CN110133168A - Hplc法测定卡巴他赛有关物质的方法 - Google Patents

Hplc法测定卡巴他赛有关物质的方法 Download PDF

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CN110133168A CN201910077437.8A CN201910077437A CN110133168A CN 110133168 A CN110133168 A CN 110133168A CN 201910077437 A CN201910077437 A CN 201910077437A CN 110133168 A CN110133168 A CN 110133168A
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郑敬
曾燕
晋继增
朱朝清
王利春
王晶翼
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Abstract

本发明公开了一种HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水相‑乙腈‑甲醇为流动相进行梯度洗脱测定卡巴他赛有关物质，所述的流动相由流动相A和流动相B组成，所述的流动相A中乙腈‑甲醇‑水相的体积比为40～50:5～15:40～50，所述的流动相B中乙腈‑甲醇‑水相的体积比为60～70:5～15:25。本发明采用HPLC法测定卡巴他赛有关物质，对卡巴他赛及其降解物质能进行有效分离，且分离度好，灵敏度高。

Description

HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，特别是测定卡巴他赛异构体或工艺杂质的方法。
背景技术
卡巴他赛(cabazitaxel)，化学名称为(2α,5β,7β,10β,13α)-4-乙酰氧基-13-({(2R,3S)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-羟基-3-苯丙酰基}氧基)-1-羟基-7,10-二甲氧基-9-氧-5,20-环氧紫衫-11-烯-2-基苯甲酸酯，分子式为C45H57NO14，化学结构如下：
在卡巴他赛原料药和制剂的稳定性研究过程中发现，其对紫外光和高温敏感，对于原料药和制剂的降解杂质需要进行质量控制。由于异构体杂质与主成分结构和极性相似，液相难以分离，方法建立比较困难，目前尚未有准确灵敏地检测卡巴他赛异构体杂质含量有效方法的报道。
卡巴他赛的杂质主要有以下三个来源：一是本品原料合成过程中带入的起始原料、中间体；二是原料合成反应中生成的副产物；三是产品在反应过程和贮藏期间由于环境的影响会产生降解杂质。这些杂质会影响到药品的纯度和质量，需要建立有关物质的分析方法来控制这些杂质的含量。
CN 103217493 B中公开了一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其采用C18色谱对卡巴他赛合成中的起始物料、中间体副产物进行检测，而未给出对卡巴他赛及其降解产物和异构体的检测方法。
文献“卡巴他赛有关物质检验方法筛选”(李明玥，《生物技术世界》，2016年第4期186-188)公开了两种检测方法，方法一是采用流动相A：乙腈，流动相B：硫酸二氢钠水溶液，磷酸调节pH至3.5；方法二是采用流动相A：硫酸铵缓冲液-甲醇(1708:292，w/w)，流动相B：硫酸缓冲液-甲醇(758:242，w/w)，进行梯度洗脱检测卡巴他赛及其降解物质。结合方法筛选和卡巴他赛及杂质结构信息可知，该检测方法无法保证卡巴他赛及其杂质全部洗脱出峰。按照文献方法开始复核试验，结果显示卡巴他赛和降解产物无法分离且未能洗脱出峰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，可用于卡巴他赛及其降解物质的测定。
为了实现上述的目的，本发明的技术方案如下：
一种HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水相-乙腈-甲醇为流动相进行梯度洗脱测定卡巴他赛有关物质，优选地，所述的流动相由流动相A和流动相B组成，所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为40～50:5～15:40～50，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为60～70:5～15:25。
优选地，所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为42～45:8～15:42～48，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为62～68:8～15:25；更优选地，所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为45:10:45，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为65:10:25。
进一步的技术方案是，所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为67％～57％，33％～43％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为27％～17％，73％～83％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％。
优选地，所述的水相为用磷酸调的酸性水，其pH为3.5～6.0，优选地，pH为4.0～4.5，更优选地，pH为4.0。
进一步的技术方案是，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料颗粒度为3～5μm。
进一步的技术方案是，所述检测波长为210～280nm，优选地，检测波长为230nm。
进一步的技术方案是，所述的检测温度为25～30℃，优选地，柱温为30℃。
进一步的技术方案是，流动相的流速为0.5～2.0ml/min，样品的进样量为5μl～20μl；优选地，流动相的流速为1.0ml/min，样品的进样量为20μl。
进一步的技术方案是，所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为67％～62％，33％～38％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为27％～22％，73％～78％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％。
