CN108318614A - 一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释lc-ms方法 - Google Patents

一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释lc-ms方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种测定血浆样品中内/外源性葡萄糖浓度的方法，即结合液质联用(LC‑MS)多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)技术与衍生化反应，利用同位素稀释(isotope dilution)法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度。该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子化效率。利用D‑[13C6]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，能够对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。该方法能够精确测定血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，避免基质效应对定量测定的影响。该发明方法具有选择性强，灵敏度高，所需血浆样品量少(20ul甚至更少)，抗干扰能力强，基质效应影响小，定量准确度高等优点。

Description

一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法
技术领域
本发明属于分析化学方法领域，具体涉及一种利用LC-MS技术测定葡萄糖浓度的方法，更具体地说，涉及一种利用衍生化物标签裂解结合质谱多反应监测(multiplereaction monitoring,MRM)技术精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度的定量分析方法。
背景技术
葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，是人类生命活动所需能量的重要来源。血糖浓度是临床生化检验中的重要指标。在临床上，监测血糖浓度可以为许多疾病例如糖尿病、高血压、心脑血管疾病病症诊断、病情观察、治疗监控等提供客观依据，因此，对其准确测定具有重要意义。
血糖浓度的检测方法在医学上常用的有氧化酶-偶联比色法(GOD-POD)、已糖激酶法(HK)、葡萄糖脱氢酶法(GDH)等。这些方法具有快速、高效的特点，但是，均不能有效区分内源性和外源性葡萄糖。准确测定生物体血液中内源性与外源性葡萄糖浓度的变化，有利于研究机体血糖的代谢动力学过程，可以用于评价降血糖药物的药效，有助于理解其药理学作用机制。
发明内容
本发明的目的是，采用衍生化标签裂解的间接MRM精确定量方法结合同位素稀释LC-MS测定内/外源性血糖浓度，以避免用LC-MS直接测定葡萄糖进行定量时离子化效率低，易受血浆中其他杂质干扰以及基质效应影响等问题。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，利用同位素稀释法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度，该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率，同时利用D-[13C6]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，结合液质联用多反应监测技术，对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。
根据所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，该方法运用MRM二级质谱数据采集模式，选择性衍生化内/外源性葡萄糖后，四级杆选择特定母离子(m/z 358，364)进行碰撞诱导裂解，裂解发生于衍生化试剂羰基部位的标签上，提取特异性子离子(m/z 284，290)的EIC图，测定二者峰面积比例，计算血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，能够降低血浆样品复杂基质中其它物质干扰，避免基质效应对定量测定的影响。
