CN1237072C

CN1237072C - 生产内皮抑制素的方法

Info

Publication number: CN1237072C
Application number: CN 00107569
Authority: CN
Inventors: 罗永章; 周兵
Original assignee: RONGCHANG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd YANTAI
Current assignee: Shandong Simcere bio Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2000-05-22
Publication date: 2006-01-18
Anticipated expiration: 2020-05-22
Also published as: CN1324818A

Abstract

本发明涉及生产内皮抑制素的方法，特别是涉及使用原核表达系统，以提高的表达效率和产率生产重组人内皮抑制素的方法。本发明的方法在提高表达效率的基础上大大提高了人内皮抑制素蛋白的产率，同时简化了表达产物的纯化步骤及复性后蛋白质活性的保留，从而大大降低了大批量生产用于临床前检验及临床试用所需的人内皮抑制素的生产成本。

Description

生产内皮抑制素的方法

血管生成(即从已有血管长出新的毛细血管)对于胚胎发育、器官形成，组织再生及创伤修复是不可缺少的(Folkman.J.and Shing，Y.J.Biol.Chem.267：10931-10934.1992；Folkman，J.，Nature Medicine 1：27-31，1995)。同时，血管生成又是导致肿留生长和转移、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎等许多病理条件发展与恶化的必要因素。

血管生成是一个包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质降解、微管形成及芽生新的毛细血管等多个步骤的，并且有一系列调节因子参预的过程。已发现并鉴定的血管生成刺激因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管通透因子(VPF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2和一1)等。另一方面，迄今也已发现并鉴定了纤连蛋白、层粘连蛋白、转化因子β₁、血小板反应蛋白1、血小板因子4、催乳素等血管生成抑制因子。特别是近年来，O′Reilly等人(O′Reilly，M.S.et al.，Cell 79：315-328，1994.′Reilly，M.S.et al.，Cell 88：277-287，1997)先后发现并鉴定了作为纤溶酶原之内部片段和胶原蛋白X VIII之C末端20KD_a球形区的血管生成抑制素和内皮抑制素。从已有研究结果可以预想到，组织中血管生成表型的开放与关闭将取决于组织局部区域血管生成刺激因子和抑制因子间的动态平衡(参见Folkman，J.，N.Engl.J.Med.333：1757-1763，1995)。

特别令人感兴趣的是，近年来的研究显示，上述血管生成抑制因子大都是在对其各自的来源分子进行蛋白质水解并形成末端或内部片段之后，才表现有内皮细胞增殖抑制活性的。因此，推测蛋白质的内源蛋白酶裂解可能对其生物学活性的发挥起着关键性作用(参见O′Reilly，M.S.et al.，Cell 88；277-285，1997)。这一现象以及以前发现的某些生物学活性蛋白质的内部或侧翼片段具有与该蛋白质的完整分子相反的生物学活性，以及酶原只有在某些特定组织内的特定生化过程中才能转化成活性酶蛋白的现象，可能代表了生物体进化过程中所建立的复杂的保护、应激及适应机制。

作为胶原蛋白XVIII的20KDa羧基末端片段，内皮抑制素是内皮细胞增殖和迁移的一种特殊抑制剂，并可显著地抑制小鼠多种原发性肿瘤的生长(O’Reilly，M.S.et al.，Cell 88：277-285，1997和USP5.854,205)。并已显示，重复使用内皮抑制素可使小鼠肿瘤处于持久的休眠状态，而且没有诱发药物抗性(Boehm，T.et al.，Nature 390：404-407，1997)。最近的研究进一步显示，内皮抑制素导致细胞静止在生长周期的G₁期并特异地诱导内皮细胞的凋亡(D hanabal，M.et al.，Biochem.Biopys.Res.Commun.258：345-352，1999)。

内皮抑制素最初是根据其具有抑制毛细血管内皮细胞增殖的能力，而由培养的血管内皮细胞瘤细胞系中分离的(O’Reilly，M.S.et al.，Cell 88：277-285，1997)。在分析其核苷酸编码序列的基础上，O’Reilly等人进一步利用大肠杆菌表达系统表达了沉淀的并且未复性的内皮抑制素蛋白，并认为未复性的纯化蛋白质有利于在皮下注射部位延迟释放。作者提到，当以标准方法使内皮抑制素重新折叠并溶于组织培养基中后，即可强有力地抑制内皮细胞增殖。但不幸的是，蛋白质重折叠过程中造成蛋白质的显著丢失。鉴于该产物能够延长用药后的抗肿瘤活性，因而推测内皮抑制素可在体内逐渐恢复天然构象并延长发挥抗血管生成活性的时间。

