CN113358790B

CN113358790B - 一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法

Info

Publication number: CN113358790B
Application number: CN202110649509.9A
Authority: CN
Inventors: 白培锋; 王海军; 刘少华; 侯朋娟; 赵学刚; 张莉; 孔德甲; 张圆圆; 赵翠莲; 祁锁园
Original assignee: Hebei Jiamai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hubei Kelaiwei Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2021-06-10
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-06-10
Also published as: CN113358790A

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法。按照下述高效液相色谱条件进行检测：色谱柱：WatersXBridge C18，4.6*150mm，3.5μm；流动相A：体积比为92‑88:8‑12的磷酸盐缓冲液(pH为7.4‑7.6)‑乙腈混合溶液，流动相B：体积比为32‑28:68‑72的磷酸盐缓冲液(pH为7.4‑7.6)‑乙腈混合溶液；检测波长286‑300nm，柱温33‑37℃，梯度洗脱。本发明提供的检测方法，能够实现尼麦角林及其制剂中的14种杂质和主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测尼麦角林及其制剂中杂质情况，检出的杂质种类、数量均高于现有方法。

Description

一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法。

背景技术

尼麦角林(Nicergoline)为半合成麦角碱衍生物，具有α-受体阻滞作用和血管扩张作用，可加强脑部蛋白质的合成，能有效地改善记忆和学习能力，从而快速有效地改善大脑衰退的症状。临床上尼麦角林主要用于治疗血管性痴呆和改善脑梗塞后遗症引起的意欲低下和情感障碍，其以独特的疗效得到了广泛的应用。

目前，尼麦角林手性异构体杂质的分析方法只有检测非对映异构体F的相关报道，未见非对映异构体M和N的相关报道。同时，尼麦角林原料中还有其他杂质(杂质A、B、C、D、E、G、H、I、K、O、Q)等众多杂质的存在，也会影响手性异构体的分离及准确定量。因此，同时检测尼麦角林中的三种手性异构体以及众多其他杂质存在较大的困难。而且，若不能有效控制尼麦角林异构体和各杂质的含量，会影响尼麦角林的药理活性，给患者带来用药安全隐患。

在现行欧洲药典EP10.2、日本药典JP17和国家标准(WS₁-XG-017-2020)中的尼麦角林有关物质的检测方法条件下，非对映异构体M均是与尼麦角林主成分的峰重合的，非对映异构体F、N与杂质G、O、Q不能达到基线分离。同时，现行欧洲药典中的检测方法需要采用离子对试剂作为流动相，现行国家标准需要采用阳离子交换树脂和反相C18杂化为填料的特殊色谱柱。因此，有必要研发一种操作简便、能够将尼麦角林原料或其药物制剂中的主成分与其杂质间进行有效分离，并尽可能多的检测出其含有的杂质，对于提高尼麦角林产品的质量以及提高患者用药安全性具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有尼麦角林的检测方法不能将其中的手性异构体及其他杂质有效分离的问题，本发明提供一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：

色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm*150mm，3.5μm；

流动相A：体积比为92-88:8-12的磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4-7.6；

流动相B：体积比为32-28:68-72的磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4-7.6；

柱温：33-37℃；

检测波长：286-300nm；

梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

3min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

25min，50％流动相A，50％流动相B；

40min，20％流动相A，80％流动相B；

45min，0％流动相A，100％流动相B；

55min，0％流动相A，100％流动相B。

相对于现有技术，本发明提供的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，采用Waters XBridge C18，4.6mm*150mm，3.5μm色谱柱，通过特定的流动相，以特定的梯度洗脱方式实现了尼麦角林及其制剂中的3种非对映异构体(杂质F、杂质M和杂质N)、以及多个其他杂质(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质H、杂质I、杂质K、杂质O和杂质Q)与尼麦角林主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测尼麦角林及其制剂中的杂质情况，检出的杂质种类、数量均高于现有检测方法。且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，与现有技术相比，无需采用特殊的流动相和色谱柱，能够用更为简便的方法实现对尼麦角林及其制剂中更多杂质的定性和定量检测，从而为提高和更好地控制尼麦角林药品的质量提供有效保障。

本发明中所述尼麦角林制剂包括但不限于尼麦角林片、尼麦角林注射液、尼麦角林胶囊和注射用尼麦角林等制剂。检测尼麦角林制剂中有关物质时，按照本领域常规的方法将尼麦角林制剂溶解、过滤制成供试品溶液即可。

尼麦角林的结构式如下：

已有文献证明，尼麦角林的6a位手性中心是发酵得到的单一构型的天然产物母环带来的，因此，尼麦角林在实际生产工艺过程中不会产生对映异构体。本发明中有关物质是指在尼麦角林的合成工艺中引入的或降解生成的非对映异构体和其他杂质，具体包括包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O和杂质Q，各已知杂质的结构式下所示。

