CN116930363A - 恩扎卢胺sm1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法 - Google Patents

恩扎卢胺sm1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种恩扎卢胺SM1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法。本发明以十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂为色谱柱，以体积百分数为0.05％的三氟乙酸水溶液和乙腈为流动相，通过线性梯度洗脱对恩扎卢胺SM1、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d和杂质SM1e进行分离，并采用检测波长为235nm的紫外检测器进行含量检测。本发明方法可在35分钟内实现恩扎卢胺SM1及其相关杂质定量检测，具有专属性强、灵敏度高、检测限低、重现性好、经济、耐用的特点。

Description

恩扎卢胺SM1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种恩扎卢胺SM1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法。
背景技术
恩扎卢胺(enzalutamide)是一种雄激素受体抑制剂，主要用于治疗晚期去势耐受前列腺癌的治疗，可有效延长患者生存期。恩扎卢胺能够竞争性地抑制雄激素与受体的结合，且能抑制雄激素受体的核转运以及该受体与DNA的相互作用。恩扎卢胺SM1作为合成恩扎卢胺关键起始物料，需严格控制其杂质水平。恩扎卢胺SM1的结构式如式Ⅰ所示。
经研究发现，恩扎卢胺SM1中可能存在如下杂质：杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e和其他单个杂质。上述杂质均为有机杂质，无警示结构，根据ICHQ3A(R2)要求均需控制到安全水平一下(杂质SM1a≤0.2％、杂质SM1b≤0.15％、杂质SM1c≤0.15％、杂质SM1d≤0.15％、杂质SM1e≤0.1％和其他单个杂质≤0.5％)，以保证恩扎卢胺SM1纯度。并且，杂质SM1a、杂质SM1e在生产工艺过程仍有衍生杂质的产生，会影响恩扎卢胺原料药杂质水平。然而恩扎卢胺SM1分析方法在各国药典均无收载，目前暂无法定分析方法及文献可将恩扎卢胺SM1中5个已知杂质及其他单个杂质和主峰进行分离。
现有技术中，公开号为CN106153772B的发明专利公开了一种运用高效液相色谱检测恩杂鲁胺有关物质的方法，以五氟苯基键合硅胶为固定相，采用酸溶液-有机相为流动相并进行梯度洗脱，公开了流动相可为三氟乙酸溶液与乙腈。然而该方法无法分离恩扎卢胺SM1、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d和杂质SM1e。
有鉴于此，本发明通过筛选色谱柱和色谱条件，建立了一种高效液相色谱法，该液相分析方法能满足上述杂质的分离度、灵敏度，能确保各杂质出峰峰型对称且无溶剂效应。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种利用反相高效液相色谱法分离恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，该方法可以同时分离杂质SM1b、杂质SM1e、恩扎卢胺SM1、杂质SM1c、杂质SM1a和杂质SM1d，为恩扎卢胺SM1及其相关杂质的定性和定量提供了支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用反相高效液相色谱法分离恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，所述相关杂质包括杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e中的任一种或多种；所述恩扎卢胺SM1的结构式如式Ⅰ所示，所述杂质SM1a的结构式如式Ⅱ所示，所述杂质SM1b的结构式如式Ⅲ所示，所述杂质SM1c的结构式如式Ⅳ所示，所述杂质SM1d的结构式如式Ⅴ所示，所述杂质SM1e的结构式如式Ⅵ所示；所述反相高效液相色谱法是采用十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，以流动相A和流动相B作为流动相，所述流动相A为三氟乙酸水溶液，所述流动相B为有机溶剂；通过梯度洗脱依次将杂质SM1b、杂质SM1e、恩扎卢胺SM1、杂质SM1c、杂质SM1a、杂质SM1d进行分离；
可以根据各组分的分离快慢对其进行定性。
所述梯度洗脱的程序为：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为58-62：42-38；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在25分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；
在26分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40。
作为优选，所述梯度洗脱的程序为：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在25分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；
在26分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40。
进一步，所述有机溶剂为乙腈；所述三氟乙酸水溶液的体积百分数为0.05％。
进一步，所述流动相的流速为0.8ml/min-1.2ml/min，优选为1.0ml/min；所述色谱柱的柱温为28℃-32℃，优选为30℃。
作为优选，所述色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。