现有技术也报导了使用酵母(巴斯德毕赤酵母)系统克隆和表达可溶形式的重组内皮抑制素的方法(Dhanabal，M.et al.，Cancer Res.59：189-197，1999)。另外，尽管报导了可在原核系统中表达有血管生成抑制活性形式的蛋白质，但产物却很难重折叠成可溶的蛋白质，而是倾向于从溶液中沉淀析出。再者，还有人在其他真核细胞系，如NS/O小鼠骨髓瘤细胞系中表达了作为Fc-内皮抑制素融合蛋白的内皮抑制素(Lo，K.-M.et al.，Protein Eng.11：495-500 1998)，在人胚胎肾细胞中以高水平表达了可溶形式的小鼠内皮抑制素(Hohenester，E.et al.，EMBO J.17(6)：1656-1664，1998)，以及使用修饰的附加型表达载体在293人肾细胞中表达了小鼠和人内皮抑制素(Kohfeldt，J.F.，FEBS Lett.，16：908-916，1997)。

鉴于内皮抑制素作为肿瘤生长抑制剂使用时的临床前研究及临床试用的用量很大，而大肠杆菌表达产物又难以复性和易于形成沉淀的问题，目前大多倾向于使用酵母系统大批量生产分泌形式的重组人内皮抑制素。然而，使用巴斯德毕赤酵母表达系统不仅生产设备投资巨大(如使用大至10吨或10吨以上发酵罐)，而且也存在因污染而遭受巨大损失的危险。

因此，有必要进一步提供一种改良的，以更高的产率和更简单的纯化工艺生产重组人内皮抑制素的方法。

本发明的一个目的是提供编码带有N末端附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考虑密码子的简并性，其中所说的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列。

根据本发明这一目的的一优选实施方案，其中所说的编码附加氨基酸的核苷酸序列是在制备人内皮抑制素核苷酸编码序列的过程中，以与所说的编码序列直接相连的方式得到的。

本发明的另一个目的是提供一种以提高的表达产率和简化的纯化步骤生产带有N末端附加氨基酸序列的内皮抑制素的方法，该方法包括：

(1)提供3′末端直接连接有附加氨基酸之编码序列的人内皮抑制素核苷酸编码序列：

(2)将步骤(1)得到的完整核苷酸序列连接到适当的表达载体中，以得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)得到的重组载体转化到适当的大肠杆菌宿主中，并在适于表达由(1)中所述的核苷酸序列编码的人内皮抑制素的条件下，培养被转化的宿主细胞；

(4)从细胞培养基中和细胞内回收并纯化所需的重折叠形式的表达产物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达产物的N末端氨基酸是甘氨酸(Gly)。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达载体是携带T7启动子的pET质粒或其衍生物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达载体是pET25B。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21(DE₃)细胞系。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达产物是N末端带有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人内皮抑制素，其中Xaa代表中性氨基酸或不存在。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的附加寡核苷酸末端作为翻译起始密码子ATG所编码的蛋氨酸(Met)在翻译后加工过程中被删除。

图1显示编码N末端带有附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示由图1所示核苷酸序列编码的N末端带有附加序列的人内皮抑制素的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3显示纯化的N端带有附加序列的人内皮抑制素的SDS-PAGE分析。泳道1：加1mM IPTG诱导后的细胞裂解产物；泳道2：分离的包涵体；泳道3：用Ni-NTA柱纯化的人内皮抑制素；泳道4：用Ni-NTA和SP-Sepharose层析纯化的人内皮抑制素；泳道5：分子量标准品。

图4显示用pH梯度(磷酸盐缓冲液)洗脱液从Ni-NTA柱上洗脱之蛋白质的A₂₈₀吸光率曲线。

图5显示按本发明方法生产的(实线)和在酵母系统中表达的人内皮抑制素(虚线)的RP-HPLC分析。

图6显示纯化的N端带有附加序列的人内皮抑制素的Western印迹分析。泳道1：用Ni-NTA柱纯化的人内皮抑制素；泳道2：用SP-Sepharose柱纯化的人内皮抑制素；泳道3：酵母表达的人内皮抑制素。

