CN103393632B - 一种卡巴他赛药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卡巴他赛与药学上可接受生物学载体的药物组合物及其制备方法，所述卡巴他赛药物组合物实际上是含卡巴他赛的纳米颗粒胶体分散系统。卡巴他赛被包封在由蛋白质制成的聚合物壳体内或与蛋白质以缔合方式结合而形成纳米颗粒，其中卡巴他赛与蛋白质质量比为1: 8～15，pH范围为5.0～7.0，颗粒的平均直径不大于200nm，Zeta电位在-10～-30mv之间，并可进行除菌过滤。该组合物可通过高压均浆法和蛋白变性复性法两种方法制备。本发明制备的组合物可转化为可重新分散的块状物或粉末，本发明组合物在水性介质中重新分散后，37℃条件下可保持至少48小时稳定性，能够满足静脉点滴治疗需要。

Description

一种卡巴他赛药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种卡巴他赛药物组合物以及可用于静脉内给予药理活性物质卡巴他赛的微粒载体的制备方法。本发明中的卡巴他赛药物组合物实际上是含卡巴他赛的纳米颗粒胶体分散系统。卡巴他赛被包封在由蛋白质制成的聚合物壳体内或与蛋白质以缔合方式结合而形成纳米颗粒，pH介于5.0～7.0，颗粒平均直径不大于200nm。本发明胶体系统的制备不需要使用常规的表面活性剂或任何聚合物核心基质，并可进行无菌过滤。

背景技术

卡巴他赛，英文名CABAZITAXEL，其化学名为4-乙酰氧基-2α-苯甲酰氧基-5β，20-环氧基-1-羟基-7β，10β-二甲氧基-9-氧代紫衫-11-烯-13α-基（2R,3S）-3-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯，分子式为C₄₅H₅₇NO₁₄，结构式如下：

卡巴他赛属于紫杉烷类抗肿瘤药物，它通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用，属微管解聚抑制剂，它可与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能微管束的产生和微管的固定，从而抑制细胞的有丝分裂。

卡巴他赛注射液，商品名：JEVTANA，规格为60mg，一支为60mg卡巴他赛溶于1.5ml吐温80溶液中，另一支为溶剂，为5.7ml13%（w/w）乙醇水溶液，由赛诺菲-安万特（Sanofi-Aventis）公司研发，于2010年6月17号被FDA批准上市。JEVTANA被推荐用于与泼尼松联用治疗既往用含多烯紫杉醇治疗方案激素难治转移性前列腺癌患者。

尽管卡巴他赛具有良好的抗肿瘤作用，但是其水溶性较差，约6μg/ml，因此临床上使用的卡巴他赛注射液需使用表面活性剂聚山梨酯80（吐温-80）及助溶剂乙醇来达到溶解卡巴他赛的目的。虽然使用表面活性剂吐温80可以配制成注射液，但是吐温80在临床应用中易产生不良反应并引起较多的并发症，较为常见的包括严重的过敏反应、体液潴留等，因此临床使用时需采用激素类药物预先给药防止过敏，并需缓慢滴注（通常在1小时以上）。此外，吐温80还具有溶血性、黏性大，且不能与聚氯乙烯输送装置一起使用（倾向于浸出高毒性的邻苯二甲酸二乙基己酯）等问题，因此给临床应用带来诸多不便和安全性问题。

为降低注射液静脉给药的副作用，一个有效的方法就是将药理活性物质包入微米或纳米级的粒子中。一方面，静脉注射的粒子可以缓释药理活性物质并延长其体内半衰期；另一方面，靶向材料可以将粒子中的药理活性物质靶向的释放。

现有的涉及纳米粒子的制备技术中，如Abraxane的制备方法（CN1515244A），将蛋白溶液与有机溶剂均匀混合并高压均浆，形成以药理活性物质为核心的白蛋白纳米颗粒。专利中明确描述只有在非常低的有机相组分（＜3%，V/V）情况下制备的颗粒才能无菌过滤，本发明人多次重复前述专利实施例，尝试制备不同紫杉烷类化合物（如紫杉醇、多西紫杉醇及卡巴他赛）蛋白质纳米颗粒，不能实现其实施例及说明书中所描述的结果，颗粒稳定性均不理想，难以满足静脉给药需要，而且非常低的相组分意味着较大的水相体积（有机相中药物浓度确定时）及较长的制备时间。与异常低的相组分相对应的，其实施例中有机相及水相混合物均浆结束后药液中药物浓度均不高于5mg/ml。