可选的，检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。

优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

3min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

25min，50％流动相A，50％流动相B；

40min，20％流动相A，80％流动相B；

45min，0％流动相A，100％流动相B；

55min，0％流动相A，100％流动相B；

55.1min，70％流动相A，30％流动相B；

60min，70％流动相A，30％流动相B。

优选的梯度洗脱顺序，可以提高主成分与杂质峰之间的分离度和检测的灵敏度，使检测结果定量准确，且精密度高。

优选的，流动相A和流动相B中，所述磷酸盐缓冲液均为浓度9-11mmol/L的磷酸二氢钾水溶液，用三乙胺调节pH为7.4-7.6。

进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.5。

优选的流动相的pH值，可以减少谱带拖尾，改善峰形，从而有利于提高各组分之间的分离度。

优选的，流动相A中，所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为90:10。

优选的，流动相B中，所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为30:70。

优选的流动相在不产生基线干扰的前提下，能够更好地分离尼麦角林及其制剂中的杂质，利于有关物质的检出，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

优选的，检测波长为288nm。

优选的，柱温为35℃。

优选的，流速为0.9-1.1mL/min。

进一步优选的，流速为1.0mL/min。

优选的，进样体积为5μL。

优选的检测条件可使尼麦角林及其制剂中的非对映异构体之间，以及其他已知杂质之间达到更高的分离度，可以保证各种杂质的有效检出，从而达到有效准确控制尼麦角林原料及制剂中有关物质含量的目的。

优选的，供试品溶液的制备方法为：取尼麦角林或其制剂用溶剂配制成以尼麦角林计，浓度为1-3mg/mL的供试品溶液。

进一步优选的，以尼麦角林计，所述供试品溶液的浓度为2mg/mL。

优选的供试品浓度有利于使主成分及杂质的峰形更好，柱效高，积分更准确，从而有利于对供试品中杂质的含量进行更准确的计算。

优选的，系统适用性溶液的制备方法为：将杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q和尼麦角林对照品用溶剂配成每1mL含尼麦角林2mg和各杂质均为10μg的溶液，作为系统适用性1溶液；

取尼麦角林系统适用性对照品2(杂质I定位用，货号EP-Y0001362)1支，加溶剂0.5mL溶解，作为系统适用性2溶液。

可选的，所述溶剂为乙腈。

本发明提供的检测方法，能够实现尼麦角林及其制剂中的14种已知杂质和主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测尼麦角林及其制剂中杂质情况，检出的杂质种类、数量均高于现有方法，具有较高的实用价值。

附图说明

图1为使用欧洲药典EP10.2方法检测系统适用性3溶液的色谱图；

图2为使用日本药典JP17方法检测系统适用性3溶液的色谱图；

图3为使用国家标准WS₁-XG-017-2020方法检测系统适用性3溶液的色谱图；

图4为实施例2中系统适用性项下的系统适用性1溶液、系统适用性2溶液和空白溶剂的色谱图；

图5为实施例2中系统适用性项下的尼麦角林、杂质M、杂质N和杂质F的定性对照品溶液的色谱图；

图6为对比例1中不同pH流动相测试所得的色谱图；

图7为对比例2中不同柱温条件下测试所得的色谱图；

图8为对比例3中不同色谱柱测试所得的色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1溶液的配制

(1)空白溶剂：乙腈。

(2)系统适用性1溶液：精密量取将将杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q和尼麦角林对照品各适量，用乙腈配成每1mL含尼麦角林2mg和各杂质均为10μg的溶液，作为系统适用性1溶液。

(3)系统适用性2溶液：取尼麦角林系统适用性对照品2(EP杂质I定位用，货号EP-Y0001362)1支，加乙腈0.5mL溶解摇匀，作为系统适用性2溶液。

(4)系统适用性3溶液：精密量取将将杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、和尼麦角林对照品各适量，用乙腈配成每1mL含尼麦角林2mg和各杂质均为10μg的溶液，作为系统适用性3溶液。

(5)称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q各约10mg，分别加乙腈溶解并稀释制成每1mL含各组分2.0μg的溶液，作为各定性对照品溶液。

(6)供试品溶液：精密称取尼麦角林供试品适量，加乙腈溶解并稀释制成以尼麦角林计，浓度为2mg/mL的供试品溶液。

1.2色谱条件的确定

在实验前期我们参照欧洲药典EP10.2标准、日本药典JP17标准、国家标准(WS₁-XG-017-2020)对非对映异构体(杂质F、杂质M和杂质N)和尼麦角林进行检测，发现三种方法非对映异构体杂质M皆不能和尼麦角林完全分离，非对映异构体F和N与其他杂质重合。即现有三种标准均无法实现三种非对映异构体的有效检测。采用上述标准进行检测时采用的是系统适用性3溶液。

