CN109358134B

CN109358134B - 一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理方法及定量检测方法

Info

Publication number: CN109358134B
Application number: CN201811559072.4A
Authority: CN
Inventors: 冯钰锜; 罗晓彤; 蔡保东
Original assignee: Wuhan Greensword Creation Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109358134A

Abstract

本发明公开了一种植物样品中包括内源性海藻糖‑6‑磷酸在内的多种磷酸糖类化合物的分析方法。该方法先以溶剂提取内源性磷酸糖，之后用反相SPE小柱吸附并除去提取液中的疏水性杂质，再利用衍生化试剂中的重氮基团与磷酸糖类化合物共有的磷酸基团发生衍生化反应，结合液相色谱‑质谱，实现了植物样品中内源性磷酸糖同分异构体的分离检测。该方法简单、准确、高通量，既能实现磷酸糖同分异构体在亲水色谱柱上的基线分离，又能保证较高的检测灵敏度，最终可实现在微量植物组织样品中内源性磷酸糖的分离检测。

Description

一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理方法及定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理及定量分析方法，属于分析化学领域。

背景技术

磷酸糖类化合物是植物中重要的信号分子，并在许多生理过程包括种子发育，幼年-成年转变阶段，花卉过渡期，芽分支，衰老期和胚胎成熟期中发挥重要作用。然而，磷酸糖类化合物在植物体内的作用机理还不得而知。因此，建立准确、高灵敏的分析方法是探索磷酸糖类化合物在植物中作用的关键。

迄今为止，人们开发了许多分析方法用于磷酸糖类化合物在植物中的分析检测。在这些方法中，LC-MS的方法因其高灵敏度和高选择性已成为磷酸糖类化合物分析方法的主流，然而仍存在问题：

一是，磷酸糖类化合物有较强的亲水性，很难在传统反相色谱柱上保留，并且磷酸糖类化合物同分异构体之间的色谱分离也成为了一大难题。基于此，人们引入了高效强阳离子交换色谱来分离磷酸糖类化合物，这使得这类化合物在色谱柱上的保留有了较大的改善。然而，在强阳离子交换色谱的色谱流动相中往往加入了高浓度的盐，这在一定程度上降低了质谱的检测灵敏度，也会在一定程度上对质谱仪造成损伤。亲水作用色谱可以很好的解决这个问题，磷酸糖类化合物在亲水柱上有较强保留，同时亲水柱所使用的流动相也可以与质谱完美匹配，但使用亲水柱分离磷酸糖的同分异构体时，仍存在无法基线分离的问题，这会影响定量的准确性。

二是，由于T6P的离子化效率不佳，在CID上的碎裂行为不佳，导致其在MS上的信号响应差，且复杂植物基质会给后续的检测带来干扰，导致灵敏度低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的样品前处理及定量分析方法，实现了磷酸糖同分异构体之间的基线分离，极大程度提高了分析物的检测灵敏度。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理方法，主要包括以下步骤：

1)在植物样品中定量加入磷酸糖的同位素内标，然后以溶剂提取，得到植物样品提取溶液；

2)将步骤1)所得植物样品提取溶液用氮气吹干，之后用硼酸缓冲溶液复溶，所得复溶溶液缓缓通过SPE小柱并收集流出液；

3)向步骤2)所收集的流出液中加入重氮衍生化试剂，之后经振荡、离心后，得到上清液，即完成植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理，该上清液(无需吹干复溶)直接用于高效液相色谱-串联质谱进行分析，实现对植物样品中的内源性磷酸糖类化合物的定量检测。

按上述方案，所述重氮化衍生化试剂包括骨架、增敏基团、重氮基团三部分，重氮衍生化试剂的重氮基团与磷酸糖分析物的磷酸基团发生反应。该重氮衍生化试剂的结构通式如式1所示，其中A为喹啉甲基或苯甲基等，当A为喹啉甲基时，B即为氢原子；当A为苯甲基时，B可为氨基，伯胺或仲胺基团等。

