CN112062872B - 一种黄精均一多糖及制备方法和用途 - Google Patents
一种黄精均一多糖及制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黄精均一多糖及制备方法和用途,该黄精均一多糖总糖含量为95%以上,均一多糖的分子量为1‑70kDa。制备黄精均一多糖的方法,包括如下步骤:取干燥黄精,脱脂,提取,沉淀,干燥获得黄精多糖粗品;获得的黄精多糖粗品用蒸馏水溶解后,上样阴离子纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,获得黄精水洗组分多糖;获得的水洗组分多糖用凝胶色谱柱纯化,利用NaCl溶液洗脱,获得黄精均一多糖。该黄精均一多糖在体外抗氧化过程中的应用。本发明首次从黄精中提取分离获得黄精均一多糖并对其进行糖链测序。本发明制备方法简单,可以快速获得高纯度的均一多糖,适合于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及黄精应用技术领域,具体为一种黄精均一多糖及制备方法和用途。
背景技术
黄精(Polygonatum sibiricum)是百合科黄精属黄精的干燥根茎,我国传统中药,具有补气养阴、健脾润肺益肾之功效。中国药典收录的黄精品种有多种,主要为包括黄精、滇黄精和多花黄精。又名鸡爪参、黄鸡菜、鸡头黄精、老虎姜、笔管菜。黄精多糖是用黄精干燥的根茎,采用热水提取,乙醇沉淀得到的黄精粗多糖。黄精多糖(PSP)具有很好的生物活性,PSP能降血脂、延缓衰老,增强免疫力的生物功能。PSP能增强正常小鼠细胞、体液和单核-巨噬细胞免疫功能,增强正常小鼠免疫器官胸腺和脾脏的发育。公惠玲等通过应用STZ建立糖尿病模型鼠,检测黄精多糖可以介导空腹血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素及C肽的含量。且可以上调胰岛素、C肽的含量而降低糖尿病小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白。关于黄精多糖的报告比较多,且主要是叙述粗多糖及其药理活性。其结构不清晰,机制研究不清楚。
因此,方案从本源上控制黄精的品种,从提取分离纯化,化学结构表征以及功能应用,发现一种新型黄精多糖结构,进行了详细的介绍。同时筛选其均一多糖的抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄精均一多糖及制备方法和用途,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种黄精均一多糖,所述均一多糖的纯度为99%以上,均一多糖的分子量为1-70kDa;所述均一多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。
优选的,制备方法包括以下步骤:
A、取干燥黄精根茎,脱脂,提取,乙醇沉淀,干燥获得黄精多糖粗品;
B、对步骤A获得的黄精多糖粗品用蒸馏水溶解后,上样阴离子纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,获得黄精水洗组分多糖;
C、将步骤B获得的黄精水洗组分多糖用凝胶色谱柱纯化,利用NaCl溶液洗脱,获得黄精均一多糖。
优选的,所述步骤A中,首先对干燥的黄精进行乙醇脱脂操作,脱脂后的黄精进行热水提取和乙醇过夜沉淀操作。
优选的,所述步骤A如下具体操作:先对干燥的黄精进行乙醇回流脱脂,脱脂后的黄精鼓风干燥,热水提取2~5次,合并提取药液,进行浓缩,离心,收集上清液进行乙醇沉淀,干燥,获得黄精多糖粗品。
优选的,所述步骤A中,脱脂采用乙醇的质量分数为40~95%,脱脂时的物料比例为1:3~1:25,回流脱脂时间为1~24小时。
优选的,所述步骤A中,沉淀时采用乙醇沉淀,加入2~5倍体积的质量分数为90~100%的乙醇,搅拌后,直到最终乙醇的质量分数为75~85%,静置4~48小时,收集沉淀物。
优选的,对步骤A获得的黄精多糖粗品用水溶解后上阴离子交换纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,苯酚-硫酸法实时监测,制作洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖溶液,采用旋转蒸发仪进行浓缩,6000-10000Da透析袋流水透析,冷冻干燥,获得黄精水洗组分多糖。
优选的,一种药物组合物,该药物组合物包含上述黄精均一多糖。
优选的,一种黄精均一多糖的用途,该黄精均一多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明首次从中药黄精中提取分离获得黄精均一多糖,并对其进行精准的结构鉴定,多糖糖链序列测定。同时黄精均一多糖能够显著性的抗氧化作用。本发明制备方法简单,可以快速获得高纯度的均一多糖,适合于规模化生产。