图7显示纯化的N端带有附加序列的人内皮抑制素对H22肝癌荷瘤小鼠的体内肿瘤生长抑制活性。

本发明涉及以重组DNA技术生产人内皮抑制素的方法，特别是涉及在大肠杆菌表达系统中，以改善的表达效率和产率生产N末端带有至少由7个氨基酸组成的附加氨基酸序列的人内皮抑制素的方法。更具体地说，本发明通过修饰人内皮抑制素的核苷酸编码序列，一方面显著地提高了内皮抑制素结构基因的转录和翻译起始效率，从而获得产物的高水平表达，另一方面由于按本发明方法表达的人内皮抑制素N端附加序列中包括多个(至少5个)连续的组氨酸，因而大大简化了表达产物的纯化步骤，同时提高了产物的纯度。

按本发明方法制备的人内皮抑制素与按已知方法制备的内皮抑制素具有完全相同的生物学活性，而且实质上没有产生因加入附加N端序列所导致的体内免疫原性。

本说明书中使用的术语“内皮抑制素”是指用还原和非还原凝胶电泳测得分子量约为18-22KDa，能够抑制内皮细胞增质的蛋白质、其片段或其修饰形式。这里所说的“修饰”是指在基本上保留分子的内皮细胞增殖活性的前提下，对野生型内皮抑制素分子中一个或多个氨基酸的缺失、加入或取代。具体地说，经修饰的内皮抑制素可以是从内皮抑制素分子的一端或两端加入一个或多个氨基酸得到的延长形式的蛋白质或肽，或者是在内皮抑制素分子的一端或两端缺失一个或多个氨基酸得到的截短形式的蛋白质或肽，或者也可以是用结构或理化性质上相似的氨基酸取代野生序列中的一个或多个氨基酸所得到的实质上没有改变原始结构、构型或活性的蛋白质或肽。基于本发明的目的，术语“内皮抑制素”尤其是指延长形式的并保留有内皮抑制素野生型分子固有的生物学活性的蛋白质或多肽。

可以依据已知的氨基酸序列，使用本领域技术人员已知的肽合成技术制备内皮抑制素，特别是本发明的N端延长的或者说N端带有附加氨基酸序列的内皮抑制素(以下有时简称为YH-endo)或功能等同异构体。

然而，从临床应用角度看，最好是使用重组DNA技术，以尽可能简化的方法和较低的生产成本大批量生产N末端带有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加序列(其中Xaa代表中性氨基酸或不存在)，但又不改变其生物学活性的内皮抑制素。

根据本发明，首先提供了编码N端带有附加氨基酸序列(Met)GlyGlyAaaHisHisHisHisHis的内皮抑制素的核苷酸序列。例如，可以使用本领域已知的自动合成系统合成所说的完整核苷酸序列，或者首先合成一系列的寡核苷酸，然后将它们彼此连接后得到全长度序列。作为一种常用的替代方法，可使用基于N末端氨基酸序列设计的寡核苷酸引物并使用克隆遗传材料的已知技术从基因库中得到所说的核苷酸序列。然而，为了方便起见，可以基于附加氨基酸序列及内皮抑制素N末端固有的氨基酸序列合成适当的寡核苷酸引物(包括正向和反向引物)，并在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸的存在下，以聚合酶链反应(PCR)技术合成所需的核苷酸序列。

根据本发明，可以设计适当的引物以加入编码N末端延长部分的核苷酸序列，以及适于与载体DNA连接的酶切位点。当然，本领域技术人员可以理解到，由于遗传密码的简并性，可以在不改变其编码的氨基酸序列的前提下，对本发明的内皮抑制素编码序列进行许多不同的改动或改变。

可以使用如此得到的核苷酸序列，在适当的原核或真核表达系统中生产由之编码的N末端延长的内皮抑制素蛋白质。或者将这样的核苷酸序列连接到质粒或病毒载体上，或包裹在脂质微粒中，以其作为免疫原，并用适当的方法导入人或哺乳动物体内(如注入肌肉内)，以在体内表达循环的血管生成抑制因子内皮抑制素并发挥其肿瘤生长抑制作用(即所谓基因治疗)，或者也可以使用逆转录酶或RT-PCR技术合成适当的反义核酸，用于肿瘤其他血管生成相关病理条件的治疗。这里所说的其他血管生成相关病理条件包括但不只限于心血管病、糖尿性视网膜病变及类风湿性关节炎。

