CN114957497A - 一种滇龙胆酸性多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种滇龙胆酸性多糖及其制备方法与应用，所述滇龙胆酸性多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸组成，摩尔比为1.126：8.349：34.857：28.260：16.426：2.117：4.268：0.897：2.162：1.537。该酸性多糖具有较高的抗炎和抗氧化活性以及较低的毒副作用，其中，在浓度为25μg/mL时已经初步对TNF‑α及IL‑6的分泌水平有抑制作用，在浓度为6.4 mg/mL时具有40.36%的VC的DPPH自由基清除能力；在浓度为6.4 mg/mL时具有50.23%的VC的超氧自由基清除能力；在浓度为6.4 mg/mL时具有52.94%的VC的羟自由基清除能力，适用于低毒高效的抗炎及抗氧化药品的开发中，有利于滇龙胆资源的进一步开发利用。本发明制备酸性多糖的方法操作简单、成本低廉，值得推广应用。

Description

一种滇龙胆酸性多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种滇龙胆酸性多糖及其制备方法与应用。
背景技术
滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）为龙胆科龙胆属多年多年生宿根小草本植物，是我国常用中药之一，具有清热燥湿，泻肝胆火等功效，关于其化学成分和药理活性的研究越来越多，但未见关于其多糖成分的研究报道。
多糖具有多种生理功能，广泛参与细胞识别、胚胎发育、细胞分化、生长、代谢、病毒感染、免疫应答等生命活动，具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗突变、抗病毒、降血糖、抗溃疡、降血脂等生物活性，在药品及保健食品领域有很多的研究与应用。
为了进一步开发利用滇龙胆，本发明旨在提供一种于滇龙胆中提取的活性酸性多糖。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种滇龙胆酸性多糖，本发明的第二目的是提供一种滇龙胆酸性多糖的制备方法，本发明的第三目的是提供一种滇龙胆酸性多糖的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述滇龙胆酸性多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸组成，摩尔比为1.126：8.349：34.857：28.260：16.426：2.117：4.268：0.897：2.162：1.537。
本发明的第二目的是这样实现的，所述滇龙胆酸性多糖的制备方法按以下步骤实现：
（1）将干燥的滇龙胆药材，粉碎为粗粉，过3号筛（50目筛），石油醚索氏回流脱脂2-3次后，以80-85℃水提，每次提取2.5-3h，提取次数为2-3次，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
（2）将步骤1得到的浸膏以无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共5-6次，直至离心再无沉淀，减压浓缩，冷冻干燥，得到滇龙胆粗多糖；
（3）将步骤2得到的滇龙胆粗多糖用蒸馏水溶解，离心过滤后，采用DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化，以NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，经透析、浓缩后得到酸性多糖；
本发明的第三目的是这样实现的，所述滇龙胆酸性多糖的应用为作为活性成分或者是药用载体在制备抗炎症药物或护肤品中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种从滇龙胆中提取的酸性多糖，该酸性多糖具有较高的抗炎和抗氧化活性以及较低的毒副作用，其中，在浓度为25μg/mL时已经初步对TNF-α及IL-6的分泌水平有抑制作用，在浓度为6.4 mg/mL时已经具有了40.36 % 的VC的DPPH自由基清除能力；在浓度为6.4 mg/mL时已经具有了50.23 % 的VC的超氧自由基清除能力；在浓度为6.4mg/mL时已经具有了52.94 % 的VC的羟自由基清除能力，适用于低毒高效的抗炎及抗氧化药品的开发中，有利于滇龙胆资源的进一步开发利用。
（2）本发明制备酸性多糖的方法操作简单、成本低廉，值得推广应用。