进一步的技术方案是，所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为65％～62％，35％～38％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为25％～22％，75％～78％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％。
根据一个具体的技术方案，所述的梯度洗脱时流动相A与流动相B的体积分数如下：
0min，100％，0％；
7min，62％，38％；
40min～50min，22％，78％；
50.1min～60min，100％，0％。
根据一个具体的技术方案，所述的梯度洗脱时流动相A与流动相B的体积分数如下：
0min，100％，0％；
7min，67％，33％；
40min～50min，27％，73％；
50.1min～60min，100％，0％。
根据一个具体的技术方案，所述的梯度洗脱时流动相A与流动相B的体积分数如下：
0min，95％，5％；
7min，57％，43％；
40min～50min，17％，83％；
50.1min～60min，95％，5％。
进一步的技术方案是，所述的方法包括以下步骤：
步骤A：供试品溶液的制备：取卡巴他赛或含卡巴他赛的制剂适量，加75％乙腈稀释制成每1ml中含1mg卡巴他赛的溶液，作为供试品溶液；
步骤B：对照溶液的制备：精密量取上述A制备的供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加75％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
步骤C：测定方法：精密量取对照溶液10μl～20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，再精密量取与对照溶液等量的供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：
本发明采用HPLC法测定卡巴他赛有关物质，对卡巴他赛及其降解物质能进行有效分离，相互之间无干扰，分离度好，灵敏度高。而且操作简便，易于控制，检测成本低，并具有良好的精密度、稳定性、灵敏度和重复性，杂质准确度回收率为90～110％，检测结果准确、可靠。
附图说明
图1为实施例1卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图；
图2为实施例2卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图；
图3为实施例3卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图；
图4为实施例4卡巴他赛高温降解后的HPLC色谱图；
图5为对比例1卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图；
图6为对比例2卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图；
图7为对比例3卡巴他赛及其相关物质的HPLC色谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但不限制本发明。
在本发明中，术语“卡巴他赛”在没有区别的情况下，可以是卡巴他赛的纯品、原料药、合成品等以卡巴他赛作为主成分的产品。本发明的测定方法均适用于上述产品的质量控制，并且这些产品的有关物质的测定方法也保护在本发明的保护范围内。
在本发明中，术语“有关物质”是指在药物制备和贮存过程中，可能产生的杂质。在本发明的实施例中，卡巴他赛的有关物质包括杂质E、杂质F和杂质I，其结构式如下：
杂质E：
杂质F：
杂质E、杂质F为市售，例如由深圳市祥根生物科技有限公司提供。
杂质I的制备方法如下：
取卡巴他赛原料与无水乙醇适量(API-无水乙醇5g：200ml，或适当提高API浓度)，置80℃水浴回流提取11天。将乙醇回流液减压浓缩至约20～50ml(样品浓度约0.1g/ml)，进行制备液相分离纯化，制备溶液冷冻干燥得杂质I。制备液相分离纯化的色谱条件如下：
色谱柱：Waters Sunfire Prep C18 OBD 19mm×250mm×5μm
流速：1.0ml/min；运行时间：36min；进样量：550μl；检测波长：215nm；柱温：室温
流动相：流动相A：乙腈-甲醇-水的体积比为45:10:45；流动相B：乙腈-甲醇-水的体积比为65:10:25。
梯度洗脱的条件如下：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
7 62 38
30 35 65
32 35 65
33 100 0
36 100 0
实施例1：
1、仪器与条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：资生堂C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：230nm；柱温30℃；流速：1ml/min。
流动相A：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为45:10:45；
流动相B：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为65:10:25。
按照下表1进行线性梯度洗脱；其中％为流动相A或流动相B占流动相的体积分数。
表1：实施例1的洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
7 62 38
40 22 78
50 22 78
50.1 100 0
60 100 0
2、试验步骤
分别精密称取卡巴他赛光降解杂质E、F、I样品3mg至5ml量瓶中，加适量DMF溶解后，再加75％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液；
取卡巴他赛对照品和杂质对照品贮备液适量，加乙腈稀释配置成每1ml中含有卡巴他赛1mg、卡巴他赛光降解杂质E、F、I均为5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，各物质的保留时间和分离度如表2。
