CN108802236B - 一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，该方法包括以下步骤：取乳制品，加入Triton X‑114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X‑114的终浓度为30～50μL/mL，NaCl的终浓度为0.4～1.2mg/mL，甲酸的终浓度为2.0～8.0μL/mL；震荡，40℃恒温水浴，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；配置三聚氰胺标准储备液，用体积浓度为0.6％的甲酸水溶液将储备液稀释，得到一系列浓度标准品进样液；将上述制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液用液相离子对色谱法进行检测，得到待测样品和标准品的液相色谱图，再将两者的图谱进行比较确定特征峰，然后根据峰面积以随行标准曲线计算检测样品中三聚氰胺的含量。

Description

一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法

技术领域

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及一种测定食品中三嗪类含氮杂环有机化合物含量的方法。

背景技术

三聚氰胺(melamine)，俗称密胺、蛋白精，是一种人工合成的三嗪类含氮杂环有机化合物，目前在化工行业用途广泛。三聚氰胺对人体存在慢性毒性，研究表明，动物长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，引起膀胱及肾结石，并可进一步引起移行细胞增生进而诱发膀胱癌，新生期动物的结石发生率比成年期动物高的多，因此对婴幼儿的健康损害尤为严重。近年来，有不法商家非法添加三聚氰胺到婴儿奶粉、酸奶片等乳制品的报道，严重损害消费者的身体健康，对社会正常秩序造成极大破坏，引发国内国外对乳制品安全的高度关注。我国现明确指出三聚氰胺不允许添加到食品中，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉及含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。

目前乳制品中三聚氰胺常用离子对色谱法进行检测，检测的一般操作步骤包括：用沉淀法沉淀蛋白、溶剂提取三聚氰胺、固相萃取柱净化富集、离子对色谱法检测。检测过程操作处理过程步骤繁杂，耗时较长，试剂和耗材用量较大，不利于现实生活中乳制产品的多样本快速检测。我国现行国家标准GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中规定的高效液相色谱法、气相色谱法-质谱联用法和液相色谱-质谱法检测，其中高效液相色谱灵敏度低、检测假阴性率高，气相色谱法-质谱联用法样品处理步骤复杂、不能适用各种类型的样品，液相色谱-质谱法检测成本高昂，因此在各地推广应用仍非常局限。因此建立一种灵敏度高、检测成本低、检测程序简便易于推广应用的三聚氰胺含量的检测方法，对实际食用乳制品产品的大批量快速检测具有重要意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，该方法具有成本低廉和灵敏度高的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制取待测样品进样液：

1)取液体乳制品样本，加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为30～50μL/mL(即每毫升液体乳制品混合溶液中含Triton X-11430～50μL)，NaCl的终浓度为0.4～1.2mg/mL，甲酸的终浓度为2.0～8.0μL/mL(即每毫升液体乳制品混合溶液中含甲酸2.0～8.0μL)；震荡，40℃恒温水浴处理6min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；或者，

2)取固体乳制品充分研磨，加入水溶解至1mg固体乳制品︰6μL水的固液比；然后，加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为30～50μL/mL(即每毫升液体乳制品混合溶液中含Triton X-114 30～50μL)，NaCl的终浓度为0.4～1.2mg/mL，甲酸的终浓度为2.0～8.0μL/mL(即每毫升液体乳制品混合溶液中含甲酸2.0～8.0μL)；震荡，40℃恒温水浴处理6min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；

(2)制取标准品进样液：

取三聚氰胺加入体积浓度为0.6％的甲酸水溶液溶解，得到浓度为20.0mg/L的三聚氰胺标准品储备液；再将三聚氰胺标准品储备液用体积浓度为0.6％的甲酸水溶液稀释，制得浓度为0.002～8.0mg/L的一系列三聚氰胺标准品进样液；

(3)将所制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液分别用液相离子对色谱法进行如下检测：按进样量为50～500μL，对规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm的液相C18或ODS色谱柱进样，控制柱温度为35～45℃，接着用由A相和B相组成的流动相以0.8～1.2mL/min的流速进行梯度洗脱，获得待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液的液相色谱图；其中，所述的流动相的A相是8～15mmol/L辛烷磺酸钠和8～12mmol/L柠檬酸水溶液，A相由以下方法制成：准确称量1.730～3.243g辛烷磺酸钠和1.681～2.522g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气；所述的流动相的B相是乙腈或甲醇；所述的梯度洗脱程序为：0～1min内A相由2％上升至11％～13％，1～20min内A相由11％～13％上升至14％～16％。