附图说明
图1是黄精多糖水洗脱的凝胶分离柱的色谱图。
图2是黄精均一多糖的高效凝胶色谱图。
图3是黄精均一多糖的红外谱图。
图4是黄精均一多糖的单糖组成谱图。
图5是黄精均一多糖的甲基化图。
图6是黄精均一多糖的碳谱分析图。
图7是黄精均一多糖的DPPH自由基清除能力测定图。
图8是黄精均一多糖的铁离子还原能力测定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案:一种黄精均一多糖,所述均一多糖的纯度为99%以上,均一多糖的分子量为1-70kDa;所述均一多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。
本发明的制备方法包括以下步骤:
A、取干燥黄精根茎,脱脂,提取,乙醇沉淀,干燥获得黄精多糖粗品;
B、对步骤A获得的黄精多糖粗品用蒸馏水溶解后,上样阴离子纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,获得黄精水洗组分多糖;
C、将步骤B获得的黄精水洗组分多糖用凝胶色谱柱纯化,利用NaCl溶液洗脱,获得黄精均一多糖。
本发明步骤A中,首先对干燥的黄精进行乙醇脱脂操作,脱脂后的黄精进行热水提取和乙醇过夜沉淀操作。
本发明步骤A如下具体操作:先对干燥的黄精进行乙醇回流脱脂,脱脂后的黄精鼓风干燥,热水提取2~5次,合并提取药液,进行浓缩,离心,收集上清液进行乙醇沉淀,干燥,获得黄精多糖粗品。
本发明步骤A中,脱脂采用乙醇的质量分数为40~95%,脱脂时的物料比例为1:3~1:25,回流脱脂时间为1~24小时。
本发明步骤A中,沉淀时采用乙醇沉淀,加入2~5倍体积的质量分数为90~100%的乙醇,搅拌后,直到最终乙醇的质量分数为75~85%,静置4~48小时,收集沉淀物。
本发明中,对步骤A获得的黄精多糖粗品用水溶解后上阴离子交换纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,苯酚-硫酸法实时监测,制作洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖溶液,采用旋转蒸发仪进行浓缩,6000-10000Da透析袋流水透析,冷冻干燥,获得黄精水洗组分多糖。
实施例:
黄精均一多糖的制备与鉴定
A、取干燥黄精2KG,加入10L碱水(0.2M NaOH),在煮沸的条件下,提取3次,酸中和,后加入4倍体积的乙醇进行醇沉,24小时,过滤,收集沉淀物进行干燥,除去残留乙醇。
B、取制得的多糖粗品10g,加入100mL蒸馏水溶解,上样于氯型阴离子交换树脂DE-52层析柱,使用蒸馏水洗脱,使用硫酸-苯酚法检测糖含量并在酶标仪490nm处检测,获得洗脱曲线,收集含糖溶液,干燥,用8000Da的透析袋透析24小时后,冷冻干燥,制得黄精水洗多糖。
C、获得的黄精水组分多糖用0.2mol/L的NaCl溶液溶解,离心,取上清液过0.22μm的滤膜,上样。用0.2mol/L的NaCl溶液的氯化钠溶液进行洗脱,利用示差检测器进行检测,根据峰形(见图1)进行收集、浓缩。采用1000Da的透析袋进行透析,即获得均一黄精均一多糖,简称HJW。
纯度与分子量测定:
采用高效液相凝胶色谱法(HPGPC):色谱柱为BRT105-104-102,检测器为示差检测器,流动相是0.05mol/L氯化钠溶液,柱温40℃,流速:0.6mL/min,进样体积:20uL。
精密称取样品和标准品,样品配制成5mg/ml溶液,12000rpm离心10min,上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤,然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中,进样量20μl。仪器流动相为0.05M氯化钠溶液,流速为0.6mL/min。以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw1152、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800)作为标准品,做出标准曲线,测定多糖的纯度及相对分子质量。
得到lgMp-RT(峰位分子量),lgMw-RT(重均分子量),lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为:y=-0.1878x+11.994R2=0.9967;
lgMw-RT校正曲线方程为:y=-0.2022x+12.648R2=0.9954;
lgMn-RT校正曲线方程为:y=-0.182x+11.7R2=0.9965。