其他的纳米粒子制备技术中，专利CN102048695A通过蛋白的展开与再折叠或自组装将药理活性物质包入其中，形成蛋白纳米颗粒。本发明人多次重复前述专利中的实施例，也不能实现其实施例及说明书中所描述的结果，尤其在通过透析及其他方式去除小分子化合物过程中，蛋白纳米颗粒稳定性较差，原因可能为有机溶剂及蛋白变性剂长时间存在于纳米颗粒混悬液中，在小分子化合物完全除去之前已经对蛋白纳米颗粒的稳定性造成破坏。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种更好的用于体内递送卡巴他赛或其溶剂合物的药物组合物，此组合物实际为一种纳米颗粒胶体分散系统，该组合物不含目前卡巴他赛注射液中的乙醇及吐温80，避免了过敏反应的发生，解决了卡巴他赛注射液临床使用中容易发生严重毒副作用和输液时间较长的问题。

本发明的另一目的是提供更好的用于体内递送卡巴他赛纳米颗粒胶体分散系统的制备方法。通过该方法制备的药物组合物的优点在于可通过孔径0.22μm的滤器进行除菌过滤，以制备可供静脉滴注的药物制剂。

本发明所述组合物实际为卡巴他赛或其溶剂合物与蛋白质组成的纳米颗粒胶体系统。在该分散系统中卡巴他赛或其溶剂合物被包被在蛋白质内或与蛋白质以缔合的方式结合，其中，大部分药液由蛋白壳包被，少部分在蛋白壳外部以缔合方式与外侧蛋白结合。

该药物组合物中，卡巴他赛与蛋白质质量比为1:8～15，pH为5.0～7.0，平均粒径不大于200nm，Zeta电位在-10～-30mv之间。其中，蛋白质在纳米颗粒中起到分散、稳定微粒作用，蛋白质用量较少无法制备稳定的蛋白纳米颗粒，蛋白质用量过多则载药量较低且不经济。

优选的，卡巴他赛与蛋白质质量比为1:9～12，Zeta电位为-15～-30mv。

更优选的，卡巴他赛与蛋白质质量比为1:10～11，Zeta电位为-20～-30mv。

所述蛋白质选择性地带有巯基或二硫键；所述的的蛋白质优选天然蛋白质；所述的蛋白质更优选人血白蛋白。

本发明的药物组合物中，所述卡巴他赛为非晶体、结晶体或两者的混合物；优选卡巴他赛为非晶体，因为非晶体更易于溶解和吸收，从而达到更高的生物利用度。

本发明的药物组合物中，所述卡巴他赛溶剂合物选自卡巴他赛与丙酮、乙醇、乙醇/水混合溶剂、丁醇合物、甲基叔丁基醚、正丙醇、异丙醇、水、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺等形成的溶剂合物。

本发明的卡巴他赛药物组合物为蛋白质包被纳米颗粒的无菌冷冻干燥制剂，在所述冷冻干燥制剂中含有冻干保护剂及蛋白稳定剂；其中所述冻干保护剂选自甘露醇、天冬氨酸、蔗糖、山梨醇、乳糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、氨基酸、右旋糖苷之一或其任意组合，其中优选的冻干保护剂为甘露醇；所述蛋白稳定剂选自海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸钠之一或其任意组合。

本发明中所述药物组合物可转化为可重新分散的粉末或块状物，采用适宜的水性介质能够使所述粉末或块状物复溶为含有至少大约0.1mg/ml卡巴他赛的液体混悬液，所述适宜的水性介质选自生理盐水、缓冲生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液或类似的介质之一或其任意组合。

本发明所述卡巴他赛药物组合物由包被蛋白的卡巴他赛纳米颗粒及其所结合的游离蛋白组成，在水性介质中37℃条件下可保持至少48小时稳定性，能够满足静脉点滴治疗需要。

本发明进一步提供了两种制备该药物组合物的技术方案。

第一种制备方法：高压均质乳化法

本发明进一步提供了高压均质乳化法制备该纳米颗粒分散胶体系统的技术方案。本技术方案的重要特征是通过调整有机相及水相的相组分，惊奇的发现在较高有机相组分，即高于5%（V/V）条件下可制备高药物浓度的蛋白纳米颗粒，均浆结束后药液中卡巴他赛浓度可达6～16mg/ml，其平均粒径不大于200nm，稳定性显著优于低浓度药液（＜5mg/ml）且易于除菌过滤，更有利于产业化。

