁移的活性。
12.权利要求9或10的方法，其中所述血管内皮抑制素突变体具有提高的抑制肿瘤的活性。
13.权利要求9-12任一项所述的方法，其中所述血管内皮抑制素突变体具有选自SEQID NO.6-11、13、14、15-27和30-31的序列。
14.一种血管内皮抑制素或其变体的突变体，所述突变体具有提高的抗新生血管生成的活性，其中所述突变体在其ATP结合位点包含突变，且与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低。
15.权利要求14的突变体，其中与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约30％。
16.权利要求15的突变体，其中与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约50％。
17.权利要求16的突变体，其中与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约70％。
18.权利要求17的突变体，其中与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体的ATPase活性降低至少大约90％。
19.权利要求18的突变体，其中所述突变体不具有ATPase活性。
20.权利要求14-19任一项的突变体，其中与相应的野生型血管内皮抑制素或其变体相比，所述突变体在其ATP结合基序中包含突变。
21.权利要求20的突变体，其中所述突变体在相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列中包含突变，其中所述突变选自一或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加或其组合，其中所述突变导致所述突变体的ATPase活性降低或消除。
22.权利要求21的突变体，其中所述突变体的相应于由SEQ ID NO.1的第89-95位氨基酸残基组成的Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys基序的序列被部分或全部缺失。
23.权利要求21的突变体，其中所述突变体的相应于SEQ ID NO.1的第89、92和95位氨基酸残基中的一或多个氨基酸残基被取代或缺失。
24.权利要求23的突变体，其中：
(a)相应于SEQ ID NO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸或芳香族的氨基酸取代或被缺失；或
(b)相应于SEQ ID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由选自不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或
(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自带正电荷的氨基酸或不带电荷的氨基酸取代或被缺失；或
(d)(a)-(c)的任意组合。
25.权利要求24的突变体，其中：
(a)相应于SEQ ID NO.1的第89位的Gly氨基酸残基由选自Ala和Pro的氨基酸取代或被缺失；或
(b)相应于SEQ ID NO.1的第92位的Gly氨基酸残基由Ala取代或被缺失；或
(c)相应于SEQ ID NO.1的第95位的Lys氨基酸残基由选自Arg和Gln的氨基酸取代或被缺失；或
(d)(a)-(c)的任意组合。
26.权利要求25的突变体，其中所述突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6-11、13、14、15-27和30-31。
27.权利要求26的突变体，其中所述突变体包含选自如下一组的序列：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.30。
28.权利要求14-27的血管内皮抑制素或其变体的突变体，其是人血管内皮抑制素或其变体的的突变体。
29.药物组合物，其包含权利要求14-28任一项所述的突变体。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述突变体共价连接于PEG分子。
31.权利要求30的药物组合物，其中所述PEG分子的分子量为5-40kD。
32.权利要求31的药物组合物，其中所述PEG分子共价连接于所述突变体的N-末端α氨基。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述PEG分子是单甲氧基聚乙二醇。
34.权利要求33的药物组合物，其中所述单甲氧基聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
35.治疗肿瘤的方法，包括给肿瘤患者施用权利要求14-28任一项所述的突变体或权利要求29-34任一项的药物组合物。
36.权利要求14-28任一项所述的突变体在制备治疗新生血管相关疾病的药物中的用途。
37.权利要求36的用途，其中所述新生血管相关疾病是肿瘤。
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