根据所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，该方法利用衍生化反应提高质谱离子化效率，结合质谱多反应监测，具有高灵敏性，对葡萄糖具有高特异性，抗杂质干扰能力强。
根据所述一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，测定D-[13C6]/[12C6]葡萄糖衍生物目标子离子提取离子色谱图峰面积比例进行定量分析，能平衡基质效应的影响；衍生化后碰撞诱导裂解发生于衍生化试剂标签上，产生响应稳定的碎片离子，能够降低D-[13C6]/[12C6]葡萄糖由于同位素效应对诱导裂解产生的影响，定量准确度高。
根据所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，该方法包括首先制备一系列浓度比例变化的D-葡萄糖和D-[13C6]葡萄糖混合物标准样品，考察该发明方法定量动态范围、准确性和稳健性：
使用试剂：无水D-葡萄糖，纯度99.8％；D-[13C6]葡萄糖，标记率99％，纯度98％；对氨基苯甲酸丁酯，纯度98％和氰基硼氢化钠，纯度95％；冰醋酸w/％≥99.5。
分别配制100mM天然葡萄糖和1mM D-[13C6]葡萄糖储备液，取10μL、20μL、40μL、80μL、140μL、200μL、280μL、340μL、400μL100mM天然葡萄糖储备液于2mL的EP管，每个EP管中加入等量70μL 1mM D-[13C6]葡萄糖储备液(以D-[13C6]葡萄糖作为示踪物和浓度内标物，终浓度为0.035mM)，加水稀释至2mL，涡旋混匀、充分平衡，制备得到不同浓度比的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖混合标准溶液；
衍生化反应：称取对氨基苯甲酸丁酯，氰基硼氢化钠于反应瓶中，加入甲醇和冰醋酸，混匀，取上述不同浓度比例的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖于不同的进样小瓶中，分别加入衍生化试剂混合溶液；在80℃条件下水浴加热反应1h，取出，冷却至室温；
纯化处理：用C18填料的固相萃取小柱纯化衍生化反应得到的混合样品，固相萃取小柱活化、平衡后，将样品转移至固相萃取小柱，用1mL乙腈-水，5:95，V/V洗两次，再用1mL乙腈-水，30:70，V/V洗脱，洗脱液收集于进样小瓶中，进行LC-MS/MS实验；
使用DataAnalysis 4.1Bruker软件对实验数据进行分析，选择特征碎片离子，m/z284，290EIC图谱，使用高斯拟合对色谱峰进行平滑处理并积分；根据EIC图谱峰面积，计算得到天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖的浓度比例，并与理论的摩尔浓度比例进行比较，结果显示较高的一致性；
根据所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，测定健康生物体和患糖尿病生物体血浆样品中内/外源性葡萄糖的绝对浓度随时间的变化，血浆样品处理和制备包括：
血浆样品沉淀蛋白处理：将血浆样品从-80℃冰箱取出，待血浆样品室温解冻、平衡后，吸取20μL血浆，加入80μL乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，在4℃下以12000×g离心10min，取上层清液，使用真空离心浓缩仪旋转干燥，再用20μL超纯水重溶解；
衍生化反应：衍生化反应及后续纯化处理方法如上所述，取20μL以上重溶解样品，加100μL混合衍生化试剂，于80℃水浴锅中反应1h；
比较健康生物体与患糖尿病生物体血浆中内/外源性葡萄糖浓度的变化，得出糖尿病生物体外周肌肉组织对葡萄糖的利用率更低，糖尿病个体血浆中内源性葡萄糖下降幅度更大。
本发明的方法中，D-[13C6]葡萄糖与天然葡萄糖混合样品与衍生化试剂反应，生成容易离子化的衍生物，采用MRM数据采集模式，监测特定位置断裂的特异性子离子，以子离子色谱峰面积进行定量分析。以固定量的D-[13C6]葡萄糖作为浓度内标与天然葡萄糖按不同比例混合，制备混合标准品；混合标准品与对氨基苯甲酸丁酯发生衍生化反应，生成席夫碱；在氰基硼氢化钠作用下被还原，形成稳定的还原产物，能显著提高离子化效率。具体样品制备过程见实施例1。
