CN101539550A

CN101539550A - 用于多糖的定性与定量分析方法

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Publication number: CN101539550A
Application number: CN200910031276A
Authority: CN
Inventors: 李绍平; 管佳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2029-04-28
Also published as: CN101539550B

Abstract

用于多糖的定性与定量分析方法，(1)多糖的酶解及验证：多糖水溶液以比色法测定含量；(2)经HPSEC－ELSD分析，比较酶解前、后多糖图谱的变化；(3)多糖酶解液中糖类成分直接HPLC分析或柱前衍生化后HPLC分析；以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比为参比，进行糖谱色谱峰识别；其稳定的特征片段，则用作定量分析指标；(4)通过上述各步骤的独立或联合应用，构建基于结构信息的多糖酶解响应特征和多糖酶解糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。此法可用于人参、三七、西洋参、冬虫夏草、蛹虫草、赤芝、紫芝、黄芪和当归等中药多糖的鉴别和定量测定，为多糖及其产品的质量控制提供了有效的方法。

Description

用于多糖的定性与定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种用于多糖的定性与定量分析方法。

背景技术

多糖是一类由10个以上单糖缩合去水，以糖苷键形式结合形成的多聚碳水化合物。作为一切生命有机体中必不可少的成分，它与维持生命的能量代谢及多种生理机能有着密切的联系。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖因其显著的生物活性如抗肿瘤[林梦感，等.中草药，2007，38：949-953.]、免疫调节[付书婕，等.时珍国医国药，2008，19：99-101.]、降血糖[罗祖友，等.食品科学，2007，28：596-600.]、抗氧化[陈旋，等.中国新药杂志，2007，16：1000-1004.]和抗炎抗病毒[丁保金，等.中国药学杂志，2004，39：561-563]等引起了人们广泛的关注。然而，由于多糖复杂的结构与组成，其质量控制长期以来未有突破。多糖的分子量、组成单糖、构象及糖苷键链接等与其活性密切相关，但如何快速准确地鉴别不同来源的多糖至今仍是多糖及其产品质量控制亟需解决的关键问题。

目前，通过结构解析进行多糖鉴别的方法繁琐费时、设备要求高、难度大、实用性差。虽有研究应用组成单糖特征和比例进行多糖鉴别，但酸水解的选择性差，酸性条件下单糖易被破坏损失而导致结果失真。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、准确的多糖定性、定量分析方法。本方法将克服现有技术繁琐费时、设备要求高、难度大、实用性差等不足。实现简便、实用的多糖定性、定量分析。

与酸水解相比，酶水解具有选择性好、特异性高、条件温和等特点，可获得特异性水解产物，特异性的内切酶水解特性能表征多糖的结构特征，从而有利于多糖的辨识。此外，酶解结合色谱分析形成的肽谱已广泛成为多肽和蛋白质鉴别的有力工具[闫妍，等.分析化学，2006，34：187-190.张素艳，等.高等学校化学学报，2002，23：1246-1250.]。有鉴于此，本发明提出应用多糖对不同糖苷水解酶的响应特征结合色谱分析，构建对应表征多糖结构信息的“糖谱”，实现多糖及其产品的快速、准确定性鉴别；并以特征片段为指标，实现多糖的定量分析。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，步骤如下：

(1)、多糖的酶解及验证：多糖水溶液以硫酸-苯酚比色法测定含量，调节糖含量，平行准备若干份多糖溶液，分别加入适量糖苷酶进行酶解，每1mg(以葡萄糖计)多糖所使用的酶的用量范围为3U～650U，每个酶解反应重复3～5次；此步骤用以，1)确定多糖的酶解特征；2)确认酶解作用的可重现性；

(2)、HPSEC-ELSD分析：多糖水溶液及其酶解物经HPSEC-ELSD分析，比较酶解前、后多糖图谱的变化；多糖图谱酶解前、后未发生明显变化记为阴性(-)响应；图谱中有特征峰的消失、减小，或者新色谱峰的出现则记为阳性(+)响应；

(3)、多糖酶解液中糖类成分直接HPLC分析或柱前衍生化后HPLC分析：多糖酶解残留片段和/或生成的寡糖及单糖，可用反相HPLC-ELSD分析获得糖谱；也可通过衍生化，改善糖类成分在反相柱上的分离效果和紫外吸收特性，提高紫外检测和质谱检测的灵敏度，进而提高定性、定量的准确性；以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比(m/z)为参比，进行糖谱色谱峰识别；其稳定的特征片段，则用作定量分析指标。

(4)、通过上述各步骤的独立或联合应用，即可构建基于结构信息的多糖酶解响应特征和多糖(酶解)糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。