本制备方法包括以下步骤：

1）将卡巴他赛或其溶剂合物溶于有机溶剂中，为有机相；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲基吡咯烷酮或类似溶剂之一或其任意组合的混合物；由于卡巴他赛在有机溶剂中的浓度对于纳米颗粒的直径大小有影响，所以有机相中卡巴他赛浓度范围为5%-40%（w/v）；

2）将所述蛋白质分散于水性介质中，为水相；由于水性介质的用量影响着有机相相组分，即影响着均浆时混悬液中药物浓度，所以该步骤中蛋白质的浓度范围为5-25%（w/v）；

3）将步骤1）的有机相与步骤2）的水相混合，将该混合物（不含表面活性剂）置于压力范围3,000～30,000psi的高压均浆器内高压均浆至少3个循环，制备的颗粒平均直径不大于200nm（可以进行无菌过滤），均浆时有机相相组分不低于5%（v/v），混悬液中药物浓度不低于6mg/ml，优选混悬液中药物浓度不低于8mg/ml；

4）将步骤3）所得混悬液减压蒸发，除去有机溶剂，生成由蛋白质包被的卡巴他赛纳米颗粒及蛋白质组成的胶体系统；

5）将步骤4）中所得胶体系统进行除菌过滤，然后冷冻干燥，即制得卡巴他赛蛋白质药物组合物无菌冷冻干燥制剂。

上述经除菌过滤后进行冷冻干燥得到卡巴他赛的蛋白纳米颗粒冻干制剂，具有良好的化学稳定性与物理稳定性；其中所述蛋白纳米颗粒可包载占蛋白纳米颗粒总质量1%～20%的卡巴他赛。

根据上述制备方法所述，卡巴他赛被溶解在一种合适的溶剂内作为有机相，而在水相中加入蛋白质是起稳定剂作用，易形成稳定的纳米液滴，加入蛋白质的浓度范围约为5-25%（w/v），范围在10%-20%(w/v)最好。由于白蛋白本身即具有一定的表面活性，与常规的纳米颗粒形成方法不同，混合物内不需要加入表面活性剂（例如，十二烷基硫酸钠、卵磷脂、吐温80和类似化合物）。本发明采用白蛋白替代常规表面活性剂，避免了常规表面活性剂的严重毒副作用。

有机相及水相混合物于高压均浆器内进行均化作用，通常的操作压力在3,000至30,000磅/英寸²，此过程在6,000至25,000磅/英寸²范围内进行更好。通过调整处方中有机相及水相的相组分，有机相组分大于5%（V/V）时，药液中卡巴他赛浓度可达到6～16mg/ml，所得到的含卡巴他赛的白蛋白纳米粒平均粒径不大于200nm，而根据专利CN1515244A中各实施例描述，高压均浆结束后药液中药物浓度均不高于5mg/ml。

步骤3）所述的减压蒸发可以使用膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器，或类似设备。减压蒸发温度为40℃，温度大于40℃药液稳定性低，小于40℃溶剂挥发速度较慢。在蒸发后药液稳定性考察中，发明人惊奇的发现，均浆药液中主药浓度低于5mg/ml时，药液室温条件下放置3～6小时即出现稳定性下降现象，粒径呈现增大趋势且除菌过滤后主药回收率下降。相反的，均浆药液中主药浓度不低于6mg/ml时，蒸发后得到的药液为稳定的纳米颗粒胶体分散系统，其室温稳定性可达到36小时，更优选的，主药浓度为8mg/ml时，其室温稳定性可达48小时。

蛋白质包衣的卡巴他赛纳米颗粒经冷冻干燥后得到含卡巴他赛及蛋白质的冻干制剂，此冻干制剂可采用适宜的水性介质复溶为液体混悬液，这些水性介质有生理盐水、缓冲生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液或类似的介质，以及任何两种及两种以上这些介质的混合物。