表2：实施例1HPLC检测的保留时间和分离度
序号 保留时间 分离度
1 7.299 -
2 12.868 18.96
3 17.266 11.53
4 18.597 2.96
5 19.613 2.14
6 21.007 2.82
7 22.230 2.34
8 36.826 22.97
9 41.320 5.85
10 42.915 1.99
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中保留时间约2分钟的色谱峰为DMF溶剂峰，卡巴他赛出峰时间为18.597分钟，杂质E出峰时间为19.613分钟，杂质I出峰时间为21.007分钟，杂质F出峰时间为22.230分钟，卡巴他赛与杂质及杂质之间分离度均大于2.0，符合系统适用性要求。
实施例2：
1、仪器和条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：资生堂C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：230nm；柱温30℃；
流动相A：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为45:10:45；
流动相B：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为65:10:25。
按照下表3进行线性梯度洗脱；其中％为流动相A或流动相B占流动相的体积分数。
表3：实施例2的洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
7 67 33
40 27 73
50 27 73
50.1 100 0
60 100 0
2、试验步骤
分别精密称取卡巴他赛光降解杂质E、F、I样品3mg至5ml量瓶中，加适量DMF溶解后，再加75％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液；
取卡巴他赛对照品和杂质对照品贮备液适量，加乙腈稀释配置成每1ml中含有卡巴他赛1mg、卡巴他赛光降解杂质E、F、I均为5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，各物质的保留时间和分离度如表4。
表4：实施例2HPLC检测的保留时间和分离度
序号 保留时间 分离度
1 7.389 -
2 13.217 19.75
3 18.082 12.08
4 19.482 2.81
5 20.102 2.12
6 22.102 2.86
7 23.412 2.35
8 38.625 22.53
9 43.177 5.65
10 44.928 2.05
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中保留时间约2分钟的色谱峰为DMF溶剂峰，卡巴他赛出峰时间为19.482分钟，杂质E出峰时间为20.598分钟，杂质I出峰时间为22.102分钟，杂质F出峰时间为23.412分钟。卡巴他赛与杂质及杂质之间分离度均大于2.0，符合系统适用性要求。
实施例3：
1、仪器和条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：资生堂C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：230nm；柱温30℃；
流动相A：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为45:10:45；
流动相B：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为65:10:25。
按照下表5进行线性梯度洗脱；其中％为流动相A或流动相B占流动相的体积分数。
表5：实施例3的洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
7 57 43
40 17 83
50 17 83
50.1 95 5
60 95 5
2、试验步骤
分别精密称取卡巴他赛光降解杂质E、F、I样品3mg至5ml量瓶中，加适量DMF溶解后，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液；
取卡巴他赛对照品和杂质对照品贮备液适量，加乙腈稀释配置成每1ml中含有卡巴他赛1mg、卡巴他赛光降解杂质E、F、I均为5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3，各物质的保留时间和分离度如表6。
表6：实施例3HPLC检测的保留时间和分离度
序号 保留时间 分离度
1 7.035 -
2 12.177 18.78
3 16.067 10.93
4 17.203 2.56
5 18.123 1.94
6 19.372 2.66
7 20.507 2.16
8 33.764 21.14
9 37.853 5.61
10 39.374 1.96
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中保留时间约2分钟的色谱峰为DMF溶剂峰，卡巴他赛出峰时间为17.203分钟，杂质E出峰时间为18.123分钟，杂质I出峰时间为19.372分钟，杂质F出峰时间为20.507分钟。卡巴他赛与杂质及杂质之间分离度均大于1.94，符合系统适用性要求。
线性与范围：
精密称取各杂质适量，加75％乙腈溶解并稀释成浓度为5μg/ml的溶液，作为杂质贮备液。精密量取贮备液适量，加稀释剂制成系列线性溶液(浓度范围为定量限浓度～约5μg/ml)。分别对上述各溶液进行线性考察。以浓度(C)为横坐标(X轴)，以峰面积(A)为纵坐标(Y轴)，进行线性回归分析，计算各自线性回归方程及相关系数r，各杂质的相关系数r均大于99.9％，杂质E在0.2223μg/ml～4.9402μg/ml(相对供试品浓度0.022％～0.494％)范围内呈线性，杂质I在0.2167μg/ml～4.8153μg/ml(相对供试品浓度0.022％～0.482％)范围内呈线性，杂质F在0.2195μg/ml～4.8770μg/ml(相对供试品浓度0.022％～0.488％)范围内呈线性。
定量限和检测限
取杂质E、I和F，分别加75％乙腈制成浓度为0.2mg/ml溶液后，再加75％乙腈逐级稀释至适宜浓度，精密量取上述溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以10倍信噪比为定量限，3倍信噪比作为检测限。结果显示杂质E、I、F定量限浓度均相当于主成分的0.022％，检测限浓度相当于主成份的0.007％，方法灵敏度高。
