CN116930370B - 一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法，包括步骤：1)取对乙酰氨基酚或含对乙酰氨基酚的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为10‑100mg/ml的试样溶液；取对氯苯胺，加稀释剂溶解，得到对照品溶液；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8‑1.5ml，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱；4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照品溶液，进样量为5‑100μl，利用220‑300nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中对氯苯胺的测定。本发明操作简单、方便，可有效分离测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的含量，有效控制对乙酰氨基酚及其制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法。
背景技术
对乙酰氨基酚，又称扑热息痛，化学名为4-Acetamidophenol，呈白色粉末状。对乙酰氨基酚可以通过抑制下丘脑体温调节中枢前列腺合成酶，来减少前列腺素PGE1、缓激肽和组胺的合成和释放。通过神经调节引起外周血管扩张、出汗，来达到解热的作用。
扑热息痛生产过程中，在某些特定条件下有可能形成对氯苯胺这个基因毒性杂质。根据已有临床研究发现这类杂质中与苯环相连的氮原子经代谢活化，易生成稳定的氮正离子，能与DNA结构中的亲核活性基团发生反应，因此具有致突变性。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，对氯苯胺在2B类致癌物清单中，ICH M7指南(评估和控制药品中DNA反应性/诱变性杂质以限制潜在致癌风险)附录所规定的可接受摄入量(API)--34μg/天。
因此控制扑热息痛中该类杂质的毒理学关注阈值(TTC)水平非常重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法，其操作简单、方便，可有效分离测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的含量，有效控制对乙酰氨基酚及其制剂的质量。
本发明的技术方案是：一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法，包括以下步骤：
1)配制试样溶液
取对乙酰氨基酚或含对乙酰氨基酚的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为10-100mg/ml的试样溶液；
2)配制对照品溶液
取对氯苯胺，加稀释剂溶解，得到浓度为0.0375μg/ml的对照品溶液；
3)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8-1.5ml，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；
4)分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1)试样溶液、步骤2)对照品溶液，进样量为5-100μl，利用220-300nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中对氯苯胺的测定。
优选的，步骤1)、步骤2)所述稀释剂为水和乙腈的混合物，水和乙腈的体积为1：4。
进一步的，步骤3)所述色谱柱采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱或AgilentZorbax SB-C18色谱柱或YMC-Pack ODS-AQ色谱柱。
优选的，步骤3)流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积分数为90％，流动相B的体积百分数为10％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至30％，流动相B的体积分数线性增加至70％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至90％，流动相B的体积分数线性减少至10％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为90％，流动相B的体积百分数为10％。
优选的，步骤4)进样量为50μl，利用247nm波长检测，色谱柱的柱温为30-40℃。
优选的，色谱柱的柱温为35℃。
采用上述技术方案具有以下有益效果：
1、发明测定方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以水为流动相A，乙腈为流动相B，能够有效的分离检测对乙酰氨基酚及对氯苯胺。选用水与乙腈混合液作为稀释剂溶解样品、对照品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂效应。采用梯度洗脱方式调整流动相A、流动相B的体积比，确保能够使乙酰氨基酚及对氯苯胺得到有效分离。若流动相A、流动相B的体积比不以梯度调整，则会导致主峰与异构体杂质峰分离度差甚至无法分离。
2、本发明测定方法采用外标法计算对氯苯胺杂质含量，精度极高，对氯苯胺相对供试品溶液检测限为0.0000204％，表明大于0.0000204％杂质均能被检出。
3、本发明测定方法使用的流动相A及流动相B配制简单、方便，所用试剂均为常见试剂，经济实惠，且对氯苯胺能与其它杂质达到有效分离，准确测定杂质。目标杂质峰形较好，柱效较高，方法运行时间合适，保证对乙酰氨基酚及其制剂的质量。
下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。
附图说明
图1为乙腈-水的混合溶液色谱图；
图2为对氯苯胺定位容色色谱图；
图3为混合溶液色谱图；
图4为对氯苯胺线性关系图；
图5为对乙酰氨基酚中对氯苯胺定量限色谱图；
图6为对乙酰氨基酚中对氯苯胺定量限色谱图。
具体实施方式
本发明中，使用的试剂如下表：
实施例1
高效液相色谱仪选用Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以Agilent ZORBAX SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)为分离色谱柱；紫外检测波长：247nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样体积：50μl；以水为流动相A，乙腈为流动相B进行线性梯度洗脱。梯度洗脱方式：0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
对照品贮备液的配制：取对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加乙腈使之溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置于100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
对照品溶液的配制：精密量取对照品贮备液1.5ml，置于10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
混合溶液的配制：取对乙酰氨基酚0.5g，置于10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)使之溶解，精密加入对照品贮备液1.5ml，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。混合溶液的溶质中，对乙酰氨基酚的浓度为50mg/ml，对氯苯胺的浓度为0.0375μg/ml。
分别取乙腈-水(体积比80:20)、对照品溶液、混合溶液，按上述色谱条件进样检测。记录色谱图，结果如图1、图2、图3所示。
图1表明，乙腈-水的混合溶液不干扰测试。
图2表明，对氯苯胺在此色谱条件中保留时间约为13.5min。