为得到直径小于200nm并可无菌过滤的颗粒，有机相内含有一种与水不混溶的有机溶剂是非常必要的。在高压均浆条件下，上述溶剂在水相中形成极微细的非水性溶剂分散小滴（含溶解的药理活性物质），并在减压条件下快速去除，形成可无菌过滤纳米颗粒。

由于蛋白质（例如，人血白蛋白）本身起冻干保护剂作用，因此不需要常规的冻干保护剂及蛋白稳定剂，如甘露醇、甘油或类似化合物及类似化合物组合。尽管不需要，但这些常规的冷冻保护剂及蛋白稳定剂可以加入到本发明的配方中。

第二种制备方法：蛋白变性复性法

本技术方案的目的在于利用蛋白及多肽展开后与高压均质相结合的方法，将药理活性物质包入蛋白纳米颗粒，用于体内递送。本技术方案的重要特征在于针对利用蛋白及多肽展开后直接制备白蛋白纳米粒过程中容易出现凝聚现象的缺点，提供了一个更稳定的制备高浓度卡巴他赛纳米颗粒的方法，其药液稳定性显著优于已有技术所制备的低浓度药液，并可进行除菌过滤，且更有利于产业化。

本制备方法包括以下步骤：

1）用水性介质溶解蛋白质获得蛋白质溶液，所述水性介质选自水、生理盐水、糖溶液；

2）将卡巴他赛或其溶剂合物溶于有机溶剂中，为有机相；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲基吡咯烷酮或类似溶剂之一或其任意组合的混合物；

3）将蛋白结构展开剂添加到步骤1）所得蛋白溶液中，持续反应0.1～4小时，除去蛋白结构展开剂；所述蛋白结构展开剂选自2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、甲巯丙、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲巯咪唑、乙酰半胱氨酸或它们的组合；

4）将步骤2）所得有机相加入步骤3）所得溶液中，混合后加入压力范围3,000～30,000psi的高压均浆器内，高压均浆至少3个循环，制备的蛋白纳米颗粒平均直径不大于200nm，均浆时混悬液中药物浓度不低于6mg/ml，优选的均浆时混悬液中药物浓度不低于8mg/ml；

5）将步骤4）所得混悬液减压蒸发，除去有机溶剂，生成由蛋白质包被的卡巴他赛纳米颗粒及蛋白质组成的胶体系统；

6）将步骤5）中所得胶体系统进行除菌过滤，然后冷冻干燥，即制得卡巴他赛蛋白质药物组合物无菌冷冻干燥制剂。

其中，步骤3）中所述蛋白结构展开剂优选谷胱甘肽，由于浓度过低无法将蛋白链充分展开，不利于药物的包裹；蛋白浓度过高则对蛋白结构破坏程度过高，很难再复性，因此其浓度为1～16mM。

本技术方案中有机相内可含有一种与水不混溶的有机溶剂，获得的蛋白纳米颗粒平均粒径不大于200nm，这种颗粒由于可以经受无菌过滤而特别有利，避免了高温灭菌等更为强烈的除菌方法。

本技术方案在加入卡巴他赛前通过及时的去除多余的蛋白展开剂及其它小分子化合物，发明人惊奇的发现蛋白纳米颗粒在后续的透析及其它操作中保持了良好的稳定性，Zeta电位在-20～-30mv之间，室温稳定性可达48小时。形成鲜明对比的是，发明人多次重复专利CN102048695A中的实施例，不曾实现其实施例及权利要求书中所说明的结果，尤其在通过透析及其他方式去除小分子化合物过程中，蛋白纳米颗粒稳定性较差，通常在室温6小时内已出现絮状沉淀。

上述有机溶剂去除方式（40℃条件下减压蒸发）包括但不限于上述减压蒸发方法，其它的方法可以包括旋转蒸发、减压蒸馏、喷雾干燥或类似方法。

综上所述，本发明提供了两种卡巴他赛蛋白质纳米颗粒的制备方法，此两种方法因未采用卡巴他赛注射液中添加的乙醇及吐温80而避免了其带来的严重过敏反应。

本发明中的两种制备方法相比于同类技术的优势在于：

第一种制备方法，通过调整处方中有机相及水相相组分，可在较高有机相组分条件下制备出稳定性优越的高浓度卡巴他赛纳米颗粒，且更有利于产业化。

第二种制备方法中，由于蛋白变性剂在溶液体系中长时间的存在对于蛋白质本身的结构及蛋白质颗粒的稳定性均可以造成破坏性的影响，造成整个体系的不稳定，因此，蛋白展开后，在加入卡巴他赛前及时的去除蛋白展开剂，从而使蛋白纳米颗粒在后续的透析及其它操作中保持了良好的稳定性，制备出了稳定性优越的卡巴他赛纳米颗粒。