N₂＝A-B 式1

按上述方案，所述SPE小柱由50-200mg含有疏水功能基团的硅胶颗粒填充而成。其中，所述的疏水功能基团主要指C18或C8基团等。

按上述方案，步骤1)的操作方法为：准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入[¹³C₆]葡萄糖-6-磷酸同位素内标，然后加入0℃-4℃的脂溶性溶剂；之后在-20℃-4℃环境中浸泡提取2-12小时，时而涡旋；随后继续加入0℃-4℃的水，经涡旋、离心取上层清液，得到样品提取溶液。该步骤中，脂溶性溶剂的作用是破坏植物细胞膜通透性的同时充分溶解植物中的脂溶性杂质，主要选自三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、乙醚、正己烷、乙酸乙酯等中一种或几种与乙腈的混合溶液，其中乙腈占脂溶性溶剂的体积比的范围为50％-70％。冰水的作用是提取磷酸糖类物质。

优选地，步骤1)中，所加入脂溶性溶剂与植物样品鲜重的质量比为1mL：(25-250)mg；所加入冰水与植物样品鲜重的质量比为1mL：(25-250)mg，涡旋提取时间为3-10min。

优选地，步骤1)中所得样品提取溶液体积与步骤2)中反相SPE小柱填料的质量比值在(2-20)μL：1mg之间。

按上述方案，步骤2)中，硼酸缓冲溶液中硼酸盐浓度为40-100mM，pH范围为5.5-7.0。该步骤中硼酸缓冲盐溶液的作用是为步骤3)中的化学衍生化反应提供有利的反应条件。优选地，复溶溶液通过SPE小柱后，用上述硼酸缓冲溶液清洗SPE小柱，合并清洗液和流出液。复溶溶液的一般体积为200-600μL，清洗液的体积一般为100-400μL。

按上述方案，步骤3)中，重氮衍生化试剂溶解于二甲亚砜(DMSO)中，浓度范围在0.014mM至0.1mM之间；步骤2)中所收集流经SPE小柱的流出液与步骤3)中加入重氮衍生化试剂的体积比在2：3至3：2之间；振荡仪温度在4-25℃之间，震荡时间为0.5-3小时。

本发明在上述前处理方法的基础上还提供一种植物样品中内源性磷酸糖的定量分析检测方法，将前处理方法所得上清液通过分析仪器采集响应信号或者数据，进而采用稳定同位素内标结合标准曲线定量法测定植物样品中内源性磷酸糖的含量。其中，所述分析仪器采用液相色谱-质谱仪联用；色谱柱采用亲水色谱柱。主要步骤如下：

1)配置不同浓度梯度的标准样品溶液，并加入25ng[¹³C₆]葡萄糖-6-磷酸作为内标；

2)向步骤1)配置好的标准溶液中加入重氮衍生化试剂对不同浓度的磷酸糖化合物及加入的内标进行衍生，在室温下振荡后完成；

3)将步骤2)所得溶液进行超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析，将得到的色谱图中每个标准品以及内标的峰面积进行积分，用各个浓度磷酸糖化合物的峰面积除以内标的峰面积，对相应物质的浓度作线性曲线，制得标准曲线；

4)将前述前处理方法所得植物样品的上清液在与步骤3)相同的检测条件下通过超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析采集色谱图，进而将色谱图中每个物质的峰面积积分，除以与之对应的内标的峰面积，将所得峰面积比代入步骤2)所得标准曲线中，计算出响应浓度，再根据所用的植物样品质量，计算出磷酸糖在每克鲜重植物中的含量。

本发明中，内源性磷酸糖类化合物包括但不限于以下几种：葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸，蔗糖-6-磷酸，海藻糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸等。

本发明以溶剂提取内源性磷酸糖，之后用反相SPE小柱吸附并除去提取液中的疏水性杂质，再利用衍生化试剂中的重氮基团与磷酸糖类化合物共有的磷酸基团发生衍生化反应，结合液相色谱-质谱，实现了植物样品中内源性磷酸糖同分异构体的分离检测。与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明利用化学衍生化结合亲水作用色谱，将原本难以分离的磷酸糖同分异构体实现基线分离，保证方法的准确性，实现了磷酸糖同分异构体之间的基线分离；用化学衍生化结合高效液相色谱串联质谱，极大程度提高了分析物的检测灵敏度，质谱信号响应相较衍生前有数量级的提高，实现对微量植物组织样品中的内源性磷酸糖类化合物的定量检测。

2、本发明所述前处理方法可实现低含量、原本质谱响应差的磷酸糖类化合物的富集纯化，同时建立了一种稳定、准确、高灵敏的植物样品分析方法，实现包括海藻糖-6-磷酸在内的磷酸糖类化合物在植物样品中的高灵敏检测，实现在微量植物组织样品中内源性磷酸糖的分离检测。