(4)将待测样品进样液的液相图谱与每一浓度标准品进样液的液相图谱比较，与标准品进样液的液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰峰面积以随行标准曲线计算待测样品进样液中三聚氰胺的含量。

本发明所述的测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，其中所述的乳制品为牛奶制品或羊奶制品。

本发明还提供一种实施本发明所述的测定乳制品中三聚氰胺含量的方法的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：

试剂A：浓度为200μL/mL的Triton X-114水溶液；

试剂B：浓度为2mg/mL的NaCl水溶液；

试剂C：浓度为24μL/mL的甲酸水溶液；

试剂D：三聚氰胺；

试剂E：体积浓度为0.6％的甲酸水溶液；

试剂F：辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液，该辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液由以下方法制成：准确称量1.730～3.243g辛烷磺酸钠和1.681～2.522g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气；

试剂G：乙腈或甲醇。

本发明采用步骤(1)所述试剂和方法将乳制品样本中复杂的干扰基质分离，兼容液相离子对色谱大体积进样分析，较现有技术具有成本低廉和灵敏度高的显著效果。

附图说明

图1为下述具体实施方式中的制取乳制品样本进样液的反应过程及机理图解。

图2为下述具体实施方式牛奶中三聚氰胺含量检测结果的色谱图，图中“1”所示特征峰为三聚氰胺，a为样品背景，b为待测样品进样液。

图3为下述具体实施方式酸奶中三聚氰胺含量检测结果的色谱图，图中“1”所示特征峰为三聚氰胺，a为样品背景，b为待测样品进样液。

图4为下述具体实施方式奶粉中三聚氰胺含量检测结果额色谱图，图中“1”所示特征峰为三聚氰胺，a为样品背景，b为待测样品进样液。

具体实施方式

实施例1(测定方法例)

1.仪器、试剂与样品

1.1.仪器：Vortex-Genie可调涡旋混合器；XMTD-204恒温水浴器；微量移液器；MiLLi-Q ELement超纯水处理系统；1/1000电子天平；G13U台式离心机；LC-20A高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器)；Shim-Pack VP-ODS柱色谱柱(250×4.6mm,5μm)。

1.2.试剂：Triton X-114；NaCl(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；辛烷磺酸钠(色谱纯)；柠檬酸；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)。

配制200μL/mL的Triton X-114溶液：取10mL容量瓶加入2mL Triton X-114，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后放入-4℃冰箱冷藏4h，取出恢复至室温备用。

配制2mg/mL的NaCl溶液：准确称量20mg NaCl加到10mL容量瓶，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后静置备用。

配置24μL/mL的甲酸水溶液：取10mL容量瓶，加入240μL甲酸，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后静置备用。

1.3.样品

乳制品样本：采集牛奶、酸奶和奶粉样品(购自超市)，牛奶和酸奶样本量大于300μL，奶粉样品量大于50mg。以上对于羊奶、炼乳、奶油、奶酪、奶片、乳冰激凌同样适用。将收集的乳制品样本于-4℃保存送往南方医科大学卫生监测中心，对样本进行三聚氰胺含量检测。

标准品：三聚氰胺(99.5％)，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号CAS:108-78-1。

2.方法

2.1.制取待测牛奶样品进样液

取300μL冷藏牛奶样本，称重记录质量为0.309g，待恢复常温后震荡；加入300μL浓度为200μL/mL的Triton X-114溶液、600μL浓度为2mg/mL的NaCl溶液和300μ浓度为24μL/mL的甲酸水溶液，此时Triton X-114的终浓度为40μL/mL，NaCl的终浓度为0.8mg/mL，甲酸的终浓度为4.8μL/mL；震荡涡旋10s，40℃恒温水浴处理4min，11000rpm离心5min，取上清液1000μL，过0.22μm滤膜，得到待测牛奶样品进样液；

2.2.制取待测酸奶样品进样液

取300μL冷藏酸奶样本，称重记录质量为0.358g，待恢复常温后震荡；加入300μL浓度为200μL/mL的Triton X-114溶液、600μL浓度为2mg/mL的NaCl溶液和300μ浓度为24μL/mL的甲酸水溶液，此时Triton X-114的终浓度为40μL/mL，NaCl的终浓度为0.8mg/mL，甲酸的终浓度为4.8μL/mL；震荡涡旋10s，40℃恒温水浴处理4min，11000rpm离心5min，取上清液1000μL，过0.22μm滤膜，得到待测酸奶样品进样液；