附图说明
图1为滇龙胆酸性多糖GAP-C的葡萄糖标准曲线（y=0.0138x-0.0265 (R2=0.9946)）；
图2为滇龙胆酸性多糖GAP-C的纤维素阴离子交换柱分离谱图；
图3为滇龙胆酸性多糖GAP-C的气质联用色谱仪数据图；
图4为滇龙胆酸性多糖GAP-C的总离子流图；
图5为滇龙胆酸性多糖GAP-C的红外光谱图
图6为滇龙胆酸性多糖GAP-C细胞活力检测示意图；
图7为滇龙胆酸性多糖GAP-C抑制脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-6的作用示意图；
图8为滇龙胆酸性多糖GAP-C抑制脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞产生促炎细胞因子TNF-α的作用示意图；
图9为滇龙胆酸性多糖GAP-C及维生素C对DPPH自由基的清除作用的曲线图；
图10为滇龙胆酸性多糖GAP-C及维生素C对超氧自由基的清除作用的曲线图；
图11为滇龙胆酸性多糖GAP-C及维生素C对羟自由基的清除作用的曲线图；
图12为文献中龙胆多糖GSP及维生素C对超氧阴离子自由基（a图）和羟自由基的清除作用的曲线图（b图）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种滇龙胆酸性多糖，所述滇龙胆酸性多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸组成，摩尔比为1.126：8.349：34.857：28.260：16.426：2.117：4.268：0.897：2.162：1.537。
本发明滇龙胆酸性多糖的制备方法按以下步骤实现：
1）将干燥的滇龙胆药材粉碎为粗粉，过3号筛（50目筛），石油醚索氏回流脱脂2-3次后，以80-85℃水提，每次提取2.5-3h，提取次数为2-3次，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
2）将步骤1得到的浸膏以无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共5-6次，直至离心再无沉淀，减压浓缩，冷冻干燥，得到滇龙胆粗多糖；
3）将步骤2得到的滇龙胆粗多糖用蒸馏水溶解，离心过滤后，采用DEAE SepharoseFast Flow阴离子交换层析纯化，以0.2mol/L NaCl洗脱，收集洗脱液，经透析、浓缩后得到目标酸性多糖。
步骤1中，石油醚索氏回流脱脂的温度为60-90℃，石油醚的加入量为滇龙胆药材重量的6-8倍（V:m=6-8）。
步骤1中，热水煮提的温度为80-85℃。
步骤2中，无水乙醇浓度为100%，乙醇的加入量为所述浸膏的2-3倍（V:m=2-3）。
步骤3中，透析时的截流分子量为3400 Da。
本发明滇龙胆酸性多糖的应用为作为活性成分或者是药用载体在制备抗炎症药物中的应用。
所述应用将所述滇龙胆多糖加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
实施例1
将1kg滇龙胆药材粉碎后，60 ℃下用6 L石油醚索氏回流脱脂3次。将脱脂后的滇龙胆药材烘干，除去残留的石油醚，之后加入10 L80℃的热水进行煮提，每次提取2.5小时，共提取2次，合并提取液，减压浓缩。将浓缩后的浸膏以2倍体积无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共5次，直至离心再无沉淀。最后将除蛋白后的多糖减压浓缩，冷冻干燥，得到90.86g滇龙胆粗多糖。
利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化所述滇龙胆粗多糖（分离图谱如图2所示），取所述滇龙胆粗多糖10 .02 g溶于少量蒸馏水中，配制成30 mg/mL，4000rpm离心12min，上清液用0.45 μm滤头过滤，上样；用0.2 mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱5倍柱体积，流速为1 mL/min，接洗脱液，减压浓缩至1/15的体积；浓缩后的洗脱液装于分子量3400 Da的透析袋中，放于蒸馏水中透析24 h，每5 h换一次水；得到的洗脱液冷冻干燥得0.98 g滇龙胆酸性多糖，得率为9.8%。
实施例2