本发明进一步提供生产如上文限定的N端有附加氨基酸序列的内皮抑制素的方法，该方法包括：

(1)提供3′末端直接连接有附加氨基酸之编码序列的人内皮抑制素核苷酸编码序列；

(2)将步骤(1)得到的完整核苷酸序列连接到适当的表达载体中以得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)得到的重组表达载体转化到适当的大肠杆菌宿主中，并在适于表达步骤(1)中所述的核苷酸序列编码的带有N端附加序列之内皮抑制素的条件下，培养被转化的宿主细胞；

可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，1989)完成目的基因的制备、重组载体的构建、产物的表达、表达产物的分离和纯化等操作。例如，可使用PCR技术从人组织cDNA文库中得到编码人内皮抑制素的核苷酸片段，经在克隆载体中扩增并进一步鉴定后，将其连接到经适当酶切的表达载体(如pET25B)上，并转化到选择的大肠杆菌中。然后，培养被转化的细胞并诱导表达所需的N末端带有附加氨基酸及(His)5尾部的人内皮抑制素蛋白质。

与现有技术相比，由于在已知内皮抑制素基因序列的3′端加入了编码GlyGly Xaa His His His His His附加氨基酸的寡核苷酸序列(其中Xaa代表任何一种中性氨基酸或不存在)，所以本发明的方法可同时带来两方面的积极效果。首先加入Gly Gly Xaa(其中Xaa代表任何一种中性氨基酸或不存在)的核苷酸编码序列后，将显著的提高DNA转录和转录本翻译的起始效率，从而为提高表达产物的产率提供了必要条件。我们以前的实验结果显示，如果从3′端删去(Met)GlyGly Ser的编码序列，内皮抑制素蛋白质的表达产率只占细菌总蛋白的约1％；相反，由于加入N末端(Met)Gly Gly Ser序列，则可使内皮抑制素蛋白质的产率达到总细胞蛋白质含量的20-50％。此外，Gly GlyXaa的加入还将有利于保护蛋白质表达产物免于遭受部分蛋白酶降解。另一方面，紧接在GlyGly Xaa之后的(His)5附加序列的加入，主要是为了便于使用Ni整合型层析柱纯化目的产物，进而简化蛋白质纯化步骤(例如参见Skerra，A et al.，Biotochnology(NY)9(3)：273-278，1991；Stuber，Det al.，Immunol.Motlods 4：120-123，1991)。还应特别指出的是，虽然Gly Gly Xaa序列中的Xaa可以是任何氨基酸或不存在，但优选的Xaa是Ser。

为了得到3′端带有附加氨基酸之核苷酸编码序列的(SEQ ID NO：1)的人内皮抑制素基因序列，可以基于待加入的N端附加氨基酸序列及已知的全长度内皮抑制素的氨基酸，使用自动DNA合成装置，合成一对含有附加序列和适应酶切位点的上游引物和下游引物。使用人肝cNA作为模板，在四种单核苷及DNA聚合酶存在下进行PCR反应。由于合成的寡核苷酸引物中已加入了编码N端附加氨基酸的相应核苷酸序列，所以经PCR扩增后即可得到3′端带有附加氨基酸之编码序列和适当的酶切位点的全长度内皮抑制素基因序列(约579bp)。将如此得到的基因序列连接到适当的克隆载体中并在大肠杆菌宿主细胞中。培养被转化的宿主细胞并在适当的选择培养基上选择阳性克隆后，从细胞中分离所需的DNA并经酶切分析证实所得片段的正确性。或者亦可通过对两条链的全核苷酸序列分析进一步证实之。

然后将编码带有N末端附加序列内皮抑制素，并且两端已另外加入适当的酶切位点的核苷酸片段(Xho I/NdeI片段)连接到适当的表达载体，例如含有噬菌体T7启动子并已用同样的核酸内切酶切成线性同时除去了信号序列的pET25B载体中。使用本领域已知的方法将所得到的重组表达载体转化到适于在其中表达所需内皮抑制素蛋白质的细胞，例如大肠杆菌LB21(DE3)细胞系中。在适当的条件下培养被转化的大肠杆菌细胞，并经诱导后完成蛋白质的表达。预期的表达产物的氨基酸序列是(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis-内皮抑制素，特别是(Met)GlyGlySerHisHisHisHisHis-内皮抑制素，即本文定名为YH-endo的蛋白质。