2.3.制取待测奶粉样品进样液

取50mg冷藏奶粉样本，待恢复常温后加入300μL纯水震荡稀释；加入300μL浓度为200μL/mL的Triton X-114溶液、600μL浓度为2mg/mL的NaCl溶液和300μ浓度为24μL/mL的甲酸水溶液，此时Triton X-114的终浓度为40μL/mL，NaCl的终浓度为0.8mg/mL，甲酸的终浓度为4.8μL/mL；震荡涡旋10s，40℃恒温水浴处理4min，11000rpm离心5min，取上清液1000μL，过0.22μm滤膜，得到待测奶粉样品进样液；

上述步骤2.1～2.3所述方法的反应过程和机理如图1所示。

2.4.制取标准品储备液

称量2.0mg三聚氰胺放入100mL容量瓶中，用体积浓度为0.6％的甲酸水溶液稀释得到20.0mg/L三聚氰胺标准品储备液；

2.5.制取标准品进样液

将上述三聚氰胺标准品储备液用体积浓度为0.6％的甲酸水溶液稀释成浓度为0.002、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0mg/L的一系列标准品稀释液，取各浓度值的标准品稀释液1000μL得到0.002～8.0mg/L的一系列三聚氰胺标准品进样液；

2.6.高效液相色谱检测

流动相：流动相由A相和B相组成。其中，B相为乙腈，A相为10mmol/L辛烷磺酸钠和10mmol/L柠檬酸水溶液，A相由以下方法制得：准确称量2.162g辛烷磺酸钠和2.10g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气。

高效液相色谱检测条件：流速1.0mL/min，进样量250μL，柱温40℃。梯度洗脱程序为：0～1min内A相由2％上升至12％，1～20min内A相由12％上升至15％。三聚氰胺检测波长为235nm。

2.7.检测数据处理

系统平衡后，取待测牛奶样品进样液、待测酸奶样品进样液、待测奶粉样品进样液及一系列浓度的标准品进样液，分别进样，记录各样品进样液和标准品进样液的色谱图，该色谱图如图2、图3、图4所示。

以各标准品进样液所测峰面积为纵坐标，标准品进样液浓度为横坐标，作出三聚氰胺的标准品进样液的散点图，然后对所得到的散点图进行关于各标准品进样液的峰面积和浓度值的两变量线性回归分析，得到标准曲线方程y＝ax+b，其中，x为标准品进样液浓度(mg/L)，y为峰面积(mAU)，a和b为常数；根据标准品进样液出峰的保留时间确认实际进样牛奶、酸奶和奶粉样品进样液的出峰位置，将进样样品所测峰面积代入上述相关方程中进行计算，得出待测样品进样液中三聚氰胺含量(mg/L)。根据公式w＝c×1.5÷m，计算样品中三聚氰胺含量(mg/kg)，其中w为样品中三聚氰胺含量(mg/kg)，c为待测样品进样液中三聚氰胺的浓度(mg/L)，m为样品质量(g)。

上述方法所得到的三聚氰胺的标准曲线为y＝43377x+496.59，其线性范围为0.002～8.0mg/L，R²＝0.9999；将待测牛奶、酸奶和奶粉样品进样液的峰面积代入方程，计算出所述三种待测乳制品中三聚氰胺的含量。

3.结果待测牛奶样品、待测酸奶样品和待测奶粉样品中三聚氰胺均为未检出，符合国家乳制品限值要求。

4.检测方法验证

方法可行性验证：通过向乳制品中添加定量已知浓度的标准混标溶液，以加标回收率作指标，分低加标浓度、中加标浓度和高加标浓度三个浓度组，从选择性、准确性、精密性、提取回收率和质控样品检测五个方面验证方法可行性。

4.1.选择性：制备空白乳制品样本以检测样本色谱图，样本本底测定结果显示在出峰位置均为噪声响应，无内源性物质干扰。空白样品色谱图与加标样品色谱图对照如图2、图3、图4示例。

