CN101618208B - 含微粉化重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法 - Google Patents
含微粉化重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，尤其涉及一种具有高包封率的重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法。该方法的步骤如下：(1)将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂中得到内油相；(2)再将重组人血管内皮抑制素微粉加入内油相；(3)以每分钟4000-50000转高速分散重组人血管内皮抑制素微粉及内油相，得到固液混悬液；(4)将所得混悬液置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包固型复乳；(5)持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品。
Description
技术领域
本发明涉及重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，尤其涉及一种具有高包封率的重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法。
背景技术
20世纪60年代，美国哈佛医学院的Folkman博士提出“肿瘤生长依赖血管生长”这一假设，并于1971年提出“饿死肿瘤疗法”理论。今天，在分子生物学技术的推动下，运用基因工程技术研发出了抗癌蛋白质-恩度。中国专利CN 1237072C罗永章等在天然Endostatin的N末端添加了9个氨基酸，不仅使Endostatin稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名为恩度，其活性成份为一基因工程蛋白——重组人血管内皮抑制素Endostar，Endostar是以重组DNA技术生产，以大肠杆菌为表达系统，其表达出的Endostar与先前的Endostatin相比较，表达水平更高，疗效更强。它通过阻断肿瘤新生血管生成，从而阻断肿瘤的营养供给，逐步减小肿瘤体积，达到抗肿瘤作用。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：
(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。
蛋白与多肽在很多治疗方面都是理想的药物，然而这些有益的效用最终可能受限于传递蛋白的困难。在口服和透皮给药中，其生物利用度通常很低，并且半衰期短。将蛋白和多肽类药物制备成微球制剂可以减少注射频率，提高患者的顺应性。对蛋白和多肽类药物，微球是相当理想的载药系统。目前有多种蛋白、多肽类药物的缓控释微球处于研发阶段，包括促黄体生成素释放激素拮抗物(LXT-101)，重组人胰岛素样生长激素(rhIGF-I)以及干扰素α2-b(IFNα2-b)等。此外，一些微球制剂已获FDA批准应用于临床，如日本Takeda公司的亮丙瑞林微球Lupron Depot，瑞士Debiopharm公司的曲普瑞林微球Trelstar Depot和瑞士Novartis公司的奥曲肽微球Sandostatin Depot等。
微球是指药物溶解或分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体，属于基质型骨架微粒。微球的粒径通常在1μm-300μm之间，药物被制成微球制剂后，有着靶向性、缓释性、安全性等特点。有多种材料可制备微球，近年来可生物降解高分子材料作为微球的基质受到了越来越多的重视，并广泛应用于医学领域的研究。乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide，PLGA)是一种生物相容性良好的可降解高分子材料，其主链含有不稳定的酯键，在体内降解后的终产物为水和二氧化碳。并获FDA批准作为医用材料。
生物技术的革新和发展使重组蛋白和多肽药物得以实现大规模的生产和应用。蛋白与多肽在水溶液中不稳定，易失活，溶液状态的蛋白在微球的制备工艺中(高剪切、温度、有机溶剂)易失活。例如将蛋白溶液与有机溶剂接触后，由于油水界面表面张力的存在，使蛋白构象改变而失活。现有的在蛋白原液中直接添加冻干保护剂的冷冻干燥法也可得到干燥的固态蛋白，但得到的蛋白颗粒大，辅料占的比重大，多用于制成冻干粉针剂，用途不广泛。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种重组人血管内皮抑制素载药量高、突释量合适且缓释周期较长的缓释微球制剂的制备方法。本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
含重组人血管内皮抑制素微粉缓释微球的制备方法，其特征在于：
(1)将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂中得到内油相
(2)再将重组人血管内皮抑制素微粉加入内油相；
(3)以每分钟4000-50000转高速分散重组人血管内皮抑制素微粉及内油相，得到固液混悬液；
(4)将所得混悬液置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包固型复乳；
(5)持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品。