其中，EP10.2方法的检测图谱如图1所示，从图中可以看出，杂质M无法实现与尼麦角林的分离，且杂质G、杂质O和杂质N几乎重合，无法达到基线分离。且EP10.2中采用离子对试剂作为流动相，系统耐用性不佳。

JP17方法的检测图谱如图2所示，从图中可以看出，杂质E和杂质H之间、杂质A和杂质M之间无法实现基线分离，杂质G、杂质O和杂质N有两个杂质峰重合。

国家标准(WS₁-XG-017-2020)的检测图谱如图3所示，从图中可以看出，杂质M和杂质H与尼麦角林主峰重合，同时杂质F与尼麦角林分离效果不佳。

在上述三种方法的基础上经过多次调整色谱条件皆不能实现所有杂质的基线分离。发明人经过创造性地选择流动相、梯度洗脱程度以及色谱柱，并控制特定的柱温实现了尼麦角林中14种杂质的有效分离。

尼麦角林及其制剂的有关物质的检测方法：

色谱柱：Waters XBridge C18，4.6*150mm，3.5μm；

流动相A：10mmol/L磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调节pH至7.5)-乙腈(90：10)；

流动相B：10mmol/L磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调节pH至7.5)-乙腈(30：70)；

检测波长：288nm

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

梯度洗脱，洗脱程序如下：

实施例2

方法学验证：

2.1系统适用性

取空白溶剂(乙腈)、上述系统适用性1溶液、系统适用性2溶液和各定性对照品溶液各5μL，按照上述条件进行高效液相色谱检测，记录色谱图，色谱图如图4-图5所示，结果如表1所示。

表1系统适用性试验结果

试验结果表明，本检测方法专属性强，分离度好，不仅能有效分离尼麦角林的3个非对映异构体(杂质M、杂质N和杂质F)，还能对其他11个杂质(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质G、杂质H、杂质I、杂质K、杂质O和杂质Q)同时进行分离和检测，满足基线分离的要求。

2.2线性范围、检测限和定量限

精密称取杂质对照品(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q)和尼麦角林适量，加乙腈溶解稀释制成系列浓度溶液，作为线性关系测定供试品溶液。取上述线性最低水平的溶液作为定量限溶液。精密量取上述定量限溶液3mL，置于10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。参照实施例1的色谱条件分别精密量取5μL注入液相色谱仪，记录色谱图。分别计算各组分的线性回归方程和校正因子，结果见表2和表3。

表2各组分的线性回归方程和校正因子

表3各组分的定量限和检测限

结果表明，各杂质的色谱峰面积与各自的进样浓度呈良好的线性关系，除了杂质D和杂质O(非特定杂质)，各杂质的校正因子皆在0.8～1.2之间，参照EP10.2药典标准及ICHQ3A相关报告限、鉴定限和质控限的规定，除杂质D采用外标法计算含量外各杂质按照主成分自身对照法计算各杂质含量。

2.3准确度

精密称取杂质对照品(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q)各适量，分别加乙腈稀释定容，得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q的浓度分别约为0.10mg/mL，0.16mg/mL，0.04mg/mL，0.04mg/mL，0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.02mg/mL，0.06mg/mL，0.02mg/mL，0.02mg/mL，0.02mg/mL，0.02mg/mL，0.02mg/mL的溶液，作为各杂质对照品贮备液1；

精密量取各杂质对照品贮备液1各1mL，分别置于10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为各杂质对照品溶液。

称取三份尼麦角林供试品约40mg，分别置于3个20ml容量瓶中，然后分别向各容量瓶中加入各杂质对照品储备液1各1mL、2mL、3mL后，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为回收率测定溶液，每个水平平行配制3份。

精密量取上述各浓度水平的回收率测定溶液1mL，置于50mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，定容摇匀；精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀制成每1mL约含4μg的溶液，作为回收率测定对照溶液。

称取尼麦角林供试品约40mg，置20mL量瓶中，加乙腈溶解稀释至刻度摇匀，作为供试品溶液。精密量取上述供试品溶液1mL，置50mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀；取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，加乙腈稀释稀释至刻度摇匀制成每1mL约含4μg的溶液，作为对照溶液。

参照实施例1的色谱条件分别精密量取5μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法及自身对照加校正因子法分别以峰面积计算回收率，结果见表4。