作为优选，进样体积10μl。
本发明的目的之二在于提供一种基于前述分离方法定性鉴别恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，该方法可以实现恩扎卢胺SM1及其相关杂质的快速有效鉴别。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于前述方法定性鉴别恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，采用前述方法将所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质分离后，采用紫外检测器进行检测；所述紫外检测器的检测波长为235nm。
进一步，保留时间由短到长依次为：杂质SM1b、杂质SM1e、恩扎卢胺SM1、杂质SM1c、杂质SM1a、杂质SM1d。
根据保留时间的长短可以对六组分进行定性。
作为优选的技术方案，所述流动相A为体积百分数为0.05％的三氟乙酸水溶液，所述流动相B为乙腈；所述流动相的流速为1.0ml/min；所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm；所述色谱柱的柱温为30℃；检测波长为235nm；
按照如下洗脱程序进行梯度洗脱并得到色谱图：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在25分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；
在26分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40。
进一步，保留时间在6.6±0.5min的为杂质SM1b；保留时间在7.4±0.5min的为杂质SM1e；保留时间在8.7±0.5min的为恩扎卢胺SM1；保留时间在11.0±0.5min的为杂质SM1c；保留时间在11.8±0.5min的为杂质SM1a；保留时间在12.5±0.5min的为杂质SM1d。
本发明的目的之三在于提供一种检测恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量的方法，该方法可在35分钟内或大于35分钟的时间实现恩扎卢胺SM1及其相关杂质定量检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
检测恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量的方法，包括以下步骤：
(1)分离：采用前述分离恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法分离所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质；
(2)检测：采用前述定性鉴别恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法对所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质进行检测，并获得色谱图；
(3)含量计算：根据步骤(2)得到的色谱图，采用乘以校正因子的主成分自身对照法利用峰面积计算所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量。
进一步，分离前，以乙腈水溶液为溶剂配制待测溶液；所述溶剂中，乙腈和水的体积比为70：30。
进一步，根据检测出的峰面积计算恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量，具体包括以下步骤：
1.配置待测样品溶液：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成浓度约为0.5mg/ml的溶液，作为待测样品溶液。
2.配置对照溶液：精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
3.检测：精密量取供试品溶液、对照溶液，如10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；然后采用乘以校正因子的主成分自身对照法利用峰面积计算各杂质含量。
进一步，杂质含量计算公式如下：
杂质含量:
式中：W为各杂质含量；
A杂质为各杂质峰面积；
A对照为对照溶液峰面积。
进一步，所述杂质SM1b的校正因子为1.0，杂质SM1e的校正因子为1.0，杂质SM1c的校正因子为1.6，杂质SM1a的校正因子为1.0，杂质SM1d的校正因子为1.0。
进一步，所述杂质SM1b的检测限为0.097μg/ml，所述杂质SM1e的检测限为0.104μg/ml，所述恩扎卢胺SM1的检测限为0.103μg/ml，所述杂质SM1c的检测限为0.110μg/ml，所述杂质SM1a的检测限为0.106μg/ml，所述杂质SM1d的检测限为0.105μg/ml。
本发明的有益效果在于：
1.本发明采用反相HPLC方法通过对色谱柱及流动相的选择，实现了恩扎卢胺SM1、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e和其他单个杂质的有效分离和检测，具有专属性强、灵敏度高、检测限低、重现性好、经济、耐用的特点。
2.本发明的高效液相色谱法，可在35分钟内实现恩扎卢胺SM1及其相关杂质定量检测，时间短，效率高。
附图说明
图1为空白溶液的色谱图；
图2为混合溶液的色谱图；
图3为供试品溶液的色谱图；
图4为检测限溶液的色谱图；
图5为耐用性-正常条件下的色谱图；
图6为耐用性-流速为0.8ml/min条件下的色谱图；
图7为耐用性-流速为1.2ml/min条件下的色谱图；
图8为耐用性-柱温为28℃条件下的色谱图；
图9为耐用性-柱温为32℃条件下的色谱图；
图10为耐用性-流动相初始比例A:B＝38：62条件下的色谱图；