上述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。
上述重组人血管内皮抑制素微粉中的活性物质为重组人血管内皮抑制素。
上述重组人血管内皮抑制素微粉中含重组人血管内皮抑制素10％至95％(重量比)。
上述共聚物为乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸-羟基乙酸分子量大小为5000～150000，优选为5000-80000，其单体组成比例乳酸∶羟基乙酸为99∶1～50∶50，优选为85∶15～50∶50，其在混合有机溶剂中的浓度为10～500mg/ml。
上述步骤(1)中所述有机溶剂为二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙酸乙酯的一种或多种。
上述步骤(4)所述植物油为大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一种或多种；所述矿物油为液体石蜡或二甲基硅油。
上述步骤(4)所述植物油的乳化剂为卵磷脂、蔗糖酯的一种或多种，加入量为植物油的0.1～10％(w/v)；所述矿物油的乳化剂为司盘-80、司盘-60、蔗糖酯的一种或多种，加入量为矿物油的0.1～10％(w/v)。
上述步骤(5)所述的微孔滤膜过滤为过滤微球的技术手段，采用的膜为有机膜，孔径范围0.2um～2um。
上述步骤(5)所述洗涤微球的溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚的一种或多种。
上述微球中重组人血管内皮抑制素微粉的含量为5％至40％(重量比)。
这一制备方法的优点主要在于：
第一，将重组人血管内皮抑制素微粉化，得到固态蛋白质，消除了蛋白溶液和有机溶剂存在的油水界面，减少蛋白活性损失。
上述的重组人血管内皮抑制素微粉可通过以下步骤制备：
(1)在含有重组人血管内皮抑制素的缓冲盐溶液中加入可溶性金属盐，然后调整该溶液的pH至蛋白的等电点(pI)，得到蛋白的细小颗粒沉淀，蛋白溶液变为混悬液；
(2)将混悬液与冻干保护剂混合均匀后，冻干；
(3)将冻干后的固体粉块用溶剂洗涤，除去冻干保护剂，得重组人血管内皮抑制素微粉。
上述的冻干保护剂为聚乙二醇，在冻干中起到空间赋形和稳定的作用，沉淀下来的人血管内皮抑制素蛋白颗粒可吸附在聚乙二醇的骨架上。
上述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿。聚乙二醇有着良好的悬浮稳定性，分子量范围在1000至8000道尔顿均可很好的稳定蛋白颗粒，保持其在冻干中不聚集，不下沉。
上述重组人血管内皮抑制素微粉的制备方法，步骤(2)中混悬液和冻干保护剂的体积比为1∶99～99∶1，优选15∶85～90∶10；混悬液中的重组人血管内皮抑制素蛋白浓度为0.01mg/ml～500mg/ml，冻干保护剂的浓度为1％～50％(w/v)。冻干保护剂的浓度不可小于1％，否则悬浮稳定性很差，蛋白沉淀会很快下沉聚集；冻干保护剂的浓度过高也不适合，因为冻干后为了得到蛋白微粉，需使用有机溶剂洗涤除去该保护剂，若保护剂占的比例过高，需消耗大量有机溶剂，反复清洗，给操作带来不便。保持1％～50％(w/v)的浓度较适宜。
上述重组人血管内皮抑制素微粉的制备方法，步骤(3)中的洗涤溶剂是可溶解聚乙二醇的溶剂，例如：丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。优选乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。
第二，使用乳化剂，特别是蔗糖酯配合传统乳化剂卵磷脂、司盘用于复乳的乳化过程，提高了乳化效率，稳定了外油相中初乳的微小液滴，不仅使制备的微球表面光滑，并且粒径随加入乳化剂的量不同，可制备出平均粒径1μm～300μm的微球。
第三，S/O/O乳化溶剂挥发法避免了常见的W/O/W复乳溶剂挥发法对水溶性药物包封率不高的缺陷，其使用植物油或矿物油作为外油相，有效的阻止了蛋白质在制备中向外渗漏，提高了微球的包封率(达到90％以上)。
第四，该方法制备的微球不含自由水。用传统的液中喷雾干燥法或W/O/W复乳溶剂挥发法制备的微球含水量很高(干燥前约24％)，在真空冷冻干燥的过程中，微球内部的水形成大的冰晶后升华，这一过程扩大了微球内部和表面的孔洞，损害微球内部结构，导致微球突释增大。S/O/O乳化溶剂挥发法制备的微球在冷冻干燥前和冷冻干燥后，突释量无显著改变。
第五，该方法得到的微球可调控微球内药物的释放时间，通过改变乳酸-羟基乙酸的分子量和单体比例，可方便调节微球的裂解速率，使微球在体内的释放时间在10天～180天内。相同分子量的聚合物，当单体组成乳酸∶羟基乙酸＝50∶50时，其降解速率最快，随着乳酸在聚合物中比例的增大，其降解速率显著减慢；单体比例相同，不同分子量的聚合物，其降解速率随分子量的增加而减慢。
第六，本发明制备的微球需使用微粉化的重组人血管内皮抑制素，微粉化工艺中，将重组人血管内皮抑制素的微粉与稳定剂共同冷冻干燥，重组人血管内皮抑制素附着在稳定剂的骨架上，保持重组人血管内皮抑制素微粉的分散性，和重组人血管内皮抑制素这一蛋白多级结构的完整性。制备的微粉化重组人血管内皮抑制素中的活性成分可保留制备前85％以上的活性。冻干后，蛋白质呈固态，不含水，此时进行制备微球，不会使固态蛋白发生油水界面上的变性，干燥的蛋白微粉性质稳定，便于下一步的制备或长期储存。