将1kg滇龙胆药材粉碎后，70 ℃下用7 L石油醚索氏回流脱脂3次。将脱脂后的滇龙胆药材烘干，除去残留的石油醚，之后加入12 L 85℃的热水进行煮提，每次提取2.5小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩。将浓缩后的浸膏以2.5倍体积无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共6次，直至离心再无沉淀。最后将除蛋白后的多糖减压浓缩，冷冻干燥，得到110.08 g滇龙胆粗多糖。
利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化所述滇龙胆粗多糖：取所述滇龙胆粗多糖10.06g溶于少量蒸馏水中，配制成30 mg/mL，5000rpm离心8min，上清液用0.45 μm滤头过滤，上样；用用0.3 mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱5倍柱体积，流速为0.9mL/min，接洗脱液，减压浓缩至1/16的体积；浓缩后的洗脱液装于分子量3400 Da的透析袋中，放于蒸馏水中透析24 h，每3 h换一次水；得到的洗脱液冷冻干燥得1.18 g滇龙胆酸性多糖，得率为11.73%。
实施例3
将1kg滇龙胆药材粉碎后，80℃下用8 L石油醚索氏回流脱脂3次。将脱脂后的滇龙胆药材以12 L 85℃的热水进行煮提，每次提取3小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩。将浓缩后的浸膏以3倍体积无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共6次，直至离心再无沉淀。最后将除蛋白后的多糖减压浓缩，冷冻干燥，得到150.09 g滇龙胆粗多糖。
利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化所述滇龙胆粗多糖：取所述滇龙胆粗提物10.12 g溶于少量蒸馏水中，配制成35 mg/mL的溶液，于4500rpm下离心9min，上清液用0.45 μm滤头过滤，上样；用0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱6倍柱体积，流速为0.8 mL/min，接洗脱液，减压浓缩至1/10的体积；浓缩后的洗脱液装于分子量3400 Da的透析袋中，放于蒸馏水中透析28 h，每7 h换一次水；得到的洗脱液冷冻干燥得1.56g滇龙胆酸性粗多糖，得率为15.42%。
将本发明制备得到的滇龙胆酸性多糖命名为GAP-C，以下以实施例1为例，对GAP-C进行结构及活性等分析检测。
试验例1 滇龙胆酸性多糖GAP-C中多糖的含量测定
测定方法：苯酚-硫酸法
（1）6%苯酚溶液的配制：准确称量苯酚固体15g，加入250mL蒸馏水于60℃水浴下充分溶解，用棕色磨口瓶避光保存备用。
（2）0.1mg/mL GAP-C溶液的制备：准确称量滇龙胆酸性多糖10mg，加蒸馏水定容至100mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL的GAP-C溶液，待测。
（3）0.1mg/mL 葡萄糖标准溶液的配制：准确称量葡萄糖标准品10mg，加蒸馏水定容至100mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，待用。
（4）葡萄糖标准曲线的绘制：用移液枪分别量取葡萄糖标准溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于12mL玻璃试管中，加蒸馏水补至1mL，每个浓度3个重复。接下来向每个试管中加入0.5mL 6%的苯酚溶液，继续缓慢加入2.5mL浓硫酸，快速震荡试管，自然冷却待其颜色变化稳定后，于490nm波长下测量其吸光度。以葡萄糖标准品质量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。
（5）多糖样品的含量测定：取1mL 0.1mg/mL GAP-C溶液，加入0.5 mL 6 %苯酚溶液，2.5 mL浓硫酸溶液，于490 nm波长下测量其吸光度。根据标准曲线计算出滇龙胆酸性多糖的含量。
表1 苯酚-硫酸法测定实施例2制备的GAP-C的吸光度
Figure 578945DEST_PATH_IMAGE001
结果如表1所示，可知本实施例制得的多糖含量为90.65%。
试验例2 滇龙胆酸性多糖GAP-C单糖组成鉴定