本发明制备的卡巴他赛蛋白纳米颗粒够以较小体积输送高剂量药理活性物质，这可以使病人接受大体积液体输注时的不适感和住院时间减至最小。此外，蛋白质外壳或包衣通常在体内可被蛋白水解酶完全降解，因此本药物组合物不会带来副作用。

附图说明

图1为实施例2制备的纳米颗粒粒径及粒径分布图；

图2为实施例2制备的纳米颗粒光学显微镜下形态；

图3为实施例8制备的纳米颗粒光学显微镜下形态；

图4为实施例8制备的纳米颗粒粒径及粒径分布图；

图5为实施例9制备的纳米颗粒光学显微镜下形态；

图6为实施例11制备的纳米颗粒粒径及粒径分布图；

图7为实施例11制备的纳米颗粒光学显微镜下形态。

具体实施方式

通过参照以下实施例进一步详细说明本发明，但不限于此。

实施例1高压均质乳化法使用水相溶溶剂作为有机相溶媒——对照组

将600mg卡巴他赛溶解于5ml无水乙醇作为有机相。90ml人血白蛋白（6%,w/v）水溶液为水相。水相及有机相混合物在低转速条件下均浆2分钟以制备成粗制乳液，粗乳液转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆5次循环，得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去无水乙醇。得到的分散悬浮液中卡巴他赛颗粒平均直径大于300nm（Malvern Zetasizer）。

实施例2高压均质乳化法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

本实施例介绍可无菌过滤的卡巴他赛颗粒的制备过程。将300mg卡巴他赛溶解于1.35ml的三氯甲烷及0.15ml的无水乙醇中，有机相加入到28.5ml（9.47%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆7次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，pH为6.4，Zeta电位为-26mv，卡巴他赛颗粒平均直径一般为120～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡巴他赛得到回收。

分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。

附加实验表明甘氨酸、甘露醇、蔗糖及乳糖均可以作为冻干保护剂，优选蔗糖。

实施例3高压均质乳化法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

将300mg卡巴他赛溶解于1.5ml的三氯甲烷及0.15ml的无水乙醇中，有机相加入到23.35ml（12.85%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆8次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去无水乙醇和三氯甲烷。得到的分散悬浮液为半透明，pH为6.5，Zeta电位为-25mv，卡巴他赛颗粒平均直径一般为120～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡巴他赛得到回收。

分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例4高压均质乳化法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

本实施例介绍可无菌过滤的卡巴他赛颗粒的制备过程。将1g卡巴他赛溶解于4.5ml的三氯甲烷及0.5ml的无水乙醇中，有机相加入到57.5ml（20.9%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆7次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，pH为6.9，Zeta电位为-30mv，卡巴他赛颗粒平均直径一般为120～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡巴他赛得到回收。

分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例5高压均质乳化法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

本实施例介绍可无菌过滤的卡巴他赛颗粒的制备过程。将500mg卡巴他赛溶解于3.0ml的三氯甲烷及0.5ml的无水乙醇中，有机相加入到59ml（8.47%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆5次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，pH为6.5，Zeta电位为-25mv，卡巴他赛颗粒平均直径一般为120～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡巴他赛得到回收。

分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例6高压均质乳化法—有机相溶剂相组分对颗粒大小影响

本实施例说明在本发明中可在相对较高相组分条件下制备较小粒径的颗粒。

在有机相内将乙醇含量保持在10%（v/v），改变有机溶剂的相组分，按照实施例2相同步骤进行一系列实验，结果发现，并非仅仅在异常低的相组分条件下才可以制备出可无菌过滤的纳米颗粒。

表1有机溶剂相组分对颗粒大小影响

相组分	1.0%	1.5%	2.0%	2.5%	4.0%	8%
							颗粒平均直径（nm）	150.0nm	148.1nm	140.1nm	135.8nm	128.2nm	120.6nm