第七，该方法得到的微球能缓慢的释放药物，稳定的血药浓度更有利于重组人血管内皮抑制素持续发挥其抗癌药效。
本发明使用油包油包固乳化溶剂挥发法，当药物微粉被聚合物包裹后，能稳定的存在于内油相中，不会向外渗漏，从而获得高载药量，高包封率的微球。
将蛋白微粉化后制备微球，其独特的优点在于：一、将蛋白制备成固态，提高了蛋白在制剂制备过程中的稳定性；二、固态的蛋白，其粒子极小，是微粉化的固态蛋白，制备微球时易于被载体材料包封，微球成品突释小。传统的使用固态蛋白制备微球，如果该蛋白不经微粉化，其粒子过大而导致微球低的包封率和高的突释(蛋白不同，包封与突释的程度不同)。
本发明属于将微粉化蛋白与微球传递系统技术结合的一项新的制备蛋白质微球的方法。本发明的工艺温和简单，得到的微球粒径约65um，被包封的蛋白活性保持良好。
附图说明
图1实施例一中重组人血管内皮抑制素Endostar微球的累计释放曲线
图2实施例二中重组人血管内皮抑制素Endostar微球的累计释放曲线
图3重组人血管内皮抑制素Endostar微粉的SEM扫描电镜照片
图4重组人血管内皮抑制素Endostar微球的抑制HUVEC增殖的生物学活性
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明保护范围的限制。
实施例一
精密称取240mg重组人血管内皮抑制素Endostar微粉(含200mg重组人血管内皮抑制素Endostar)，将PLGA(Mw＝48000，50∶50)400mg溶于10ml乙腈中，将微粉加入PLGA的二氯甲烷与乙腈的混合有机溶液中，二氯甲烷∶乙腈＝1∶4(体积比)。4000rpm高速分散乳化，形成S/O初乳。将上述S/O初乳倾倒至含有0.3％卵磷脂与0.1％蔗糖酯的大豆油中，机械搅拌挥发溶剂(1000rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的载药量与包封率。载药量为18.02％，包封率为93.7％，平均粒径53.20μm。
称取100mg微球，置于至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1M pH 7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。每日取烧杯中缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图，释放时间为23天。(参见图1)
实施例二
精密称取120mg重组人血管内皮抑制素Endostar微粉(含100mg重组人血管内皮抑制素Endostar)，将PLGA(Mw＝10000，50∶50)400mg溶于10ml乙腈中，将微粉加入PLGA的乙腈溶液中，4000rpm高速分散乳化，形成S/O初乳。将上述S/O初乳倾倒至含有0.5％司盘80的药用轻质液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的载药量与包封率。载药量为28.25％，包封率为90.4％，平均粒径74.22μm。
称取100mg微球，置于至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1M pH 7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。每日取烧杯中缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图，释放时间为23天。(图2)
实施例三
精密称取实施例一中使用的同批次微粉化Endostar蛋白，用缓冲液复溶，稀释至1500ng/ml、1200ng/ml、1000ng/ml、800ng/ml、600ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml。用市售ELISA(酶联免疫测定)试剂盒测定其免疫学活性。方法：作一条未经微粉化的蛋白标准曲线，再作一条微粉化蛋白复溶后的标准曲线，比较两曲线在100ng/ml-1000ng/ml的吸光值(OD)差异，得免疫学活性保持率。活性保持率计算方法为：活性保持率＝100％-(未微粉化蛋白OD-微粉化后蛋白OD)/(未微粉化蛋白OD-空白值0.0392)*100％。表1显示，微粉化后的蛋白活性保持率大于90％。
表1
实施例四
取实施例二中的重组人血管内皮抑制素Endostar微粉，在SEM扫描电镜下观察其外观。(图3)
如图所示，左图的标尺为5微米，右图的标尺为10um，可见蛋白微粒的直径小于1um。
实施例五
取实施例2制备的微球进行重组人血管内皮抑制素Endostar微球的生物学活性测定
1、HUVEC细胞用添加FBS、ECGS、P/O Solution的ECM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。
2、细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心5min，弃上清，用培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入160μl细胞悬液，置37℃5％CO2培养箱中培养。
3、将重组人血管内皮抑制素原液和重组人血管内皮抑制素微球第1d、5d、10d、20d、30d释放液用pH7.4的磷酸盐缓冲液预稀释至2.5mg/ml，按孔中终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、0μg/ml，每孔加入40μl药物体积，每个梯度设3个平行，37℃5％CO2培养箱中培养96h。