本发明的用于多糖的定性与定量分析方法，是运用以下工作原理：

1、多糖对特异性糖苷酶的水解特征：采用高效体积排阻色谱(HPSEC)分析、比较多糖分别经不同糖苷酶如阿拉伯聚糖内切酶(endo-arabinanase，EC3.2.1.99)、木聚糖酶(xylanase，EC 3.2.1.8)、1，4-β-D-半乳聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-galactanase，EC 3.2.1.89)、纤维素酶(cellulase orendo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4)、果胶酶(pectinase orendopolygalacturonase，EC 3.2.1.15)、α-淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)、异淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)、1，3-β-葡聚糖内切酶(endo-1，3-β-D-glucanase，EC3.2.1.39)、昆布多糖酶(lichenase，EC 3.2.1.73)、β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)、1，3(4)-β-葡聚糖内切酶(endo-1，3(4)-β-glucanase，EC 3.2.1.6)、透明质酸酶(hyaluronidase，EC 3.2.1.35)和右旋糖酐酶(dextranase，EC3.2.1.11)等水解前、后HPSEC色谱图变化如多糖峰的消失或减小及新色谱峰(酶解产物)的出现，明确多糖对不同糖苷酶的水解响应特征；

2、糖谱分析：采用HPLC-ELSD直接分析上述多糖酶解物，或将上述酶解物经衍生化(如：还原胺化、与吡唑啉酮类、肼类试剂反应、氨基衍生化、羟基衍生化、羧基衍生化等)后，用HPLC-DAD-ELSD或HPLC-DAD-MS/MS分析，获得多糖酶解产物特征图谱-糖谱，以此定性鉴别多糖；以多糖酶解的特征片段为指标，选择如标准葡聚糖(dextran)、普鲁蓝多糖(pullulan)糖等多糖、纤维三糖至纤维六糖、葡萄三糖至六糖等寡糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳二糖等双糖或葡萄糖、半乳糖、甘露糖等单糖中任一化合物或纯化的酶解特征片段为对照品，实现针对多糖结构特征的定量分析。

更具体地和更优化地说，本发明的步骤如下：

步骤(1)，多糖的酶解及验证：多糖水溶液以苯酚-硫酸法测定含量，调节糖含量，平行准备若干份多糖溶液，分别加入适量糖苷酶进行酶解，酶解条件基于各酶使用手册推荐方法或优化后使用(见表1)，每个酶解反应重复3～5次。此步骤用以，1)确定多糖的酶解特征；2)确认酶解作用的可重现性。

表1多糖的酶解条件(基于Megazyme及Sigma公司糖酶的操作手册)

步骤(2)，HPSEC-ELSD分析：多糖水溶液及其酶解物经HPSEC-ELSD分析，比较酶解前、后多糖图谱的变化。多糖图谱酶解前、后未发生明显变化记为阴性(-)响应；图谱中有特征峰的消失、减小，或者新色谱峰的出现则记为阳性(+)响应。

步骤(3)，多糖酶解液中糖类成分直接HPLC分析或柱前衍生化后HPLC分析：多糖酶解残留片段和/或生成的寡糖及单糖，可用反相HPLC-ELSD分析获得糖谱；也可通过衍生化，改善糖类成分在反相柱上的分离效果和紫外吸收特性，提高紫外检测和质谱检测的灵敏度，进而提高定性、定量的准确性。以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比为参比，进行糖谱色谱峰识别。其稳定的特征片段，则用作定量分析指标。

通过上述技术方案的独立或联合应用，即可构建基于结构信息的多糖酶解响应特征和多糖(酶解)糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。

本发明的用于多糖的定性与定量分析方法，可用于人参、三七、西洋参、冬虫夏草、蛹虫草、赤芝、紫芝、黄芪和当归等中药多糖的鉴别和灵芝多糖的定量测定，为多糖及其产品的质量控制提供了有效的方法。

附图说明

图1、图2分别为实施例2中1，4-β-D-半乳聚糖酶水解三七和黄芪多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-DAD图；

图3、图4分别为实施例2中1，4-β-D-半乳聚糖酶水解三七和黄芪多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-MS图；

图5、图6、图7分别为实施例3中果胶酶水解西洋参、冬虫夏草和蛹虫草多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-DAD图；

图8、图9、图10分别为实施例3中果胶酶水解西洋参、冬虫夏草和蛹虫草多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-MS图；

图11、图12分别为实施例4中果胶酶水解灵芝和紫芝多糖的产物直接测定的HPLC-ELSD图；

图13、图14分别为实施例4中果胶酶水解灵芝和紫芝多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-DAD图；