重复性
称取卡巴他赛原料药样品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加75％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，平行配制6份，按照实施例1进行试验，杂质E和杂质I未检出，检测结果如表7：
表7：重复性实验的测试结果
中间精密度
按照重复性试验于不同时间、不同实验员平行配制6份样品，按照实施例1在不同仪器上进行试验，杂质E和杂质I未检出，检测结果如表8：
表8：中间精密度实验的测试结果
杂质回收率实验
根据杂质E限度0.15％，杂质F和I限度0.1％，，设计该限度浓度的50％、100％和150％三个水平浓度的回收率试验，验证方法准确度，具体如下。
杂质贮备液：精密称取杂质E、F、I各适量，分别加75％乙腈溶解并稀释制成浓度约为杂质E 15μg/ml和杂质F、I为25μg/ml的溶液，即得。
杂质对照品溶液：精密量取杂质E置10ml量瓶中，杂质F、I贮备液1ml置25ml量瓶中，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取卡巴他赛25mg，置25ml量瓶中，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得。
杂质E回收率样品：称取卡巴他赛约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，分别加0.5ml、1.0ml、1.5ml杂质贮备液，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得，每个回收率浓度平行配制三份样品。
50％杂质F和I回收率样品：称取卡巴他赛约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.5ml杂质贮备液，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得，平行配制三份样品。
100％杂质F和I回收率样品：称取卡巴他赛约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加1.0ml杂质贮备液，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得，平行配制三份样品。
150％杂质F和I回收率样品：称取卡巴他赛约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加1.5ml杂质贮备液，加75％乙腈溶解并稀释至刻度，超声，摇匀，即得，平行配制三份样品。
精密量取上述溶液按照实施例1试验，结果显示各杂质回收率范围为90.0％～110.0％，方法准确度好。数据汇总见表9-11：
表9：杂质E-回收率试验结果
表10：杂质F-回收率试验结果
表11：杂质I-回收率试验结果
实施例4：供试品高温放置后的有关物质检测
1、仪器和条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：资生堂C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：230nm；柱温30℃；
流动相A：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为45:10:45；
流动相B：乙腈-甲醇-酸性水(用磷酸将水调节至pH 4.0)，体积比为65:10:25。
按照下表12进行线性梯度洗脱；其中％为流动相A或流动相B占流动相的体积分数。
表12：实施例4的洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
7 62 38
40 22 78
50 22 78
50.1 100 0
60 100 0
2、试验步骤
取卡巴他赛注射液于60℃放置30天后的样品适量，精密称定，加75％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含有1mg卡巴他赛的溶液，作为供试品溶液；
精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加75％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取供试品溶液、对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液中如有降解杂质峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.5％)。结果见图4。
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中保留时间约2分钟的色谱峰为DMF溶剂峰，卡巴他赛出峰时间为18.113分钟，杂质I出峰时间为20.403分钟，杂质F出峰时间为22.099分钟，杂质E未出峰。样品中最大单杂杂质I含量为0.79％，总杂含量为1.38％。卡巴他赛的有关物质符合限度要求，可用于卡巴他赛原料药和制剂的有关物质检测和控制。
对比例1：
1、仪器与条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：资生堂C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：230nm；柱温35℃；
按照下表13进行线性梯度洗脱；
表13：对比例1的洗脱条件
时间(分钟) 乙腈(％) 水(％)
0 60 40
30 85 15
50 100 0
55 85 15
60 60 40
2、试验步骤
取实施例1中的系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图5。
结果表明：此色谱条件下，主峰保留时间为11.761分钟，与相邻杂质未达到基线分离，保留时间为22.915分钟的色谱峰实际为2个工艺杂质叠加，在此方法下不能分离。
对比例2：
1、仪器与条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；
流动相A：乙腈；
流动相B：0.067mol/L磷酸二氢钠水溶液，磷酸调节pH至3.5。
色谱柱：岛津C18，4.6mm×250mm，5μm。检测波长：210nm。柱温：30℃。流速：1.0ml/min