可按照制造商(Qiagen)提供的使用手册中所述的方法，于8M尿素存在下使用Ni-NTA层析柱完成重组蛋白质的纯化。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析纯化的蛋白质，然后合并含有所需表达产物的洗脱物。

洗脱过程中，可使用分光光度法定时取样检测280nm吸光率，同时使用SDS-PAGE法检测洗脱物中约21kDa蛋白质的存在，以监测按本发明方法生产的YH-endo的洗脱峰(参见图3和4)。对按本发明方法制备的YH-endo进行蛋白质定量分析，结果显示其表达产率约为10g/L培养物。这一产率显著高于已报导的大肠杆菌或酶母表达系统生产内皮抑制素的产率。推测这一产率的改善是由于N末端附加氨基酸编码序列的加入显著地提高了mRNA的翻译起始速度所致。

可使用不同的方法完成蛋白质的重折叠(复性)，例如可使用含有还原态和氧化态谷脱甘肽及不同浓度尿素的Tris缓冲液(重折叠缓冲液)处理蛋白质。虽然O′Reilly等人(例如参见O′Reilly，M.S.et.al.，Cell 88：277-285，1997)曾报导未重叠折的不溶性内皮抑制素同样表现有血管内皮细胞增质抑制活性和肿瘤生长抑制活性，但我们的研究显示，在严格控制的复性条件下达到尽可能大比例蛋白质的充分复性，对于改善大肠杆菌表达的蛋白质的生物学活性及贮存稳定性是十分重要的。

可以使用凝血酶裂解去除重组人内皮抑制素的His尾端部分，例如可按大约200：1的比例向纯化蛋白质的溶液中加入凝血酶并于大约23℃下保温30分钟。然后使用凝胶过滤层析法分离裂解片段。然而，本发明人发现，既使不除去His尾端及与之直接相连的GlyGlySer序列也不会影响终产物的生物学活性，而且没有发现其可导致任何免疫原性反应(数据未示出)。

按照已知的方法，使用12％聚丙烯酰胺对从Ni-NTA柱上纯化的YH-endo进SDS-PAGE分析。结果显示在还原条件下(例如用含1M二巯基乙醇的洗脱液处理)，YH-endo具有大约21KDa的表观分子量(图3)，另外，为了确定按本发明方法制备的YH-endo的免疫反应性，可使用预制备的免抗YH-endo进行反相高压液相层析(RP-HPLC)分析(图5)。

虽然按照上述本发明方法能够以高产率和高纯度，并以较低的生产成本制得适于工业化大规模发酵生产的重组人内皮抑制素，但这一切均须以所得产物具有足够高的，适于临床应用的生物学活性为基础。目前已建立了许多用于检测内皮抑制素蛋白的生物学活性的方法，这里可以提到的方法包括：体外内皮细胞增殖和/或迁移抑制试验(其中使用的细胞系包括牛肺动脉内皮细胞(C-PAE)、人脐静脉内皮细胞(HUVE)、牛肾上腺皮质毛细血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞(HMVE-L)、人内皮细胞ECV304细胞系等内皮细胞，以及牛主动脉平滑肌细胞(SMC)、牛视网膜色素上皮细胞(PPE)、水貂上皮细胞(MLE)、NIH3T3成纤维细胞、IMR-90肺成纤维细胞及H9c2成肌细胞等非内皮细胞)；小鼠角膜血管生成试验(Kenyon，B.M.et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：1625-1632，1996)；鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)试验；以及细菌表达的内皮抑制素对移植肿瘤的体内肿瘤生长和/或转移抑制试验(其中使用的肿瘤动物模型包括B16-BL6肿转移瘤、H22肝细胞瘤、LLC-LM原发瘤、Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、B16F10黑色素瘤、786-0肾透明细胞瘤等)。

尽管目前用于检测内皮抑制素生物学活性的内皮细胞系和肿瘤动物模型均缺乏足够的敏感性和特异性，但我们的初步实验(参见实施例4)结果表明，按本发明方法制备的YH-endo蛋白质具有与不带有N端附加氨基酸序列的内皮抑制素完全相同生物学活性，即体外内皮细胞增殖抑制活性和带瘤小鼠的体内肿瘤生长抑制活性。