4.2.准确性：以加标回收率(％)反映准确性，结果显示三聚氰胺低、中、高浓度的加标回收率

分别为94.1％±1.9％、96.8％±2.9％、98.8％±2.8％。所测得结果均在实际加标浓度值的±10％之内。

4.3.精密性：采用1天内一次测定6个相同加标浓度的样本，计算这6个样本中三聚氰胺的变异系数作为批内变异；每天1次测定5个样本，连续5天，计算这5天的三聚氰胺的变异系数作为批间变异，用变异系数CV(％)＝100*均值/标准差。结果显示三聚氰胺在低、中、高浓度的批内变异分别为：1.6％、4,6％、3.9％；在低、中、高浓度的批间变异分别为：3.7％、2.2％、1.9％。各变异结果均在5％内。

4.4.提取回收率：不同浓度水平的三聚氰胺回收率为94.1％～98.8％范围内。

4.5.质控样品检测：牛奶质控样品(QC-MI-701)购自中国检验检疫科学研究院分析能力评估系统，三聚氰胺含量标准值为2.973mg/kg，实际检测值为3.039mg/kg，相对误差计算为2.2％。

实施例2(试剂盒产品例)

本实施例的试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E，各试剂的制备方法如下所述。

试剂A：200μL/mL Triton X-114溶液；制备方法如下：取2mL Triton X-114用水定容至10mL；

试剂B：2mg/mL NaCl溶液；制备方法如下：取40mg NaCl用水定容至20mL；

试剂C：24μL/mL甲酸溶液；制备方法如下：取240μL甲酸用水定容至10mL；

试剂D：三聚氰胺标准品固体2.0mg；

试剂E：体积浓度为0.6％的甲酸溶液；制备方法如下：取300μL甲酸用水定容至50mL；

试剂F：辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液，该辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液由以下方法制成：准确称量2.162g辛烷磺酸钠和2.10g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气；

试剂G：乙腈100mL。

本例所述试剂盒的使用方法可参照上述实施例1实施。

Claims (3)

1.一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，该方法由以下步骤组成：

(1)制取待测样品进样液：

1)取液体乳制品样本，加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得TritonX-114的终浓度为30～50μL/mL，NaCl的终浓度为0.4～1.2mg/mL，甲酸的终浓度为2.0～8.0μL/mL；震荡，40℃恒温水浴处理6min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；或者，

2)取固体乳制品充分研磨，加入水溶解至1mg固体乳制品︰6μL水的固液比；然后，加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为30～50μL/mL，NaCl的终浓度为0.4～1.2mg/mL，甲酸的终浓度为2.0～8.0μL/mL；震荡，40℃恒温水浴处理6min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；

(2)制取标准品进样液：

取三聚氰胺加入体积浓度为0.6％的甲酸水溶液溶解，得到浓度为20.0mg/L的三聚氰胺标准品储备液；再将三聚氰胺标准品储备液用体积浓度为0.6％的甲酸水溶液稀释，制得浓度为0.002～8.0mg/L的一系列三聚氰胺标准品进样液；

(3)将所制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液分别用液相离子对色谱法进行如下检测：按进样量为50～500μL，对规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm的液相C18或ODS色谱柱进样，控制柱温为35～45℃，接着用由A相和B相组成的流动相以0.8～1.2mL/min的流速进行梯度洗脱，获得待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液的液相色谱图；其中，所述的流动相的A相是8～15mmol/L辛烷磺酸钠和8～12mmol/L柠檬酸水溶液，A相由以下方法制成：准确称量1.730～3.243g辛烷磺酸钠和1.681～2.522g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气；所述的流动相的B相是乙腈或甲醇；所述的梯度洗脱程序为：0～1min内A相由2％上升至11％～13％，1～20min内A相由11％～13％上升至14％～16％；

(4)将待测样品进样液的液相图谱与每一浓度标准品进样液的液相图谱比较，与标准品进样液的液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰峰面积以随行标准曲线计算待测样品进样液中三聚氰胺的含量。

2.根据权利要求1所述的一种测定乳制品中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，所述的乳制品为牛乳制品或羊乳制品。

3.一种实施权利要求1或2所述的测定乳制品中三聚氰胺含量的方法的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：

试剂A：浓度为200μL/mL的Triton X-114水溶液；

试剂B：浓度为2mg/mL的NaCl水溶液；

试剂C：浓度为24μL/mL的甲酸水溶液；

试剂D：三聚氰胺；

试剂E：体积浓度为0.6％的甲酸水溶液；

试剂F：辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液，该辛烷磺酸钠-柠檬酸水溶液由以下方法制成：准确称量1.730～3.243g辛烷磺酸钠和1.681～2.522g一水柠檬酸放入1000mL容量瓶中，定容后抽滤、超声脱气；

试剂G：乙腈或甲醇。

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