4、加入5mg/ml MTT工作液，每孔20μl，置37℃5％CO2培养箱中培养4h，弃去细胞上清，每孔加入DMSO 200μl。放置10min，使用酶标仪490nm波长下测定OD值。
5、根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)＝(对照组OD值均数-实验组OD值均数)/(对照组OD值均数-空白OD值均数)。(图4)
Claims (11)
1.含重组人血管内皮抑制素微粉缓释微球的制备方法，其特征在于：
（1）将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂中得到内油相，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙酸乙酯的一种或多种，所述乳酸-羟基乙酸共聚物在有机溶剂中的浓度为10～500mg/ml；
（2）再将重组人血管内皮抑制素微粉加入内油相，所述重组人血管内皮抑制素微粉中含重组人血管内皮抑制素10%至95%（重量比），所述重组人血管内皮抑制素微粉的制备包含以下步骤：
①在含有重组人血管内皮抑制素的缓冲盐溶液中加入可溶性金属盐，然后调整该溶液的PH至蛋白的等电点，得到蛋白的细小颗粒沉淀，蛋白溶液变为混悬液；
②将混悬液与冻干保护剂混合均匀后，冻干；
③将冻干后的固体粉块用溶剂洗涤，除去冻干保护剂，得重组人血管内皮抑制素微粉；
（3)以每分钟4000-50000转高速分散重组人血管内皮抑制素微粉及内油相，得到固液混悬液；
（4）将所得混悬液置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包固型复乳，所述的植物油为大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一种或多种，所述的矿物油为液体石蜡或者二甲基硅油，所述植物油的乳化剂为卵磷脂、蔗糖酯的一种或多种，加入量为植物油的0.1%～10%（w/v）,所述矿物油的乳化剂为司盘-80、司盘-60、蔗糖酯的一种或多种，加入量为矿物油的0.1%～10%（w/v）；
（5）持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品，所述的洗涤微球的溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量大小为5000～150000，其单体组成比例乳酸：羟基乙酸为99:1～50:50。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述共聚物为乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸-羟基乙酸分子量大小为5000～80000，其单体组成比例乳酸：羟基乙酸为85:15～50:50。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述有机溶剂为二氯甲烷、乙腈的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述混悬液和冻干保护剂的体积比为1:99～99:1；混悬液中重组人血管内皮抑制素蛋白浓度为0.01mg/ml～500mg/ml。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述混悬液和冻干保护剂的体积比为15:85～90:10。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述冻干保护剂为聚乙二醇，分子量为1000～8000Da，冻干保护剂的浓度为1%～50%（w/v）。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中所述含乳化剂的植物油为含卵磷脂和蔗糖酯的大豆油；所述含乳化剂矿物油为含司盘-80的药用轻质液体石蜡。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）所述洗涤微球的溶剂为石油醚。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述微球中重组人血管内皮抑制素微粉的含量为5%至40%（重量比）。
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| CN1754570A (zh) * | 2004-09-28 | 2006-04-05 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 含干扰素或其类似物的注射用缓释微球及其制备方法 |
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| CN1981744A (zh) * | 2005-12-12 | 2007-06-20 | 上海医药工业研究院 | 石杉碱及其衍生物的注射用缓释微球的制备方法 |
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2008
- 2008-06-30 CN CN2008101227642A patent/CN101618208B/zh active Active
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