实施例7蛋白变性复性法—蛋白展开后直接加入卡巴他赛制备纳米颗粒——对照组

3.0gHSA溶解于40ml pH7.4的TRIS缓冲液中，37℃水浴保温搅拌条件下加入巯基乙醇，巯基乙醇此时的浓度为0.005M，持续反应30分钟后加入1ml300mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷溶液，30分钟后反应液以pH7.4的TRIS缓冲液透析24小时，所得悬浮液颗粒平均粒径大于200nm，透析过程中药液中出现微量絮状沉淀，经浓缩处理后无法通过0.22μm微孔滤膜过滤器。

实施例8蛋白变性复性法—蛋白展开剂及时去除对颗粒直径大小及稳定性影响

3.0gHSA溶解于40ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中，37℃水浴保温搅拌条件下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽此时的浓度为0.005M，持续反应30分钟，反应液以以截留分子量为50,000的超滤膜进行蛋白展开剂的超滤去除，两小时后加入1ml300mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷溶液，30分钟后反应液以pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，透析过程中药液稳定性良好，所得颗粒粒径小于150nm，将分散悬浮液浓缩后通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。

卡巴他赛含量的HPLC法测定结果显示，过滤后90%以上的卡巴他赛得到回收。冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。以生理盐水进行复溶，分散悬浮液pH为7.0，Zeta电位为-22.8mv（Nano Zetasizer），室温稳定性可达60小时。

实施例9蛋白变性复性法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

3.0gHSA溶解于40ml水中，37℃水浴保温搅拌条件下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽此时的浓度为0.005M，持续反应30分钟后反应液以水进行透析，24小时后加入1ml300mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷-无水乙醇（9:1，V/V）溶液，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下进行5次循环，均质后药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10～15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，卡巴他赛颗粒平均粒径小于130nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。

卡巴他赛含量的HPLC法测定结果显示，过滤后97%以上的卡巴他赛得到回收。冷冻干燥所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。以生理盐水进行复溶，分散悬浮液pH为6.0，Zeta电位为-26.1mv（Nano Zetasizer），室温稳定性可达60小时。

实施例10蛋白变性复性法制备小于200nm可无菌过滤的纳米颗粒

2.7gHSA溶解于40ml水中，37℃水浴保温搅拌条件下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽此时的浓度为0.008M，持续反应30分钟后反应液以水进行透析，24小时后加入1ml400mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷-无水乙醇（9:1，V/V）溶液，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下进行5次循环，均质后药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10～15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，卡巴他赛颗粒平均粒径小于130nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。

卡巴他赛含量的HPLC法测定结果显示，过滤后97%以上的卡巴他赛得到回收。冷冻干燥所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。以生理盐水进行复溶，分散悬浮液pH为5.5，Zeta电位为-25.2mv（Nano Zetasizer），室温稳定性可达72小时。

实施例11蛋白变性复性法制备纳米颗粒—外加机械力对颗粒大小影响

本实施例说明在本发明中外加机械力对纳米颗粒大小的重要性。

3.0gHSA溶解于40ml pH7.4的磷酸盐缓冲液中，37℃水浴保温搅拌条件下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽此时的浓度为0.005M，持续反应30分钟后反应液以pH7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，24小时后加入1ml300mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷溶液，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下均浆6次循环，均质后药液以pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，所得样品经浓缩处理后进行冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。

卡巴他赛含量的HPLC法测定结果显示，过滤后90%以上的卡巴他赛得到回收。以生理盐水进行复溶，分散悬浮液pH为7.0，Zeta电位为-25.6mv（NanoZetasizer），室温稳定性可达72小时。

实施例12蛋白变性复性法制备纳米颗粒—有机溶剂的快速蒸发对颗粒直径大小影响

3.0gHSA溶解于40ml水中，37℃水浴保温搅拌条件下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽此时的浓度为0.005M，持续反应30分钟后反应液以水进行透析，24小时后加入1ml300mg/ml的卡巴他赛三氯甲烷溶液，混合物在低转速条件下剪切均浆3分钟形成粗乳液，转移至高压均浆器内（Microfulidics），3,000～30,000psi压力条件下进行5次循环，均质后药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10～15KPa）蒸发30分钟除去三氯甲烷。得到的分散悬浮液为半透明，卡巴他赛颗粒平均粒径小于130nm（MalvernZetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。