图15、图16分别为实施例4中果胶酶水解灵芝和紫芝多糖的产物经PMP衍生化后的HPLC-ELSD图。

具体实施方式

实施例1：

中药多糖的提取：称取人参、三七、西洋参、冬虫夏草、蛹虫草、赤芝、紫芝、黄芪和当归9种中药药材粉末各0.5g，加20倍重量体积比的水100℃高温水回流提取1小时，提取液经离心分离得到上清液，取5mL上清液加无水乙醇至终浓度为75％，4℃下静置过夜沉淀，离心后沉淀经4mL 95％乙醇洗涤两次，60℃水浴上蒸干醇，残渣用5mL热水(60℃)复溶，离心取上清液得多糖提取液。以苯酚-硫酸比色法为定量参照，调节提取液至含糖相对含量为0.15mg/mL(以葡萄糖计)备用。

多糖的酶解：取多份1mL提取液分别加入阿拉伯聚糖内切酶、木聚糖酶、1，4-β-D-半乳聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-甘露聚糖酶、1，3-β-葡聚糖内切酶、昆布多糖酶、1，3(4)-β-葡聚糖内切酶、透明质酸酶、右旋糖酐酶至终浓度为1.4U/mL，4.5U/mL，9.4U/mL，10U/mL，95U/mL，12.5U/mL，10U/mL，0.5U/mL，4.6U/mL，10U/mL，5U/mL，5U/mL，5U/mL，混合液按推荐的水解条件(见表1)作用过夜(≥12小时)。水解液以85℃加热30分钟中止酶解过程。离心后上清液分别做HPSEC分析。

HPSEC-ELSD分析：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，配备有四元泵，自动进样系统和Agilent色谱工作站。色谱柱为TSK G-4000PW_XL凝胶柱(300mm×7.8mm i.d.，10μm)，柱温30℃；洗脱条件为20mmol/L醋酸铵水溶液等度洗脱，流速0.6mL/min；ELSD2000ES漂移管温度110℃，氮气载气流速3.0L/min，撞击器关闭；进样体积10μL。

检测结果，参照表2：基于各水提多糖对13种糖苷酶所表现出的水解响应特征可区分出人参多糖和当归多糖，以及另外三组：三七和黄芪多糖，西洋参、虫草和蛹虫草多糖，赤芝和紫芝多糖。

表2.酶解响应鉴别9种中药水提多糖

实施例2：

中药多糖的提取：称取三七和黄芪药材粉末各0.5g，其余操作同实施例1中多糖的提取步骤。

多糖的酶解：同实施例1。

HPSEC-ELSD分析：同实施例1。

多糖酶解液的PMP衍生化：中药多糖酶解液离心后取上清液600μL，与等体积氨水混合，再加入0.5mol/LPMP的甲醇溶液200μL，混匀密封，于70℃下反应30min。取出放冷至室温，加2mL水后摇匀，与50℃下蒸干，重复操作两次。残渣加1mL水溶解后以等体积氯仿萃取，反复三次，水层过0.45μm滤膜后供HPLC-DAD-MS分析。

HPLC-DAD-MS分析：Agilent 1200系列LC/MSD系统，配备有二元泵，自动进样系统，Agilent色谱工作站。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C₁₈，柱温25℃；流动相为20mmol/L醋酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为0～1min，13～15％B，1～40min，16％B；二级阵列管检测器，波长245nm；质谱检测器，电喷雾离子源，正离子检测模式，离子全扫描由m/z 100至1500，氮气干燥气流速8L/min，干燥温度350℃，雾化压力45psi，二级质谱分离宽度4，碎片扩增1.5，化合物稳定度50％；流速1.0mL/min；进样体积10μL。

检测结果，参照表2、图1至图4：三七和黄芪水提多糖对13种糖苷酶所表现出的水解响应特征近似。两者的酶解产物，以1，4-β-D-半乳聚糖酶酶解为例，经PMP衍生化后HPLC-DAD和HPLC-MS分析均可获得特征图谱用于鉴别。

实施例3：

中药多糖的提取：称取西洋参、虫草和蛹虫草药材粉末各0.5g，其余操作同实施例1中多糖的提取步骤。

多糖的酶解：同实施例1。

HPSEC-ELSD分析：同实施例1。

多糖酶解液的PMP衍生化：同实施例2。

HPLC-DAD-MS分析：同实施例2。

检测结果，参照表2、图5至图10：西洋参、冬虫夏草和蛹虫草水提多糖对13种糖苷酶所表现出的水解响应特征近似。三者的酶解产物，以果胶酶酶解为例，经PMP衍生化后HPLC-DAD和HPLC-MS分析均可获得特征图谱用于鉴别。