图11为耐用性-流动相初始比例为A:B＝42：58乙腈条件下的色谱图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，供试品溶液、对照溶液以及系统适用性溶液的配制方法如下：
供试品溶液的配制：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液的配制：称取恩扎卢胺SM1系统适用性对照品(含恩扎卢胺SM1、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d及杂质SM1e)适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
本发明实施例中，溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为70：30。
本发明实施例中，0.05％三氟乙酸水溶液的配制方法为：量取水1000ml，加入三氟乙酸0.5ml，即得。
本发明实施例中，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shim-packScepter C18-120 4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，以体积百分数为0.05％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为235nm；进样体积10μl。
表1.梯度洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 60 40
20 60 40
25 20 80
26 60 40
35 60 40
本发明实施例中，含量测定方法为：精密量取供试品溶液、对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，然后按乘以校正因子的主成分自身对照法进行计算。
本发明实施例中，系统适用性要求为：系统适用性溶液色谱图中，主峰与杂质SM1e峰间分离度应符合要求。
本发明实施例中，限度为：供试品溶液色谱图中，除溶剂峰和梯度洗脱峰外，按乘以校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质含量应符合表2的规定，杂质总量不得过2.0％。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.25倍色谱峰忽略不计(0.05％)。
表2.杂质含量要求表
实施例1.专属性
采用本发明的液相系统对杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e及其他单个杂质进行分离并定量检测。
溶剂：乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为70：30。
杂质SM1a贮备溶液：精密称取杂质SM1a 10.629mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1b贮备溶液：精密称取杂质SM1b 10.125mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1c贮备溶液：精密称取杂质SM1c 11.011mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1d贮备溶液：精密称取杂质SM1d 10.590mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1e贮备溶液：精密称取杂质SM1c 10.390mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品贮备溶液：精密量取杂质SM1a贮备溶液2ml，杂质SM1b贮备溶液、杂质SM1c贮备溶液、杂质SM1d贮备溶液各1.5ml，杂质SM1e贮备溶液3ml，置同一100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
各杂质定位溶液：量取上述杂质贮备溶液各0.25ml，分别置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取恩扎卢胺SM1 25.733mg，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
混合溶液：精密称取恩扎卢胺SM1 5.303mg，置10ml量瓶中，精密量取杂质对照品贮备溶液1ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
分别取空白溶液、各杂质定位溶液、混合溶液、供试品溶液各20μl，依法进样，记录色谱图。测定结果如表3、图1-图3所示，图2和图3的积分结果分别如表4和表5所示。结果显示，空白溶剂不干扰样品的检测，主峰与邻近杂质峰间、各已知杂质与邻近杂质峰间分离度均大于1.5，本发明构建的HPLC方法专属性符合要求。
表3.专属性试验测定结果表
表4.图2的积分结果表
表5.图3的积分结果表
实施例2.检测限
线性贮备溶液：精密量取实施例1“专属性”项下杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e杂质贮备溶液各0.5ml、实施例1“专属性”项下供试品溶液1ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取线性贮备液2.5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液4ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