实施例2
高效液相色谱仪选用Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以Agilent ZORBAX SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)为分离色谱柱；紫外检测波长：247nm；柱温：35℃；流速：0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min；进样体积：50μl；以水为流动相A，乙腈为流动相B进行线性梯度洗脱。梯度洗脱方式：0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
分别取实施例1中的混合溶液、对照品溶液及乙腈-水(体积比80:20)注入色谱仪，记录色谱图。结果如下表所示：
结论：随着流速增大，目标峰面积减小，综合考虑，流速选择1.0ml/min为最佳。
实施例3
高效液相色谱仪选用Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以Agilent ZORBAX SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)为分离色谱柱；紫外检测波长：247nm；柱温：30℃、35℃、40℃；流速：1.0ml/min；进样体积：50μl；以水为流动相A，乙腈为流动相B进行线性梯度洗脱。梯度洗脱方式：0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
分别取实施例1中的混合溶液、对照品溶液及乙腈-水(体积比80:20)注入色谱仪，记录色谱图。结果如下表所示：
结论：随着柱温增加，混合溶液中目标峰面积减小，综合考虑，柱温选择35℃为最佳。
实施例4
高效液相色谱仪选用Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以Agilent ZORBAX SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)为分离色谱柱；紫外检测波长：247nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样体积：50μl；以水为流动相A，乙腈为流动相B进行线性梯度洗脱。
梯度洗脱方式1：0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
梯度洗脱方式2：0分钟，流动相A的体积分数为75-90％，流动相B的体积百分数为10-25％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
梯度洗脱方式3：0分钟，流动相A的体积分数为90-98％，流动相B的体积百分数为2-10％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
梯度洗脱方式4：流动相A-流动相B(10-90)，等度洗脱60min。
分别取实施例1中的混合溶液、对照品溶液及乙腈-水(体积比80:20)注入色谱仪，记录色谱图。结果如下表所示：
结论：梯度改变，影响目标峰检测，综合考虑，选择洗脱梯度1最佳。
实施例5
专属性考察
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：高效液相色谱仪选用Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站，设置为自动进样。以Agilent ZORBAX SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)为分离色谱柱；紫外检测波长：247nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样体积：50μl；以水为流动相A，乙腈为流动相B进行线性梯度洗脱。梯度洗脱方式流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40％，流动相B的体积分数线性增加至60-80％；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95％，流动相B的体积分数线性减少至5-20％；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95％，流动相B的体积百分数为5-20％。
对照品贮备液的配制：取对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
对照品溶液的配制：精密量取对氯苯胺杂质贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，作对照品溶液。
混合溶液的配制：取对乙酰氨基酚0.5g，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)使溶解，精密加入对照品贮备液1.5ml，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，作试样溶液。试验溶液的溶质中，对乙酰氨基酚的浓度为50mg/ml，对氯苯胺的浓度为0.0375μg/ml。
试样溶液的配制：取对乙酰氨基酚0.5g，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。
空白溶液的制备：取乙腈-水(80:20)混合均匀，即得。
样品测定：
取空白溶液、对照品溶液、试样溶液、混合溶液各50μl，注入色谱仪并记录色谱图。
结论：
空白不影响目标杂质的检测；试样溶液色谱图中未检出；混合溶液色谱图中与相邻杂质峰分离度>1.5，该方法专属性好。
实施例6
精密度考察
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：参照实施例5中专属性考察。
空白溶液的制备：取乙腈-水(80:20)混合均匀，即得。
对照品贮备液溶液的配制：取杂质对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
对照品溶液的配制：精密量取对氯苯胺杂质贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，作对照品溶液。
混合溶液的配制：取对乙酰氨基酚0.5g，平行6份，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80：20)使溶解，精密加入对氯苯胺杂质贮备液1.5ml，加乙腈-水(80：20)稀释至刻度，摇匀，作混合溶液。混合溶液的溶质中，对乙酰氨基酚的浓度为50mg/ml，对氯苯胺的浓度为0.0375μg/ml。
样品测定：
取空白溶液、对照品溶液、混合溶液各50μl，注入色谱仪并记录色谱图。
结论：
对氯苯胺测定6次保留时间RSD为0.97％，峰面积RSD为6.43％。
加入对照品溶液后，平行测定6次对氯苯胺按外标法以峰面积计算含量，含量平均值为0.000080％，含量RSD为5.99％，含量RSD小于10％，其精密度良好。
实施例7
线性关系考察
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：参照实施例5中专属性考察。
线性贮备液的制备：取杂质对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得线性贮备液。
线性1#：精密量取线性4#溶液5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
线性2#：精密量取线性贮备液0.8ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
线性3#：精密量取线性贮备液1.2ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
线性4#：精密量取线性贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
线性5#：精密量取线性贮备液1.8ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
线性6#：精密量取线性贮备液3.0ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