实施例4：

中药多糖的提取：称取赤芝和紫芝药材粉末各0.5g，其余操作同实施例1中多糖的提取步骤。

多糖的酶解：同实施例1。

HPSEC-ELSD分析：同实施例1。

HPLC-ELSD分析：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，配备有四元泵，自动进样系统和Agilent色谱工作站。色谱柱为Prevail^TM Carbohydrate ES色谱柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)，柱温25℃，流动相为水(A)和乙腈(B)，75％等度洗脱，流速1.0mL/min；ELSD2000ES漂移管温度110℃，氮气载气流速3.0L/min，撞击器关闭；进样体积10μL。

多糖酶解液的PMP衍生化：同实施例3。制备液供HPLC-DAD-ELSD分析。

HPLC-DAD-ELSD分析：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，配备有四元泵，自动进样系统和Agilent色谱工作站。色谱柱为Zorbax EclipseXDB-C₁₈，柱温25℃；流动相为20mmol/L醋酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，程序为0～1min，13～15％B，1～40min，16％B；二级阵列管检测器，波长245nm；ELSD2000ES漂移管温度110℃，氮气载气流速3.0L/min，撞击器关闭；进样体积10μL。

检测结果，参照表2、图11至图16：赤芝和紫芝水提多糖对13种糖苷酶所表现出的水解响应特征近似；但两者的果胶酶水解产物，直接HPLC-ELSD测定，或经PMP衍生化后HPLC-DAD-ELSD测定，均可获得特征图谱用于鉴别。

实施例5：

中药多糖的提取：称取赤芝药材粉末0.5g，其余操作同实施例1中多糖的提取步骤。

多糖的酶解：以果胶酶为水解酶，其余操作同实施例1中酶解步骤。

HPLC-ELSD分析：同实施例4。

定量分析结果，参照图11和图12：以A特征峰为指标，以标准葡萄糖为对照，可计算得能被果胶酶特异性水解的特征多糖占原药材的量为0.38mg/g。

Claims

1、一种用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，步骤如下：

(1)、多糖的酶解及验证：多糖水溶液以比色法测定含量，调节糖含量，平行准备若干份多糖溶液，分别加入适量糖苷酶进行酶解，每个酶解反应重复3～5次；

(2)、多糖酶解分析：多糖水溶液及其酶解物经HPSEC-ELSD分析，比较酶解前、后多糖图谱的变化；多糖图谱酶解前、后未发生明显变化记为阴性(-)响应；图谱中有特征峰的消失、减小，或者新色谱峰的出现则记为阳性(+)响应；

(3)、糖谱分析：多糖酶解液中酶解残留片段和/或生成的寡糖及单糖，用反相HPLC-ELSD直接分析获得糖谱；或通过柱前衍生化，改善糖类成分在反相柱上的分离效果和紫外吸收特性，提高紫外检测和质谱检测的灵敏度，进而提高定性、定量的准确性；以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比为参比，进行糖谱色谱峰识别；其稳定的特征片段，则用作定量分析指标；

(4)、通过上述各步骤的独立或联合应用，构建基于结构信息的多糖酶解响应特征和多糖酶解糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。

2、根据权利要求1所述的用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述的“以比色法测定含量”和“加入适量糖苷酶进行酶解”是指：苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法等糖类比色反应测定含量，以及使用包括阿拉伯聚糖内切酶、木聚糖酶、1，4-β-D-半乳聚糖内切酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、1，3-β-葡聚糖内切酶、昆布多糖酶、β-甘露聚糖酶、1，3(4)-β-葡聚糖内切酶、透明质酸酶和右旋糖酐酶等糖苷酶中任意两个或两个以上的组合对多糖进行酶解，每1mg多糖所使用的酶的用量范围为3U～650U。

3、根据权利要求1所述的用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述的糖谱分析是指：采用HPLC-ELSD直接分析上述多糖酶解物，或将上述酶解物经衍生化后，用HPLC-DAD-ELSD或HPLC-DAD-MS/MS分析，获得多糖酶解产物特征图谱-糖谱，以此定性鉴别多糖；以多糖酶解的特征片段为指标，选择适当的多糖或寡糖为对照品，实现针对多糖结构特征的定量分析。

4、根据权利要求3所述的用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解物的衍生化是指：还原胺化、与吡唑啉酮类、肼类试剂反应、氨基衍生化、羟基衍生化、羧基衍生化。

5、根据权利要求3所述的用于多糖的定性与定量分析方法，其特征在于，所述的“选择适当的多糖或寡糖”：是选自：标准葡聚糖、普鲁蓝多糖、纤维三糖至纤维六糖、葡萄三糖至六糖的寡糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳二糖，或葡萄糖、半乳糖、甘露糖等单糖中任一化合物或纯化的酶解特征片段为对照品，实现针对多糖结构特征的定量分析。