根据发明的方法，采用二级质谱MRM模式采集数据，四级杆选择特定母离子(m/z358，364)进行碰撞诱导裂解，提取特异性子离子(m/z 284，290)的EIC图，测定二者峰面积比例，计算混合标准品中天然和标记葡萄糖的浓度比例；以天然葡萄糖和D-[13C6]葡萄糖理论浓度比与计算得到的浓度比制作标准曲线，考察分析方法的准确性及重现性。
本发明中测定健康生物体和患糖尿病生物体血浆样品中内/外源性葡萄糖的绝对浓度随时间的变化，血浆样品取自健康的食蟹猴和患有糖尿病的食蟹猴。具体样品制备方法见实施例2。
与现有技术相比，该发明方法具有高灵敏性，对葡萄糖具有高特异性，抗杂质干扰能力强，定量准确度高，其优点在于：
(1)使用D-[13C6]葡萄糖作为浓度内标物或示踪物，有效克服LC-MS分析过程中基质效应的影响。能够有效区分血浆中内/外源性葡萄糖，实现内/外源性血浆葡萄糖浓度的同时定量。
(2)所需血浆样品量少(20ul甚至更少)，适用性广泛。
(3)所需同位素标记的D-[13C6]葡萄糖用量小，定量测定成本低，经济实用性强。
(4)通过化学衍生化，改变葡萄糖的物理和化学特性，改善其色谱保留行为，使其与背景杂质分离，同时衍生物具有较高的离子化效率，能增强液质联用检测的灵敏度。
(5)利用衍生化反应对葡萄糖的选择性，消除样品中不能与衍生化试剂发生反应的物质的干扰。采用MRM质谱检测模式，质谱裂解发生于衍生化试剂标签上，具有响应稳定的碎片离子(m/z 284，290)，具有特异性强、背景噪音低，灵敏度高的突出优点。通过衍生化与MRM双重选择，该方法抗杂质干扰能力强，定量分析准确度高。
附图说明
图1 0.5mM D-葡萄糖和0.035mM D-[13C6]葡萄糖制备的混合衍生物标准溶液，二级质谱图特征碎片离子m/z 284和m/z 290提取离子色谱图(EIC)。
图2 D-葡萄糖衍生物和D-[13C6]葡萄糖衍生物MRM质谱图。其中(A)是D-葡萄糖衍生物(m/z 358)在3.3min，10eV碰撞能作用下的二级质谱图；(B)是D-[13C6]葡萄糖衍生物(m/z 364)在3.3min，10eV碰撞能作用下的二级质谱图。
图3根据天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖混合标准品衍生物子离子峰面积计算得到的浓度比例与理论浓度比例的线性回归。其中横坐标为理论质量摩尔浓度比例，纵坐标测定的浓度比例。
图4健康食蟹猴和患糖尿病食蟹猴血浆中内/外源性葡萄糖含量随时间的变化。其中(A)健康食蟹猴和患糖尿病食蟹猴血浆中内源性葡萄糖随时间的变化；(B)健康食蟹猴和患糖尿病食蟹猴血浆中外源性葡萄糖随时间的变化。
图5精确测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法的技术路线图，选择性衍生化内/外源性葡萄糖后，采用MRM二级质谱检测模式，选择特定的母离子(m/z 358，364)，提取特异性子离子(m/z 284，290)离子色谱图(EIC)进行定量。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
本发明实施例的数据采集和处理按以下方法进行：
该发明所涉及的所有的液质联用实验均在安捷伦1290超高压液相色谱仪和布鲁克四级杆-飞行时间质谱仪MicrOTOF-QⅡ上进行。使用色谱柱(2.1×150mm,1.6μm,Waters，带相同填料的保护柱(2.1×5mm))用于葡萄糖衍生物的分离，采用含0.1％甲酸的水(A)和含0.1％甲酸的乙腈(B)为流动相，进行梯度洗脱(图1)。
质谱离子源为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子MRM模式采集数据，扫描质荷比范围50-500Da，母离子选择m/z 358和m/z 364，优化隔离宽度(Isol.Width)和碰撞能，检测特征碎片离子(m/z 284，290)用于定量(图2A，图2B)。使用DataAnalysis 4.1(Bruker)软件处理数据。
实施例1：
为了证实利用基于衍生化标签裂解的间接MRM法结合同位素稀释LC-MS技术测定内/外源性血糖浓度的准确性，本发明首先制备一系列浓度比例变化的D-葡萄糖和D-[13C6]葡萄糖混合物标准样品，考察该发明方法定量动态范围、准确性和稳健性。