卡巴他赛含量的HPLC法测定结果显示，过滤后95%以上的卡巴他赛得到回收。冷冻干燥所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。以生理盐水进行复溶，分散悬浮液pH为5.0，Zeta电位为-26.9mv（Nano Zetasizer），室温稳定性可达60小时。

表2蛋白变性剂的及时去除对分散悬浮液zeta电位及稳定性影响

	实施例8	实施例9	实施例10	实施例11	实施例12
						Zeta电位	-22.8mv	-26.1	-25.2mv	-25.6mv	-26.9mv
37℃生理盐水中稳定时长	＞60hr	＞60hr	＞72hr	＞72hr	＞60hr

Claims (12)

1.一种卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是由卡巴他赛与蛋白质组成的纳米颗粒胶体分散系统，其中卡巴他赛与蛋白质的质量比为1:8～15，pH为5.0～7.0，平均粒径不大于200nm，Zeta电位为-10～-30mv；

所述的蛋白质选自人血白蛋白。

2.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述卡巴他赛与蛋白质的质量比为1:9～12，Zeta电位为-15～-30mv。

3.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述卡巴他赛与蛋白质的质量比为1:10～11。

4.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述Zeta电位为-20～-30mv。

5.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述卡巴他赛包被在蛋白质内或以缔合方式与蛋白质结合。

6.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述卡巴他赛为非晶体、结晶体或两者的混合物。

7.根据权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物，其特征在于，所述卡巴他赛为非晶体。

8.一种卡巴他赛无菌冷冻干燥制剂，其特征在于，所述卡巴他赛无菌冷冻干燥制剂为蛋白质包被纳米颗粒的无菌冷冻干燥制剂，在所述无菌冷冻干燥制剂中含有权利要求1所述的卡巴他赛药物组合物、冻干保护剂及蛋白稳定剂；其中所述冻干保护剂选自甘露醇、蔗糖、山梨醇、乳糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、氨基酸、右旋糖苷之一或其任意组合；所述蛋白稳定剂选自海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸钠之一或其任意组合。

9.根据权利要求8所述的卡巴他赛无菌冷冻干燥制剂，其特征在于，其中所述冻干保护剂为甘露醇。

10.根据权利要求8所述的卡巴他赛无菌冷冻干燥制剂，其特征在于，该无菌冷冻干燥制剂可转化为可重新分散的粉末或块状物，采用适宜的水性介质能够使所述粉末或块状物复溶为含有至少0.1mg/ml卡巴他赛的液体混悬液；所述适宜的水性介质选自生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液之一或其任意组合。

11.一种制备权利要求8所述的卡巴他赛药无菌冷冻干燥制剂的方法，包括以下步骤：

1)用水性介质溶解蛋白质获得蛋白质溶液，所述水性介质选自水、生理盐水、糖溶液；所述的蛋白质选自人血白蛋白；

2)将卡巴他赛溶于有机溶剂中，为有机相；所述有机溶剂选自三氯甲烷或三氯甲烷与无水乙醇的混合物；

3)将蛋白结构展开剂添加到步骤1)所得蛋白溶液中，持续反应0.1～4小时，除去蛋白结构展开剂；所述蛋白结构展开剂选自谷胱甘肽；所述蛋白结构展开剂谷胱甘肽的浓度为1～16mM；

4)将步骤2)所得有机相加入步骤3)所得溶液中，混合后加入压力范围3,000～30,000psi的高压均浆器内，高压均浆至少3个循环，制备的蛋白纳米颗粒平均直径不大于200nm，均浆时混悬液中药物浓度不低于6mg/ml；

5)将步骤4)所得混悬液减压蒸发，除去有机溶剂，生成由蛋白质包被的卡巴他赛纳米颗粒及蛋白质组成的胶体系统；

6)将步骤5)中所得胶体系统进行除菌过滤，然后冷冻干燥，即制得卡巴他赛蛋白质药物组合物无菌冷冻干燥制剂。

12.根据权利要求11所述的卡巴他赛无菌冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述均浆时混悬液中药物浓度不低于8mg/ml。