3、本发明在溶剂粗提取之后引入SPE利用固相萃取对植物样品提取液进行进一步除杂以除去植物基质中的疏水性杂质，尽可能避免植物基质对于检测的干扰；并在前处理方法中引入稳定同位素内标，校准操作误差以及仪器误差，减小实验结果受人为或仪器影响带来的波动，增强稳定性和准确度。

附图说明

图1为实施例1中四种标准品的色谱分离图。

图2为实施例1中四种标准品衍生前后灵敏度提高情况。

图3为实施例3中检测到的内源性磷酸糖的多反应监控色谱图；其中，a为拟南芥地上部分样品；b是水稻幼苗地上部分样品；c是水稻根样品；样品鲜重均小于等于10mg。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步对本发明的所提供技术方案中的关键技术作进一步的说明，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例，所采用的商品化C18SPE吸附材料购于维泰克科技公司(武汉，中国)；所采用的磷酸糖衍生化试剂的制备过程如下：

将喹啉-8-甲醛(0.4g,2.5mmol)和水合肼(0.25g,5.1mmol)的混合物在975μLDMSO中于60℃下搅拌2h；之后，加入0.85g市售活性二氧化锰并在室温下振荡4h，随后离心，取上清液，过硅胶柱纯化后，即得到重氮衍生化试剂8-重氮甲基喹啉(8-(diazomethyl)quinoline,8-DMQ)的结构如式2：

下述实施例中，超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)的检测条件如下：

仪器采用Ultimate 3000 UHPLC Dionex与TSQ Quantiva,Thermo Fisher。柱温箱温度：40℃，色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH HILIC 100mm×2.1mm i.d.,1.7μm。流动相A：40mM甲酸铵缓冲盐水溶液，流动相B：乙腈，流速：0.4mL min^-1。梯度洗脱条件：0-9min95％B-94％B，9-13min 94％B-75％B，13-16min 75％B，16-22min 95％B。

实施例1

本实施例用四种标准品作为分析物，验证其色谱分离情况。配制葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、蔗糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸的混合标准品，每种标准品0.2ng溶于300μL50mM的硼酸缓冲盐溶液(pH 6.8)中；向所得溶液中加入180μL 8-DMQ的DMSO溶液(0.014mM)，然后放置于室温下振荡40min，离心(10000×g)5min取上清液；之后取2μL上清液经HILIC色谱柱进入质谱分析。

如1图所示，两对同分异构体都得到了较好的分离，有较好的色谱保留行为，且色谱峰型较好。

实施例2

本实施例用四种标准品作为分析物，验证其衍生前后灵敏度提高情况。

首先，配制葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、蔗糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸的混合标准品，每种标准品0.2ng溶于300μL 50mM的硼酸缓冲盐溶液(pH 6.8)中；向所得溶液中加入180μL 8-DMQ的DMSO溶液(0.014mM)，然后放置于室温下振荡40min，离心(10000×g)5min取上清液；之后取2μL上清液经HILIC色谱柱进入质谱分析。

另，配制葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、蔗糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸的混合标准品，每种标准品0.2ng溶于480μL 50mM的硼酸缓冲盐溶液(pH 6.8)中；之后所得溶液取2μL经HILIC色谱柱进入质谱分析。

如2图所示，经比较混合标准品衍生前后色谱图的峰面积，衍生后四种磷酸糖的灵敏度较衍生前提高3-114倍。

实施例3

一种植物样品中内源性磷酸糖的前处理方法，主要包括以下步骤：

1)准确称取1mg水稻叶，5mg水稻根，10mg拟南芥叶分别液氮研磨至粉末状，作为植物样品；

将前述植物样品中加入同位素内标[¹³C₆]磷酸-6-葡萄糖25ng以及0.25mL冰的氯仿/乙腈3：7(v/v)混合均匀；涡旋混匀后，放置于-20℃的冰箱内提取2小时，时而涡旋；之后，加入0.2mL冰水并涡旋3min，在离心(10000×g)5min后，取出上层水相于另一个离心管中；再次加入0.2mL冰水重复以上步骤，合并两次提取液即为样品提取溶液；

2)将上述所得样品提取溶液于氮气下吹干，然后用200μL 50mM的硼酸缓冲盐溶液(pH 6.8)复溶，并将此复溶溶液缓缓通过50mgC18SPE小柱，接流出液；之后加入100μL上述缓冲盐溶液清洗C18SPE小柱，合并清洗液和流出液(300μL)；