鉴定方法：分别准确称取实施例1中制备得到的GAP-C及各单糖标准品（岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、果糖（Fru）、核糖（Rib）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、甘露糖醛酸（ManUA）、古罗糖醛酸（Gul-UA）各2 mg至各血清瓶中，其中单糖标准品进行单标及混标的衍生化反应。称取10 mg盐酸羟胺及1 mg内标肌醇，然后加入2 mL吡啶，于90 ℃条件下反应30min，待其自然冷却后，再加入2 mL醋酸酐，拧紧瓶盖于90 ℃条件下反应30 min，待反应结束自然冷却后加入2 mL蒸馏水终止反应。向衍生化反应后的样品中加入2 mL二氯甲烷，充分震荡后让其静置分层，吸取下层溶液转移至25 mL蒸馏烧瓶中，再用1 mL二氯甲烷重复萃取1次，将两次萃取的溶液减压浓缩至干以除去多余水分，过0.22 μm有机滤膜，待进行GC-MS联用色谱检测。将各保留时间与单糖标准品比对后（图3），可确定其所含的单糖组成岩藻糖：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸=1.126：8.349：34.857：28.260：16.426：2.117：4.268：0.897：2.162：1.537。
试验例3 滇龙胆酸性多糖GAP-C甲基化分析
称取10mg GAP-C，加入1mL一级水溶解，加入1mL 100mg/mL碳二亚胺，反应2h，继续加入1mL 2M的咪唑，将样品平均分为两份，分别加入1mL 30 mg/mL 的NaBH4和1mL 30mg/mL的NaBD4，反应3h，后加入100 μL冰醋酸终止反应。透析样品48h，透析完成后冷冻干燥样品。对冻干样品进行甲基化处理，于冻干样品中加入500μL DMSO溶解，加入1mg NaOH，孵育30min，继续加入50μL碘甲烷溶液反应1h，后加入1mL水和2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次，吸取下层二氯甲烷相并蒸干。继续加入100μL 2M TFA，121℃反应90min后于30℃下蒸干，之后加入50μL 2M 氨水，50μL 1M NaBD4，混匀，室温下反应2.5h后，加入20μL乙酸终止反应，氮气吹干，250μL甲醇洗两次，氮气吹干。加入乙酸酐250μL，涡旋混匀，100℃反应2.5h，继续加入1mL水静置10 min，再加入500μL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次，反应完成后取下层二氯甲烷相，待测。
色谱系统采用的是Agilent气象色谱系统（Agilent 7890A；AgilentTechnologies，USA），根据化合物的性质，进样量为1μL，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3min。质谱系统采用的是美国Aiglent公司的四极杆质谱检测系统（Agilent 5977B；Agilent Technologies，USA），配有电子轰击离子源（EI）和MassHunter工作站。采用电子轰击离子源（EI），分析物在全扫描（SCAN）模式下进行检测，质量扫描范围(m/z): 30-600。将样品溶液按照上述色谱、质谱条件进样检测，获得多糖甲基化后特征性碎片，根据已有的数据库进行对比，进而确认其键合方式，GAP-C的主要衍生物为2,3,5-Me3-Ara(f)、2,3-Me2- Ara(f)以及2,3,6-Me3-Gal(p)组成，主要连接方式为1→)-Ara、1→)-Ara-(5→ 以及1→)- Gal -(4→为主。结果如表2所示（图4）：
表2 GAP-C衍生物及键合方式
Figure 393318DEST_PATH_IMAGE002
试验例4滇龙胆酸性多糖GAP-C红外分析
试验方法：称取 2 mg GAP-C与 KBr 充分混合研磨后压成薄片于 FTIR 仪中进行检测，检测波长为 4000 nm-400 nm。
测定结果如图5所示，3406.51cm-1处的信号峰是-OH伸缩振动产生的；2934.53cm-1处的信号峰是C-H伸缩振动产生的；1744.30cm-1和1615.31 cm-1处的信号峰是C=O的非对称产生的；1410.10cm-1处的吸收峰是C-O伸缩振动产生的；1234.20cm-1处的信号峰是C-H的弯曲振动；1099.61 cm-1、1078.83cm-1、1020.20cm-1处的信号峰（1000 cm-1~1200 cm-1）这个区域是两种CO伸缩振动产生的，分别是C-O-H和糖环的C-O-C；920.52 cm-1处的吸收峰是β型糖苷键的特征峰；829.64 cm-1处的信号吸收峰是吡喃糖α-端基差向异构的C-H变角振动；762.21cm-1是吡喃环的对称环伸缩振动。