使用试剂：无水D-葡萄糖(纯度99.8％)D-[13C6]葡萄糖(标记率99％，纯度98％)，对氨基苯甲酸丁酯(纯度98％)和氰基硼氢化钠(纯度95％)，冰醋酸(w/％≥99.5)。
分别配制100mM天然葡萄糖和1mM D-[13C6]葡萄糖储备液(浓度的计算考虑标准品的纯度)。取10μL、20μL、40μL、80μL、140μL、200μL、280μL、340μL、400μL 100mM天然葡萄糖储备液于2mL的EP管，每个EP管中加入等量70μL 1mM D-[13C6]葡萄糖储备液(以D-[13C6]葡萄糖作为示踪物和浓度内标物，终浓度为0.035mM)，加水稀释至2mL，涡旋混匀、充分平衡，制备得到不同浓度比的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖混合标准溶液。
衍生化反应：称取0.385g对氨基苯甲酸丁酯，0.625g氰基硼氢化钠于反应瓶中，加入4.63mL甲醇和0.375mL冰醋酸，混匀。取上述不同浓度比例的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖20μL于不同的进样小瓶中，分别加入100μL衍生化试剂混合溶液；在80℃条件下水浴加热反应1h，取出，冷却至室温。
纯化处理：用C18填料的固相萃取小柱纯化衍生化反应得到的混合样品，固相萃取小柱活化、平衡后，将样品转移至固相萃取小柱，用1mL乙腈-水(5:95，V/V)洗两次，再用1mL乙腈-水(30:70，V/V)洗脱，洗脱液收集于进样小瓶中，进行LC-MS/MS实验。
使用DataAnalysis 4.1(Bruker)软件对实验数据进行分析，选择特征碎片离子(m/z 284，290)EIC图谱，使用高斯拟合对色谱峰进行平滑处理并积分；根据EIC图谱峰面积，计算得到天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖的浓度比例，并与理论的摩尔浓度比例进行比较，结果显示较高的一致性(图3)。
实施例2：
测定健康食蟹猴和患糖尿病食蟹猴血浆样品中内/外源性葡萄糖的绝对浓度随时间的变化：
血浆样品处理和制备过程包括以下步骤：
(1)血浆样品沉淀蛋白处理：将血浆样品从-80℃冰箱取出，待血浆样品室温解冻、平衡后，吸取20μL血浆，加入80μL乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，在4℃下以12000×g离心10min，取上层清液，使用真空离心浓缩仪旋转干燥，再用20μL超纯水重溶解。
(2)衍生化反应：衍生化反应及后续纯化处理方法如实施例1。取20μL以上重溶解样品，加100μL混合衍生化试剂，于80℃水浴锅中反应1h。
结果表明，在3h内，健康食蟹猴和患糖尿病食蟹猴血浆中天然(内源性)葡萄糖浓度均呈持续下降的状态(图4A)。测试(0min)前未向实验食蟹猴补充外源性D-[13C6]葡萄糖，血浆中D-[13C6]葡萄糖浓度为0。0min开始滴注D-[13C6]葡萄糖(浓度为35μmol/mL)，先以0.25μmol/kg/min速率静脉滴注1h，随后以0.1875μmol/kg/min的速率滴注2h，食蟹猴血浆中D-[13C6]葡萄糖(外源性葡萄糖)浓度随时间呈波动性变化(图4B)。比较健康食蟹猴与患糖尿病食蟹猴血浆中内/外源性葡萄糖浓度的变化(图4A、4B)，可得出以下结论：比较健康与患病猴血浆中内源性葡萄糖水平(图4A)，糖尿病个体血浆中内源性葡萄糖(来源于肝糖分解)下降幅度更大，表明糖尿病个体肝糖分解受到抑制；在相同的D-[13C6]葡萄糖注射速率下，健康食蟹猴血浆中的D-[13C6]葡萄糖(外源性葡萄糖)浓度低于患糖尿病食蟹猴(图4B)，表明糖尿病猴外周肌肉组织对葡萄糖的利用率更低。

Claims (6)

1.一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，利用同位素稀释法精确测定血浆中内/外源性葡萄糖浓度，其特征在于该方法利用葡萄糖与对氨基苯甲酸发生席夫碱反应，生成物进一步还原，形成稳定衍生物，衍生物具有较高的质谱电喷雾离子化效率，同时利用D-[13C6]葡萄糖标记物作为示踪物质和浓度内标物，结合液质联用多反应监测技术，对生物体内葡萄糖的代谢过程进行定量化的分析。