下列实施例旨在进一步举例说明本发明的方法及其优点，但这些实施例并不构成对本发明待批权利要求范围的限制。

实施例1：用于表达带有N末端附加氨基酸和(His)尾部之内皮抑制素的重组质粒的构建

基于内皮抑制素蛋白质的N末端和C末端氨基酸序列及待加入之N末端附加氨基酸，设计并使用Vent DNA聚合酶(New England biolabs)合成一对引物，并以聚合酶链反应(PCR)技术从人肝脏cDNA文库中扩增得到编码人内皮抑制素YH-endo的DNA序列。一对引物包括：5′上游引物：CATATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO：3)，其中含有NdeI位点和包括30个核苷酸的附加氨基酸编码序列，以及其后的内皮抑制素退火序列；和3′(下游)物：CTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGC(SEQ IDNO：4)，其中含有退火序列和终止密码子及其后的XhoI位点。PCR的反应条件是：49℃变性1分钟，然后于60℃退火1分钟并于72℃退火1.5分钟，共进行30次PCR循环。

扩增完成后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增的片段，并用NdeI和XhoI消化得到579bp片段。或者使用TA克隆试剂盒，将其克隆到PCR-TM-II拖尾载体中并进行全序列测定，然后再从TA克隆载体中切出NdeI/xhoI片段(579bp)。

将此579bp片段连接到已用NdeI和XhoI切成线性并用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化处理的pET25B表达载体(Novagen)中，得到重组表达质粒YH-endo/pET25B。该载体适于表达与上述附加序列及(His)5接尾融合的蛋白质。首先用连接反应混合物转化大肠杆菌XL-1Blue，在含有青霉素的培养基中保温过夜后，挑选阳性菌落并从中大量制备DNA。分别用NdeI/XhoI、HindIII/Sac II或NdeI/SmaI对所得重组质粒DNA进行酶切鉴定，分别得到0.6Kb和5.4Kb片段、0.28Kb和5.70Kb片段，以及0.315Kb和5.7Kb片段。经DNA序列分析进一步证实序列(图1)的正确性后，将此定名为YH-endo/pET25B的重组质粒转化到携带T₇RNA聚合酶基因的感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen)中，以进行蛋白质表达。使用T₇序列酶2.0版本DNA测序试剂盒(Amersham)和Sequi-Gen II核酸测序电泳系统(Bio-Rad)，以链终止DNA测序法进一步证实重组构建体的序列。

实施例2：带有N端附加序列及(His)₅加尾的人内皮抑制素蛋白质的表达与纯化

将重组质粒YH-endo/pET25B转化的大肠杆菌BL21克隆加在含LB培养基的培养瓶内培养(37℃，5％CO₂)。待细胞密度达到OD600≈0.8-0.9后，向细胞培养物中加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)以诱导蛋白质表达。约3-4小时后，以5,000×g离心(30′)收获细胞。将细菌细胞重新悬浮于含有8M尿素、10mM Tris和100mM磷酸钠缓冲液的平衡液中室温放置1小时，并将细胞超声处理3次。然后将包涵体溶解于含有7M盐酸胍和50mM β-巯基乙醇的Tris缓冲液(pH8.0)中继续放置1小时，以10000×g离心25分钟并收集上清。将如此得到的上清液上样于已用上述平衡溶液平衡过的如QIAexpressionist手册(Qiagen)中所述的Ni-NTA柱，用含有8M尿素、0.1M磷酸钠和20mM咪唑的洗脱液，以pH8.0至pH4.5的逐渐降低的pH梯度洗脱，并按每管1.5ml收集洗出物。用SDS-PAGE方法分析Ni²⁺柱纯化的洗脱物并合并含所需的分子量约21KDa的蛋白质的部分。洗脱过程中，以分光光度法监视洗脱物的280nm吸光率，可在第20-25管时(pH5.5)出现一个高耸的单一吸收峰(图4)。

将按上述方法从Ni²⁺柱上洗脱的含内皮抑制素蛋白质的洗脱物以1∶10体积比，迅速稀释于含有2.5M尿素、100mMNaCL、0.1MTris-HCL(pH8.0)、2mM还原态谷胱甘肽和0.02mM氧化态谷胱肽的溶液中以使蛋白质重折叠(复性)。