试验例5 GAP-C细胞活力检测
试验方法：RAW264.7细胞于DMEM（含10 % FBS，1 %青霉素-链霉素）培养于37 ℃含5 % CO2的培养箱。实验分组如下：正常对照组（NC）、0.1 μg/mL LPS处理组（阳性对照组）及不同浓度的滇龙胆酸性多糖均一组分GAP-C（10-1000μg/mL）处理组，每个分组设置6个复孔。将细胞接种于96孔培养板中，接种浓度为1×105个/mL，每孔100μL，培养24小时后，吸弃原培养基，正常组加入DMEM培养基，其余各组加入对应浓度的药物，培养24h后，加入10μLCCK8试剂，于培养箱中培养1.5小时后，450nm下用酶标仪检测吸光度，实验重复3次。细胞活力计算公式如下：
细胞存活率=（As−Ab）/（Ac−Ab）×100%
（As：实验孔、Ac：对照孔、Ab：空白孔）。
测定结果如图6所示，与NC组细胞对比GAP-C（10-1000μg/mL）处理组细胞活力均上升，且GAP-C剂量在10μg/mL-50μg/mL 最为显著（P＜0.0001）。
结果分析：上述试验结果表明GAP-C可以促进巨噬细胞RAW264.7的增殖，且无毒副作用。
试验例6 GAP-C抗炎活性测定
试验方法：将RAW264.7接种于96孔板中，接种浓度为1×105个/mL，每孔100uL。培养24小时后，设置正常对照组（NC）、1 μm/L 地塞米松处理组（阳性对照组）、0.1ug/mLLps（模型组）及不同浓度GAP-C（25-100μg/mL）每个浓度设置4个复孔，正常组和模型组给予完全培养基,每个药物组每孔给予100uL的含药培养基培养24h。24小时后，吸弃细胞上清，正常组加入DMEM培养基，其余各组均加入0.1 μg/mL LPS，每孔0.1mL，培养12小时后，收集细胞上清液，进行ELISA法检测细胞上清中的TNF-α及IL-6的水平。
检测结果如图7和图8所示，其中，数据为三个独立实验的平均值±SD。单用脂多糖可显著诱导RAW 264.7巨噬细胞产生TNF-α和IL-6(P<0.0001)。相反，GAP-C治疗以剂量依赖的方式抑制这些LPS刺激的促炎细胞因子的分泌(图8-9，p<0.0001)。
注：与MC组（模型对照组）相比，“**”表示P＜0.01，“***”表示 P<0.001，“****”表示 P<0.0001。
实验结果：
1、图7为IL-6指标检测结果，由图可见，模型组为经过脂多糖刺激的巨噬细胞产生大量的促炎细胞因子IL-6，经过浓度为1μm/L的阳性药物地塞米松干预后有显著降低IL-6分泌，GAP-C在浓度为25μg/mL时已经初步对IL-6的浓度分泌有抑制作用，在浓度为100 μg/mL的时候，可以极显著抑制由LPS刺激引起的IL-6的浓度分泌。
2、图8为TNF-α指标检测结果，由图可见，模型组为经过脂多糖刺激的巨噬细胞产生大量的促炎细胞因子TNF-α，经过浓度为1μm/L的阳性药物地塞米松干预后有显著降低TNF-α分泌，GAP-C在浓度为25μg/mL时已经初步对TNF-α的浓度分泌有抑制作用，在浓度为100μg/mL的时候，可以极显著抑制由LPS刺激引起的TNF-α的浓度分泌。
结果分析：本发明采用了脂多糖激活的巨噬细胞RAW264.7炎症反应模型，通过对促炎细胞因子指标IL-6、TNF-α的检测，评价其体外抗炎活性，实验结果表明滇龙胆酸性多糖能够显著降低促炎细胞因子水平，其具有较好的抗炎活性。
实施例7 GAP-C抗氧化活性测定
试验方法：
（1）DPPH 自由基清除能力测定：准确称取2 mg DPPH溶解于10 mL无水乙醇后定容于50 mL容量瓶中（0.04mg/mL)于 4 ℃下避光保存备用。将1 mL浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、 0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL 的GAP-C加入试管中，以等体积的蒸馏水为空白对照，分别向每个试管当中加入1 mL DPPH溶液，避光反应 30分钟，以维生素C 作为阳性对照，于 517nm下测定吸光度，试验结果如图9所示。自由基清除率计算公式如下：
清除率(%)= [(Ac - As) / Ac] × 100
Ac为空白吸光度，As为DPPH溶液吸光度。