样品测定：
分别精密量取上述供试品溶液50μl注入色谱仪，记录色谱图，如图4所示。
结论：
在0.0188ug/ml～0.075ug/ml浓度范围内，对氯苯胺的峰面积与浓度间呈现较好的线性关系，C＝0.0045A-0.0014，相关系数R2＝0.9920。
实施例8
检测限与定量限考察
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：参照实施例5中专属性考察。
对照品贮备液的制备：取杂质对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
定量限确认溶液的制备：精密量取对照品贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，在精密量取5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限确认溶液的制备：精密量取定量限确认溶液5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
样品测定：
分别精密量取上述供试品溶液50μl注入色谱仪，记录色谱图，按S/N＝3确认检测限、S/N＝10确认定量限，如图5、图6所示。
结果：
检测限试验结果：
定量限限试验结果：
结论：
连续进样6针，定量限浓度峰面积RSD为6.53％，该方法灵敏度高。
实施例9
准确度考察
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：参照实施例5中专属性考察。
对照品贮备液的制备：取杂质对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
120％水平对照品溶液：精密量取对照品贮备液1.8ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
100％水平对照品溶液：精密量取对照品贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
80％水平对照品溶液：精密量取对照品贮备液1.2ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
基底溶液：取对乙酰氨基酚约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)是溶解并稀释至刻度，摇匀，即得基底溶液。
120％水平的回收率溶液：取对乙酰氨基酚0.5g，精密称定，平行6份，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)适量使溶解，在精密加入对照品贮备液1.8ml，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
100％水平对照品溶液：取对乙酰氨基酚0.5g，精密称定，平行6份，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)适量使溶解，在精密加入对照品贮备液1.5ml，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
80％水平对照品溶液：取对乙酰氨基酚0.5g，精密称定，平行6份，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)适量使溶解，在精密加入对照品贮备液1.2ml，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
样品测定：
分别精密量取上述供试品溶液50μl注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率。
结果；
结论：对氯苯胺三个水平的平均回收率为101.91％，RSD为9.24％，准确度好
实施例10
样品测定：
仪器与试剂
仪器：安捷伦高效液相色谱仪VWD检测器
试剂：水、乙腈
色谱条件：参照实施例5中专属性考察。
对照品贮备液的制备：取杂质对氯苯胺约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置100ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀；在精密量取1ml，置50ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。
对照品溶的制备：精密量取线性贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀，即得。
试样溶液的制备：取对乙酰氨基酚约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈-水(80:20)是溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
样品测定：
分别精密量取上述试样溶液50μl注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对氯苯胺含量。
结果：
样品测定结果
| 批号 | 对氯苯胺检出量(％) |
| 22506 | 未检出 |
| 22504 | 未检出 |
| 22503 | 未检出 |
Claims (5)
1.一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配制试样溶液
取对乙酰氨基酚或含对乙酰氨基酚的制剂，加稀释剂溶解，得到浓度为10-100mg/ml的试样溶液，稀释剂为水和乙腈的混合物，水和乙腈的体积为1：4；
配制对照品溶液
取对氯苯胺，加稀释剂溶解，得到浓度为0.0375μg/ml的对照品溶液，稀释剂为水和乙腈的混合物，水和乙腈的体积为1：4；
采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，设置流动相的流速为0.8-1.5ml，所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积分数为80-95%，流动相B的体积百分数为5-20%；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至20-40%，流动相B的体积分数线性增加至60-80%；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至80-95%，流动相B的体积分数线性减少至5-20%；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为80-95%，流动相B的体积百分数为5-20%；
4）分别向高效液相色谱仪进样等体积的步骤1）试样溶液、步骤2）对照品溶液，进样量为5-100μl，利用220-300nm波长检测，记录色谱图，完成试样溶液中对氯苯胺的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述色谱柱采用Agilent EclipsePlus C18色谱柱或Agilent Zorbax SB-C18色谱柱或YMC-Pack ODS-AQ色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）流动相采用梯度洗脱方式进入色谱柱，0分钟，流动相A的体积分数为90%，流动相B的体积百分数为10%；0分钟至20分钟，流动相A的体积分数线性减少至30%，流动相B的体积分数线性增加至70%；20分钟至21分钟，流动相A的体积分数线性增加至90%，流动相B的体积分数线性减少至10%；21分钟至30分钟，流动相A的体积百分数为90%，流动相B的体积百分数为10%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）进样量为50μl，利用247nm波长检测，色谱柱的柱温为30-40℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为35℃。
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| GR01 | Patent grant | ||
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