表14：对比例2的洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 8 92
4 8 92
18 15 85
30 20 80
30.1 8 92
40 8 92
2、试验步骤
取实施例1中的系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图6。
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中4-5分钟色谱峰为DMF溶剂峰和部分杂质的叠加，卡巴他赛及较多杂质均未洗脱出峰，无法实现有关物质测定。
对比例3：
1、仪器与条件
仪器：Agilent 1200液相色谱仪；
流动相A：硫酸铵缓冲液(取硫酸铵1.32g，加水2000ml，加硫酸0.4ml)-甲醇(1708:292，w/w)；
流动相B：硫酸铵缓冲液-甲醇(758:242，w/w)。
色谱柱：Waters Symmetry C18 5μm 150×3.0mm。
检测波长：210nm。柱温：30℃。流速：0.6ml/min。
表15：对比例3的洗脱条件
2、试验步骤
取实施例1中的系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图7。
结果表明：此色谱条件下，系统适用性溶液中仅有溶剂峰，各物质色谱峰本身未达到基线分离，卡巴他赛及其杂质均未洗脱出峰。

Claims (10)

1.一种HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于，选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水相-乙腈-甲醇为流动相进行梯度洗脱测定卡巴他赛有关物质，优选地，所述的流动相由流动相A和流动相B组成，所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为40～50:5～15:40～50，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为60～70:5～15:25。
2.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为42～45:8～15:42～48，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为62～68:8～15:25；优选地，所述的流动相A中乙腈-甲醇-水相的体积比为45:10:45，所述的流动相B中乙腈-甲醇-水相的体积比为65:10:25。
3.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为67％～57％，33％～43％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为27％～17％，73％～83％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％。
4.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的水相为用磷酸调的酸性水，其pH为3.5～6.0；优选地，pH为4.0～4.5；更优选地，pH为4.0。
5.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料颗粒度为3～5μm。
6.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述检测波长为210～280nm；优选地，检测波长为230nm。
7.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的检测温度为25～30℃；优选地，柱温为30℃。
8.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为67％～62％，33％～38％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为27％～22％，73％～78％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％～95％，0％～5％。
9.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为65％～62％，35％～38％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为25％～22％，75％～78％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％。
10.根据权利要求1所述的HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于所述的梯度洗脱条件如下：
0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为62％，38％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为22％，78％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
或，0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为67％，33％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为27％，73％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为100％，0％；
或，0min，流动相A与流动相B的体积分数分别为95％，5％；
7min，流动相A与流动相B的体积分数分别为57％，43％；
40min～50min，流动相A与流动相B的体积分数分别为17％，83％；
50.1min～60min，流动相A与流动相B的体积分数分别为95％，5％。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113933441A (zh) * 2021-09-30 2022-01-14 无锡紫杉药业有限公司 一种卡巴他赛及其中间体的测定方法

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