可以按1∶200浓度比例向纯化并复性的蛋白质中加入溶于20mMTris-HCL缓冲液(含有100mM NaCl)(PM8.0)中的凝血酶，于24℃保温约20分钟，以从人内皮抑制素分子上裂解掉C端的His加尾部分。裂解后用凝胶过滤树脂Superdex 75HR 10/30(Pharmacia)除去裂解的肽片段。或者，不进行此裂解处理而将蛋白质直接用于下述理化性质和生物学活性分析。对未去除N端附加序列之内皮抑制素(YH-endo)表达产物的半定量分析显示，按照本发明方法制得的YH-endo蛋白质的产率约为10g/L。

实施例3：带有N末端附加序列及(His)5加尾的人内皮抑制素的生物化学性质鉴定

1.SDS-PAGE分析：按照文献中已描述的方法，使用12％聚丙烯酰胺凝胶对Ni-整合型层析柱上洗脱的蛋白质进行SDS-PAGE分析。将待分析的样品溶解于含有-巯基乙醇(1M)的洗脱缓冲液中，以致使所有较高分子量的蛋白质复合物都转变成大约21KDa大小的单一带。结果如图3所示。

从图3中可以看出，大部分结合于Ni柱上的蛋白质均在含20mM咪唑的PH5.5洗脱液中洗出，并且所洗脱的蛋白质均表现为一条单一的21KDa的带。

2.Western印迹分析：基本上按照Dhanahal等(Dhanabal，M.et al.，CancerRes，59：189-197，1999)所述的方法制备抗YH-endo的多克隆抗血清，并以12％SDS-PAGE法分离重组人内皮抑制素(YH-endo)，然后按照文献中已述的方法进行Western印迹分析。其中兔抗人内皮抑制素抗血清稀释4000倍；第二抗体是与辣根过氧化物酶(HRP)结合的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)。根据化学发光强度检测免疫反应性(例如参见Dhanabal，M.et al.，Cancer Res.59：189-197，1999)。分析结果表明，按本发明方法生产的YH-endo可被抗YH-endo抗血清识别(参见图6)。

3.反相高压液相层析(RP-HPLC)：使用Gilson HPLC系统在C18柱(260×4.6mm，Vydac)上进行反相高压液相层析，并使用5-95％乙腈梯度，以1ml/分的流速洗柱。从图5所示的层析谱可以看出，经Hi柱纯化的YH-endo显示为一条单一的尖峰，并表明纯化产物中基本上没有蛋白质聚合体或降解片段存在。

实施例4：带有N末端附加序列及(His)5加尾的人内皮抑制素的生物学活性检测

1、鸡胚尿囊膜法：取新鲜的受精卵放置在37℃恒温培养箱中，每天翻转两次。培养至第九天在照卵灯下将气室打一个1-2mm的小孔，在距胚头1cm处两条卵黄静脉之间的卵壳上开一个矩形方孔，去除卵黄膜。在尿囊膜上放置一经过消毒的甲基纤维素凹膜，加入4ul待测样品。封口并在37℃恒温下培养3天后观察结果。结果可见，与对照组相比酵母分泌表达的内皮抑制素及按本发明方法制备YH-endo均具有明显的毛细血管内皮细胞增殖抑制活性，而且两者具有几乎完全相同的比活性。

2、培养的牛内皮细胞(BCE)的增殖抑制活性实验：按照Folkman等人(Folkman，J.et al.，PNAS USA 76：5217-5221，1979)所述的方法制备牛毛细管内皮细胞(BCE)。将细胞用胰蛋白酶(0.05％，PBS)消化后悬浮于0.25mlDMEM+10％BCS+1％GPS中(25000细胞/ml)。将细胞悬液(0.5ml/孔)加于胶原铺敷的24孔培养板中，并与37℃、10％CO₂条件下保温24小时。保后更换培养基(0.25ml DMEM+5％BCS+1％GPS)并加入待检样品，继续保30分钟，加入内皮细胞生长刺激因子FGF-2(1ng/1ml)，72小时后观察结果。结果说明YH-endo与酵母表达的内皮抑制素具有相似的生物活力(ED₅₀≈400g)。