（2）超氧阴离子清除能力的测定:将1 mL浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL的GAP-C加入试管中，以等体积的蒸馏水作为空白对照。加入3 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，PH=8.2）于37 ℃ 水浴中反应10分钟，最后加入 12 μL 30 mmol/L 邻苯三酚溶液，反应4分钟，立即测定混合物在 320nm 下的吸光度, 试验结果如图10所示。以维生素C为阳性对照，超氧自由基清除能力计算公式如下: 清除率(%)=[(Ac - As) / Ac] × 100
Ac为空白吸光度，As为多糖吸光度
(3)羟基自由基清除能力的测定:向各试管中加入浓度为 0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、 6.4 mg/mL 的GAP-C，快速添加 1mL 9 mmol/L FeSO4溶液和 1mL 9 mmol/L 水杨酸乙醇溶液（70 % 乙醇配制），最后加入1 mL 9 mmol/L H2O2溶液，使其混合均匀。将混合物在37 ℃的水浴中反应30分钟，反应结束冷却至室温后，测定混合物溶液510 nm处的吸光度值，试验结果如图11所示, 以维生素C作为阳性对照。计算公式：羟基自由基清除活性表示为: 羟自由基清除率(%)=[A0−(Ax−Aj）] A0 ×100
样品本底吸收：以浓度为 9mmol/L 的 FeSO4、水杨酸乙醇溶液和蒸馏水各 1mL（不加 H2O2）；A0：蒸馏水空白对照；Ax：样品溶液吸光度；Aj：本底吸收。
实验结果：
1、根据图9-11可知滇龙胆酸性多糖以及阳性对照VC的DPPH自由基清除能力在浓度6.4 mg/mL下的清除率为40.36%；羟自由基清除能力在浓度浓度6.4 mg/mL下的清除率为52.94%；超氧阴离子清除能力在浓度6.4 mg/mL下的清除率为53.55%。
2、图12比较了现有文献分离出来龙胆多糖GSP的抗氧活性发现其羟自由基清除能力不超过40%，超氧自由基清除能力不超过20%。比较来看，滇龙胆酸性多糖的自由基清除能力更强，更加具有开发抗氧化药物的潜力。

Claims (8)

1.一种滇龙胆酸性多糖，其特征在于，所述滇龙胆酸性多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸组成，摩尔比为1.126：8.349：34.857：28.260：16.426：2.117：4.268：0.897：2.162：1.537。
2.权利要求1所述的一种滇龙胆酸性多糖的制备方法，其特征在于，按以下步骤实现：
（1）将干燥的滇龙胆药材，粉碎为粗粉，过50目筛，经石油醚索氏提取脱脂2-3次后，以80-85℃水提，每次提取2.5-3h，提取次数为2-3次，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
（2）将步骤1得到的浸膏以无水乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共5-6次，直至离心再无沉淀，减压浓缩，冷冻干燥，得到滇龙胆粗多糖；
（3）将步骤2得到的滇龙胆粗多糖用蒸馏水溶解，离心过滤后，采用DEAE SepharoseFast Flow阴离子交换层析纯化，以NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，经透析、浓缩后得到酸性多糖。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤1中，石油醚索氏提取脱脂的温度为60-90 ℃，石油醚的加入量为滇龙胆药材重量的6-8倍。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2中，乙醇为无水乙醇纯度为100%，乙醇的加入量为所述浸膏的2-3倍。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3中，透析时的截流分子量为3400Da。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3中，所述NaCl溶液浓度为0.2-0.5mol/L。
7.权利要求1所述滇龙胆酸性多糖作为活性成分或者是药用载体在制备抗炎症药物或护肤品中的应用。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于将所述滇龙胆酸性多糖加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂或颗粒剂。
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