表4各组分的回收率

结果表明，各杂质按外标法及主成分自身对照加校正因子法计算，回收率均在90％-110％范围内，RSD均小于5.0％，同时两种计算方法所测定结果基本一致，各杂质平均回收率两种算法的二者差值在5.0％以内，拟定方法回收率良好，方法准确率高。

2.4耐用性

参照实施例1色谱条件，调节流动相起始比例、调节流动相pH值、色谱柱控制温度、流速、检测波长、流动相缓冲液浓度、流动相A不同比例和流动相B不同比例，分别对系统适用性溶液进行高效液相色谱分析，结果见表5-表12。

表5流动相起始比例对各组分分离效果的影响

表6流动相pH值对各组分分离效果的影响

表7色谱柱温度对各组分分离效果的影响

表8流速对各组分分离效果的影响

表9波长对各组分分离效果的影响

表10磷酸盐缓冲液浓度对各组分分离效果的影响

表11流动相A配制比例对各组分分离效果的影响

表12流动相B配制比例对各组分分离效果的影响

结果表明，随着起始流动相比例变化、流速变化和波长变化，各组分相对保留时间和分离度变化不大；流动相pH值会影响杂质E和H、杂质G和O分离度；色谱柱温度影响杂质G和O分离度。流动相A和流动相B中采用本发明限定的其他比例的磷酸二氢钾与乙腈作为流动相以及磷酸二氢钾缓冲液不同浓度条件下，也均可实现尼麦角林及其制剂中上述14种杂质的有效分离。拟定的不同条件下整体分离效果良好，各杂质和尼麦角林之间以及各杂质之间皆能达到基线分离，方法耐用性良好。

对比例1

本对比例提供的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是调节流动相A和流动相B中磷酸氢二钾水溶液的pH为7.0和8.0。取实施例1制备的系统适用性3溶液进样检测，结果对比图如图6所示。

从图中可以看出，流动相pH值主要影响杂质E和H的分离，杂质M、G、O、N和F的分离。其中pH值7.0时，杂质E和H可以分离，但是杂质O、N和F无法分离；pH值8.0时，杂质M和尼麦角林主峰重合，同时杂质G和杂质O无法分离；pH7.5条件下能实现所有杂质的基线分离。

对比例2

本对比例提供的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是调节色谱柱的柱温为30℃和40℃。取实施例1制备的系统适用性3溶液进样检测，结果对比图如图7所示。其中，杂质M峰后依次为杂质G、杂质O、杂质N和杂质F的峰，柱温35℃和柱温30℃未标示出这四个杂质峰。

从图中可以看出，色谱柱柱温为40℃时，杂质E和H之间以及杂质G和O之间分离度变差；柱温为30℃时，杂质N和F之间分离度变差。

对比例3

本对比例提供的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是调节色谱柱的型号为：

色谱柱1：大阪曹达MGII C18(4.6*250mm，5μm)

色谱柱2：大阪曹达MGII C18(4.6*150mm，3μm)

色谱柱3：Waters Symmetry C18(4.6*150mm，3.5μm)

本发明选用的Waters XBridge C18，4.6*150mm，3.5μm，记为色谱柱4。

取实施例1制备的系统适用性3溶液进样检测，检测结果的对比图如图8所示。不同厂家色谱柱对杂质E和H以及杂质G和O分离效果不同，其中只有Waters Xbridge C18(4.6*150mm，3.5μm)对所有杂质分离最佳，其他色谱柱无法实现所有杂质基线分离。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，所述有关物质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质K、杂质M、杂质N、杂质O和杂质Q，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：

色谱柱：Waters XBridge C18，4.6mm*150mm，3.5μm；

流动相A：体积比为92-88:8-12的磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液；

流动相B：体积比为32-28:68-72的磷酸盐缓冲液-乙腈混合溶液；

流动相A和流动相B中，所述磷酸盐缓冲液均为浓度9-11mmol/L的磷酸二氢钾水溶液，用三乙胺调节pH为7.4-7.5；

柱温：33-35℃；

检测波长：286-300nm；

梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，65%-75%流动相A，35%-25%流动相B；

3min，65%-75%流动相A，35%-25%流动相B；

25min，50%流动相A，50%流动相B；

40min，20%流动相A，80%流动相B；

45min，0%流动相A，100%流动相B；

55min，0%流动相A，100%流动相B；

其中，杂质K、杂质M、杂质N、杂质O和杂质Q的结构如下：

。

2.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.5。

3.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，流动相A中，所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为90:10。

4.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，流动相B中，所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为30:70。

5.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，检测波长为288nm。

6.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，柱温为35℃。

7.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，流速为1.0mL/min。

8.如权利要求1所述的尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法，其特征在于，进样体积为5µL。