3)向步骤2)所得溶液中加入180μL 8-DMQ的DMSO溶液(0.014mM)，然后放置于室温下振荡40min，离心(10000×g)5min取上清液，即完成植物样品中内源性磷酸糖类化合物的样品前处理，该上清液直接用于高效液相色谱-串联质谱进行分析。

一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的定量检测方法，主要步骤如下：

1)配置不同浓度梯度的标准样品溶液(浓度范围如表1所示，每种标准品溶于300μL 50mM的硼酸缓冲盐溶液(pH 6.8)中)，并加入25ng[¹³C₆]葡萄糖-6-磷酸作为内标；

2)向步骤1)配制好的不同浓度梯度的标准溶液中分别加入180μL 8-DMQ的DMSO溶液(0.014mM)，在室温下振荡40min，完成衍生化反应；

3)将步骤2)所得溶液取2μL经HILIC柱后，进入超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析；将得到的色谱图中每个标准品以及内标的峰面积进行积分，用各个浓度磷酸糖化合物的峰面积除以内标的峰面积，对相应物质的浓度作线性曲线，制得标准曲线(如表1所示)；

4)将本实施例前述前处理方法所得不同植物样品的上清液在与步骤3)相同的检测条件下通过超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析采集色谱图(如图3所示)，进而将色谱图中每个物质的峰面积积分，除以与之对应的内标的峰面积，将所得峰面积比代入步骤2)所得标准曲线中，计算出响应浓度，再根据所用的植物样品质量，计算出磷酸糖在每克鲜重植物中的含量(如表2所示)。

表1.分析物的工作曲线

表2.三种实际样品中内源性磷酸糖的含量

单位:μg/g鲜重

为了验证本方法的准确度，本发明考察了加标回收率(详见表3)，之后按照所述的方法进行处理和测定，得出不同加标浓度的回收率在之间，表明本发明所提供方法的准确性。对方法进行日间日内精密度考察，计算各自回收率的相对标准偏差在之间，表明方法稳定可靠。

表3方法的稳定性和准确度

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理方法，其特征在于主要包括以下步骤：

2)将步骤1)所得植物样品提取溶液用氮气吹干，之后用硼酸缓冲溶液复溶，所得复溶溶液通过反相SPE小柱并收集流出液；

3)向步骤2)所收集的流出液中加入重氮衍生化试剂进行化学衍生，实现对磷酸糖化合物的衍生标记，之后经振荡、离心后，得到上清液，即完成对植物样品中内源性磷酸糖类化合物的前处理，所述上清液直接用于高效液相色谱-串联质谱进行分析检测。

2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于所述重氮衍生化试剂的结构通式如式1所示，

N₂＝A-B 式1

其中A为喹啉甲基或苯甲基，当A为喹啉甲基时，B即为氢原子；当A为苯甲基时，B可为氨基或伯胺基团。

3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤1)中溶剂提取步骤分为两步，先以脂溶性溶剂溶解植物样品中的脂溶性杂质，随后加入水提取磷酸糖类化合物。

4.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于所述脂溶性溶剂的为选自三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、乙醚、正己烷、乙酸乙酯中一种或几种与乙腈的混合溶液，其中乙腈占脂溶性溶剂的体积比的范围为50％-70％。

5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤1)中所得样品提取溶液体积与步骤2)中反相SPE小柱填料的质量比值在(2-20)μL：1mg之间。

6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤2)中，硼酸缓冲溶液中硼酸盐浓度为40-100mM，pH范围为5.5-7.0。

7.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤3)中，重氮衍生化试剂溶解于二甲亚砜中形成重氮衍生化试剂溶液，浓度范围在0.014-0.1mM之间。

8.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤2)中所收集得通过反相SPE小柱的流出液与步骤3)中加入重氮衍生化试剂的溶液的体积比在2：3至3：2之间。

9.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于步骤3)中进行化学衍生时，反应温度为4-25℃之间，pH在5.5-7之间，反应时间在30-180min之间。

10.一种植物样品中内源性磷酸糖的定量分析检测方法，其特征在于将权利要求1所述前处理方法所得上清液通过分析仪器采集响应信号或者数据，进而采用稳定同位素内标结合标准曲线定量法测定植物样品中内源性磷酸糖的含量；其中，分析仪器采用液相色谱-质谱仪联用，色谱柱采用亲水色谱柱。