2.根据权利要求1所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于该方法运用MRM二级质谱数据采集模式，选择性衍生化内/外源性葡萄糖后，四级杆选择特定母离子(m/z 358，364)进行碰撞诱导裂解，裂解发生于衍生化试剂羰基部位的标签上，提取特异性子离子(m/z 284，290)的EIC图，测定二者峰面积比例，计算血浆样品中内/外源性葡萄糖含量比例，能够降低血浆样品复杂基质中其它物质干扰，避免基质效应对定量测定的影响。
3.根据权利要求1所述的一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于，该方法利用衍生化反应提高质谱离子化效率，结合质谱多反应监测，具有高灵敏性，对葡萄糖具有高特异性，抗杂质干扰能力强。
4.根据权利要求1所述一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于，测定D-[13C6]/[12C6]葡萄糖衍生物目标子离子提取离子色谱图峰面积比例进行定量分析，能平衡基质效应的影响；衍生化后碰撞诱导裂解发生于衍生化试剂标签上，产生响应稳定的碎片离子，能够降低D-[13C6]/[12C6]葡萄糖由于同位素效应对诱导裂解产生的影响，定量准确度高。
5.根据权利要求1-4所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于该方法包括首先制备一系列浓度比例变化的D-葡萄糖和D-[13C6]葡萄糖混合物标准样品，考察该发明方法定量动态范围、准确性和稳健性：
使用试剂：无水D-葡萄糖，纯度99.8％；D-[13C6]葡萄糖，标记率99％，纯度98％；对氨基苯甲酸丁酯，纯度98％和氰基硼氢化钠，纯度95％；冰醋酸w/％≥99.5。
分别配制100mM天然葡萄糖和1mM D-[13C6]葡萄糖储备液，取10μL、20μL、40μL、80μL、140μL、200μL、280μL、340μL、400μL 100mM天然葡萄糖储备液于2mL的EP管，每个EP管中加入等量70μL 1mM D-[13C6]葡萄糖储备液(以D-[13C6]葡萄糖作为示踪物和浓度内标物，终浓度为0.035mM)，加水稀释至2mL，涡旋混匀、充分平衡，制备得到不同浓度比的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖混合标准溶液；
衍生化反应：称取对氨基苯甲酸丁酯，氰基硼氢化钠于反应瓶中，加入甲醇和冰醋酸，混匀，取上述不同浓度比例的天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖于不同的进样小瓶中，分别加入衍生化试剂混合溶液；在80℃条件下水浴加热反应1h，取出，冷却至室温；
纯化处理：用C18填料的固相萃取小柱纯化衍生化反应得到的混合样品，固相萃取小柱活化、平衡后，将样品转移至固相萃取小柱，用1mL乙腈-水，5:95，V/V洗两次，再用1mL乙腈-水，30:70，V/V洗脱，洗脱液收集于进样小瓶中，进行LC-MS/MS实验；
使用DataAnalysis 4.1Bruker软件对实验数据进行分析，选择特征碎片离子，m/z284，290EIC图谱，使用高斯拟合对色谱峰进行平滑处理并积分；根据EIC图谱峰面积，计算得到天然葡萄糖与D-[13C6]葡萄糖的浓度比例，并与理论的摩尔浓度比例进行比较，结果显示较高的一致性。
6.根据权利要求1-4所述的任一种测定内/外源性血糖浓度的同位素稀释LC-MS方法，其特征在于进一步测定健康生物体和患糖尿病生物体血浆样品中内/外源性葡萄糖的绝对浓度随时间的变化，血浆样品处理和制备包括下述步骤：
血浆样品沉淀蛋白处理：将血浆样品从-80℃冰箱取出，待血浆样品室温解冻、平衡后，吸取20μL血浆，加入80μL乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，在4℃下以12000×g离心10min，取上层清液，使用真空离心浓缩仪旋转干燥，再用20μL超纯水重溶解；
衍生化反应：衍生化反应及后续纯化处理方法如上所述，取20μL以上重溶解样品，加100μL混合衍生化试剂，于80℃水浴锅中反应1h；
比较健康生物体与患糖尿病生物体血浆中内/外源性葡萄糖浓度的变化，得出糖尿病生物体外周肌肉组织对葡萄糖的利用率更低，糖尿病个体血浆中内源性葡萄糖下降幅度更大。
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