3.YH-endo对H22肝癌细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC₇₉₀₁细胞实体瘤模型的抑瘤试验：将体外培养的人H22肝癌细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC₇₉₀₁细胞经胰酶消化后在Hanks液中制成单细胞悬液。稀释后调整细胞数至5-7×10⁷/ml，并按0.2ml/只动物接种于小鼠右侧腋部皮下。接种一周后将动物随机分成8组，每组10只。各实验组动物分别按1.5mg/kg、0.75mg/kg、0.4mg/kg的剂量，经尾静脉内注射投用按本发明方法制备的YH-endo。阳性对照组投用等剂量酵母分泌表达的内皮抑制素。阴性对照组则注射同样体积的生理盐水。连续给药20天，每天一次。末次给药24小时后，断颈处死动物，分离肿瘤块并称重，然后计算抑瘤率。

结果显示，按本发明方法制备的YH-endo分别以1.5、0.75、0.4mg/kg的剂量投用20天后对H22肝癌动物的抑瘤率分别为45.67、43.08和40.00％；对宫颈Hela细胞带瘤动物的抑瘤率分别为40.70、30.15和24.12％；对胃癌SGC细胞带瘤动物的抑瘤率分别为51.89、44.34和35.85％(参见图7)。

序列表

(1)一般信息：

(iii)序列数：4

(1)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：576碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：

ATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCACAGCCACCGCGACT

TCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTC

AGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTC

CAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCT

TCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGT

GCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGC

TGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGT

CCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGG

ACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCA

TCGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGT

GAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCC

TCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGA

GCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTC

ATGACTGCCTCCAAGTAG

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：192个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：

MetGlyGlySerHisHisHisHisHisHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisL

euValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyIleArgGlyAlaAspPheA

snCysPheGlnGlnAlaArgAlaValGlyLeuAlaGlyThrPheArgAlaPheLeuSerS

erArgLeuGlnAspLeuTyrSerIleValArgArgAlaAspArgAlaAlaValProIleVal

AsnLeuLysAsnGluLeuLeuPheProSerTrpGluAlaLeuPheSerGlySerGluGly

ProLysLysProGlyAlaArgIlePheSerPheAspGlyLysAspValLeuArgHisProT

hrTrpProGlnLysSerValTrpHisGlySerAspProAsnGlyArgArgLeuThrGluSe

rTyrCysGluThrTrpArgThrGluAlaProSerAlaThrGlyGlnAlaSerSerLeuLeu

GlyGlyArgLeuLeuGlyGlnSerAlaAlaSerCysHisHisAlaTyrIleValLeuCysIl

eGluAsnSerPheMetThrAlaSerLys

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(I)序列特征：

(A)长度：33碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：

CATATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCAC

2)SEQ ID NO：4的信息：

(I)序列特征：

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线形

(xi)序列描述：

CTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGC

Claims

1、编码带有N末端附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考虑密码子的简并性，其中所说的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列。

2、根据权利要求1的核苷酸序列，其中所说的编码附加氨基酸的核苷酸序列是在制备人内皮抑制素核苷酸编码序列的过程中，以与所说的编码序列直接相连的方式得到的。

3、由根据权利要求1或2的核苷酸序列编码的内皮抑制素蛋白质，特征在于其在还原条件下凝胶电泳的表观分子量约为21KDa，并且是以重折叠的形式存在的。

4、根据权利要求3的内皮抑制素蛋白质，其具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

5、根据权利要求3的内皮抑制素蛋白质，特征在于所说的蛋白质具有改善了表达效率。

6、一种以提高的表达产率和简化的纯化步骤生产带有N末端附加氨基酸序列的内皮抑制素的方法，该方法包括：

(1)提供3’末端直接连接有附加氨基酸序列之编码序列的人内皮抑制素核苷酸编码序列：

7、根据权利要求6的方法，其中所说的表达载体是携带T7启动子的pET质粒或其衍生物。

8、根据权利要求6的方法，其中所说的表达载体是pET25B。

9、根据权利要求6的方法，其中所说的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21(DE3)细胞系。

10、根据权利要求6的方法，其中所说的表达产物是以重折叠的形式得到的。

11、根据权利要求6的方法，其中所说的表达产物是N末端带有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人内皮抑制素，其中Xaa代表中性氨基酸。

12、根据权利要求6的方法，特征在于所说的表达产物具有改善了的表达效率。