取检测限溶液连续进样3次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。试验结果如表6、和图4所示。其中，杂质SM1b检测限浓度为0.097μg/ml，以样品中存在的浓度表示为0.019％，连续进样3次信噪比均值为28.7；杂质SM1e检测限浓度为0.104μg/ml，以样品中存在的浓度表示为0.021％，连续进样3次信噪比均值为27.2；杂质SM1c检测限浓度为0.110μg/ml，以样品中存在的浓度表示为0.022％，连续进样3次信噪比均值为11.9；杂质SM1a检测限浓度为0.106μg/ml，以样品中存在的浓度表示为0.021％，连续进样3次信噪比均值为19.4；杂质SM1d检测限浓度为0.105μg/ml，以样品中存在的浓度表示为0.021％，连续进样3次信噪比均值为19.2；恩扎卢胺SM1检测限浓度为0.103μg/ml，连续进样3次信噪比均值为22.8；信噪比均符合S/N≥3:1要求。
表6.检测限测定结果
实施例3.耐用性
取混合溶液，分别使用正常流动相，预定测试的不同流动相比例、柱温、柱流速及同一型号不同批次色谱柱进行测试，待仪器系统稳定后分别测试，记录各峰间的分离度、杂质含量、相对保留间。试验结果如表7、表8和图5-图11所示。结果表明，混合溶液在色谱条件微小变化时，各杂质间、杂质与主峰之间的分离度均符合要求，说明本发明建立的分析方法耐用性好。
表7.色谱条件变化耐用性试验测定结果(分离度)
表8.色谱条件变化耐用性试验测定结果(保留时间)

Claims (10)

1.利用反相高效液相色谱法分离恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，其特征在于，所述相关杂质包括杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1c、杂质SM1d、杂质SM1e中的任一种或多种；所述恩扎卢胺SM1的结构式如式Ⅰ所示，所述杂质SM1a的结构式如式Ⅱ所示，所述杂质SM1b的结构式如式Ⅲ所示，所述杂质SM1c的结构式如式Ⅳ所示，所述杂质SM1d的结构式如式Ⅴ所示，所述杂质SM1e的结构式如式Ⅵ所示；所述反相高效液相色谱法是采用十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，以流动相A和流动相B作为流动相，所述流动相A为三氟乙酸水溶液，所述流动相B为有机溶剂；通过梯度洗脱依次将杂质SM1b、杂质SM1e、恩扎卢胺SM1、杂质SM1c、杂质SM1a、杂质SM1d进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为58-62：42-38；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在25分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；
在26分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈；所述三氟乙酸水溶液的体积百分数为0.05％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8ml/min-1.2ml/min，所述色谱柱的柱温为28℃-32℃。
5.基于权利要求1-4任一项所述的方法定性鉴别恩扎卢胺SM1及其相关杂质的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的方法将所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质分离后，采用紫外检测器进行检测；所述紫外检测器的检测波长为235nm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，保留时间由短到长依次为：杂质SM1b、杂质SM1e、恩扎卢胺SM1、杂质SM1c、杂质SM1a、杂质SM1d。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流动相A为体积百分数为0.05％的三氟乙酸水溶液，所述流动相B为乙腈；所述流动相的流速为1.0ml/min；所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm；所述色谱柱的柱温为30℃；检测波长为235nm；
按照如下洗脱程序进行梯度洗脱并得到色谱图：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在25分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；
在26分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40；
在35分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为60：40。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，保留时间在6.6±0.5min的为杂质SM1b；保留时间在7.4±0.5min的为杂质SM1e；保留时间在8.7±0.5min的为恩扎卢胺SM1；保留时间在11.0±0.5min的为杂质SM1c；保留时间在11.8±0.5min的为杂质SM1a；保留时间在12.5±0.5min的为杂质SM1d。
9.检测恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离：采用权利要求1-4任一项所述的方法分离所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质；
(2)检测：采用权利要求5-8任一项所述的方法对所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质进行检测，并获得色谱图；
(3)含量计算：根据步骤(2)得到的色谱图，采用乘以校正因子的主成分自身对照法利用峰面积计算所述恩扎卢胺SM1及其相关杂质的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，分离前，以乙腈水溶液为溶剂配制待测溶液；
所述溶剂中，乙腈和水的体积比为70：30。
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