根据标准品曲线,得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。图2获得黄精多糖的高效液相凝胶色谱图(HPGPC),图中为单一对称峰,表明为均一多糖。通过公式计算出HJW多糖的峰位分子量为43.0kDa;重均分子量为53.0kDa和数均分子量36.8kDa。
红外分析:
通过FT-IR分析多糖的官能团。
精密称取样品2mg和溴化钾200mg,压制成片,空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650进行扫描记录。
结果:如图3所示,多糖组分的红外结果。黄精多糖在3600-3200cm-1区域内有一个糖类特征吸收峰3394cm-1归属于-OH的伸缩振动,在2925cm-1处的吸收峰,归属于多糖-CH2-,-CH3和-CHOH中的C-H伸缩振动。而在1412cm-1处的吸收峰可归属于亚甲基的弯曲振动。另外,在1243cm-1的吸收峰主要是由C-O伸缩振动引起的。而在1200-1000范围内的吸收峰,尤其是1052cm-1的吸收峰,主要是由C-O-C,C-O-H,C-C和糖环的伸缩振动引起的,表明该组分为吡喃糖环。
单糖组成分析:取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液。
取各单糖标准溶液精密配置0.1、0.5、1、5、10、20、50mg/L梯度浓度标准品作为Standard 1-7。根据绝对定量方法,测定不同单糖质量,根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。
样品准备:取各样品5mg左右于安瓿瓶中,加入2M TFA 10ml,120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干,加入5ml水涡旋混匀,吸取100uL加入900uL去离子水,12000rpm离心5min。取上清进IC分析。
色谱方法:色谱柱:DionexCarbopacTMPA20(3*150);流动相:A:H2O;B:250mMNaOHC:50mMNaOH&500mM NaOAC;流速:0.3ml/min;进样量:5μL;柱温:30℃;检测器:电化学检测器。
多糖甲基化分析:称取冷冻干燥后的黄精多糖10mg,加入2mL的二甲基亚砜,然后加入NaOH粉末,用锡箔纸包裹试管,避光操作。然后加入碘甲烷试剂,冰浴条件下反应。最后加水终止反应,透析冻干。取完全甲基化的多糖1-2mg,加入2mL的2M三氟乙酸水解2h。旋蒸蒸干到无酸味,然后加入适量的硼氢化钠还原过夜,旋蒸蒸发到粘稠状,然后加入甲醇2-5mL,反复蒸干3次。然后加入乙酸酐,乙酰化,水中和。最后采用气相质谱联用仪进行分析。
GC-MS条件:RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25;程序升温条件为:起始温度120℃,以4℃/min升温至280℃/min;保持5min;进样口温度为250℃,检测器温度为250℃/min,载气为氦气,流速为1mL/min。
黄精多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析(表1)
通过甲基化分析,我们可以获得黄精多糖有13种糖苷键,见表格1;链接方式为分别为:Araf-(1→、Arap-(1→、→3,4)-Rhap-(1→、→5)-Araf-(1→、Galp-(1→、→3)-Rhap-(1→、→2,4)-Rhap-(1→、→4)-Galp-(1→、→3)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4)-Galp-(1→、→4,6)-Galp-(1→和→3,6)-Galp-(1→。摩尔比分别为0.056:0.005:0.004:0.072:0.077:0.049:0.020:0.591:0.011:0.007:0.017:0.061:0.030。表明该多糖可能为主链为→5)-Araf-(1→4)-Galp-(1→组成的阿拉伯半乳葡聚糖,更多信息需要通过解析NMR进一步确定。
核磁碳谱分析:精密称取黄精多糖45mg,加入氘代水溶解,然后冷冻干燥。再一次加入氘代水500ul,然后采用核磁共振仪器600MHz进行波谱采集。
结果显示:β-D-Galp-1-4的C1、C2、C3、C4、C5和C6信号分别为105.71、73.21、74.67、79.01、75.90和62.11ppm;α-L-Araf-1-5的C1、C2、C3、C4和C5信号分别为108.88、82.18、78.12、83.68和68.27ppm;α-L-Araf-1的C1、C2、C3、C4和C5信号分别为110.62、82.62、77.93、85.26和62.49ppm;综上所述,可以推断出该黄精多糖主要为Alpha阿拉伯糖1-5和β半乳糖1-4组成的阿拉伯半乳葡聚糖,通过阿拉伯糖Rha的O-4连接少量支链。
黄精均一多糖的抗氧化活性实验:
DPPH自由基清除能力测定:FeSO4溶液:称取FeSO4(分子量152)136.8mg加入到100ml去离子水中,充分溶解,即得9mM。水杨酸及过氧化氢(9mM)各100Ml。
阳性对照溶液:取抗坏血酸2mg用1ml去离子水配置成母液2mg/ml,依次稀释得到4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml、0共8个浓度。样品1ml,加入硫酸亚铁(9mM,1ml)、过氧化氢(9mM,1ml)充分混合后,置于37条件下反应30min。然后加入1ml的水杨酸(9mM)37条件下不断摇晃反应30min。于510nm下测定吸光度。清除率计算公式为:
As是样品的吸光度值,A0是空白对照组,Aj是本底对照组。
结果表明:黄精均一多糖能够清除OH自由基,具有抗氧化作用,当多糖浓度达到4mg/ml的时候,清除率达到30%左右。
铁离子还原能力测定:
用0.1M PBS(pH6.6)的混合溶液配制多糖样品溶液(0.25-2.0mg/ml),取200μL样品溶液,加入200μL铁氰化钾(水配置成1%w/v),于50℃水浴反应20min。待冷却后,加入200μL三氟乙酸(水配置成10%w/v)后混合。3000rpm离心10min后,取100μL上清液置于96-孔板内,然后加入10μL三氯化铁溶液(水配0.1%w/v)反应2min。得到的普鲁士蓝溶液于700nm条件下进行吸光度测定。
FRAP activity(%)计算如下:
其中Asample是样品的吸光度,AAA(plateau)是抗坏血酸吸光度达到平衡时的最大值。Aj是本底对照。
结果显示:该多糖具有铁离子还原能力,当浓度达到4mg/ml,对铁离子的还原率达到20%左右。
综上所述,本发明首次从中药黄精中提取分离获得黄精均一多糖,并对其进行精准的结构鉴定,多糖糖链序列测定。同时黄精均一多糖能够显著性的抗氧化作用。本发明制备方法简单,可以快速获得高纯度的均一多糖,适合于规模化生产。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:所述均一多糖的纯度为99%以上,均一多糖的分子量为1-70kDa;所述均一多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成,其制备方法包括以下步骤:
A、取干燥黄精2KG,加入10L 0.2M NaOH,在煮沸的条件下,提取3次,酸中和,后加入4倍体积的乙醇进行醇沉,24小时,过滤,收集沉淀物进行干燥,除去残留乙醇;
B、取制得的多糖粗品10g,加入100mL蒸馏水溶解,上样于氯型阴离子交换树脂DE-52层析柱,使用蒸馏水洗脱,使用硫酸-苯酚法检测糖含量并在酶标仪490nm处检测,获得洗脱曲线,收集含糖溶液,干燥,用8000Da的透析袋透析24小时后,冷冻干燥,制得黄精水洗多糖;
C、获得的黄精水组分多糖用0.2mol/L的NaCl溶液溶解,离心,取上清液过0.22μm的滤膜,上样,用0.2mol/L的NaCl溶液的氯化钠溶液进行洗脱,利用示差检测器进行检测,根据峰形进行收集、浓缩,采用1000Da的透析袋进行透析,即获得均一黄精均一多糖,简称HJ W。
2.根据权利要求1所述的一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:所述步骤A中,首先对干燥的黄精进行乙醇脱脂操作,脱脂后的黄精进行热水提取和乙醇过夜沉淀操作。
3.根据权利要求1所述的一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:所述步骤A如下具体操作:先对干燥的黄精进行乙醇回流脱脂,脱脂后的黄精鼓风干燥,热水提取2~5次,合并提取药液,进行浓缩,离心,收集上清液进行乙醇沉淀,干燥,获得黄精多糖粗品。
4.根据权利要求1所述的一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:所述步骤A中,脱脂采用乙醇的质量分数为40~95%,脱脂时的物料比例为1:3~1:25,回流脱脂时间为1~24小时。
5.根据权利要求1所述的一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:所述步骤A中,沉淀时采用乙醇沉淀,加入2~5倍体积的质量分数为90~100%的乙醇,搅拌后,直到最终乙醇的质量分数为75~85%, 静置4~48小时,收集沉淀物。
6.根据权利要求1所述的一种制备黄精均一多糖的方法,其特征在于:对步骤A获得的黄精多糖粗品用水溶解后上阴离子交换纤维素层析柱,蒸馏水进行洗脱,苯酚-硫酸法实时监测,制作洗脱曲线,根据洗脱曲线收集糖溶液,采用旋转蒸发仪进行浓缩,6000-10000Da透析袋流水透析,冷冻干燥,获得黄精水洗组分多糖。
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