CN116731217B - 一种藤茶酸性多糖AGP-2a及其制备方法和在制备抗炎化妆品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物化妆品应用领域，公开了一种藤茶酸性多糖AGP‑2a及其制备方法和在制备抗炎化妆品中的用途。该方法包括步骤：取干燥藤茶水提物用水溶解，加入无水乙醇，通过水溶醇沉法得到藤茶粗多糖；通过Sevag法除蛋白，活性炭除色素，得到纯净的藤茶粗多糖；将纯净的藤茶粗多糖溶解于超纯水中，通过DEAE‑琼脂糖凝胶CL‑6B柱，采用NaCl进行梯度洗脱，合并收集第98‑135管洗脱峰溶液，用3.5kDa透析袋透析48h后，减压浓缩，冷冻干燥得到藤茶多糖；再通过葡聚糖凝胶‑G75色谱柱，采用超纯水洗脱，合并收集第9‑25管中的洗脱峰部分，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量均一的藤茶酸性多糖AGP‑2a。
Description
技术领域
本发明属于天然产物化妆品应用领域，特别涉及一种藤茶酸性多糖AGP-2a及其制备方法和在制备抗炎化妆品中的用途。
背景技术
炎症反应是机体对于刺激的一种有益的自我保护的防御反应，通常细菌感染、化学损伤和环境污染等因素而引起。在炎症发生过程中，先天免疫系统中的巨噬细胞在抵抗病原体、缓解炎症等方面发挥了重要作用。当巨噬细胞受到刺激后会释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等与炎症相关的细胞因子。因此，检测机体中NO、TNF-α、IL-6等物质的浓度变化即可知道机体炎症的变化程度。
多糖广泛存在于植物、真菌、微生物和动物中，植物是多糖最丰富的来源之一。其中，酸性多糖(含有糖醛酸或硫酸根)因其低毒性和潜在的生物活性而受到越来越多的关注，其生物学功能随着分子量、糖醛酸含量、分支度、糖苷键等化学结构的不同而变化。许多研究表明酸性多糖可以作为理想的天然抗炎药物，能够通过抑制炎症细胞因子的分泌来抵抗外部刺激，成为近年来研究的热点。
显齿蛇葡萄(AG)，也被称为藤茶，广泛分布于中国西南地区，其叶子作为传统保健茶和中草药已有数千年的历史。传统中医认为AG有许多有益的作用，包括清热解毒、消炎利尿、促进血液循环和消除瘀血。长期以来，AG被用作治疗感冒、刺伤、擦伤、肝炎和喉咙肿痛的药物。根据现代科学对AG研究可知，AG含有高水平的多酚、类黄酮、多糖、生物碱和脂肪酸。现代药理学研究表明AG水提物具有抗炎作用。显然，AG水提物中含有被以往研究完全忽视的多糖，其结构特征和抗炎活性的联系仍然未知。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种藤茶酸性多糖AGP-2a。
本发明的另一目的在于提供一种上述藤茶酸性多糖AGP-2a的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述藤茶酸性多糖AGP-2a在制备抗炎化妆品中的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种藤茶酸性多糖AGP-2a，该藤茶酸性多糖AGP-2a的单糖分子组成链如下式(Ⅰ)所示：
所述藤茶酸性多糖AGP-2a的重均分子量为44kDa；
所述藤茶酸性多糖AGP-2a由甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)单糖组成，其中各单糖的摩尔比为7.84：7.52：9.03：36.22：25.83：13.56。
针对该藤茶酸性多糖AGP-2a的结构分析表明→4)-α-D-Glcp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→为其主要骨架。
上述藤茶酸性多糖AGP-2a的制备方法，按照以下操作步骤：
(1)取干燥的市售藤茶水提物直接用水于85℃下水浴至完全溶解，趁热加入无水乙醇，直至溶解液中乙醇体积百分比浓度达到60-65％为止；将溶解液置于4℃条件下冷却，2h后过滤取沉淀，无水乙醇洗涤，得到藤茶粗多糖；将藤茶粗多糖通过Sevag法除蛋白，再采用活性炭除去色素，得到纯净的藤茶粗多糖；
(2)将步骤(1)所得纯净的藤茶粗多糖溶解于超纯水中，通过DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱，采用0-0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.2mL/min，每管收集10mL，合并收集第98-135管洗脱峰溶液；
(3)将步骤(2)合并收集的第98-135管洗脱峰溶液，用3.5kDa透析袋透析48h后，减压浓缩，冷冻干燥得到藤茶多糖；
(4)取步骤(3)所得藤茶多糖溶解于超纯水中，过0.45μm滤膜后通过葡聚糖凝胶-G75色谱柱，采用超纯水洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL，合并收集第9-25管中的洗脱峰部分，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量均一的藤茶酸性多糖AGP-2a。
步骤(1)所述将藤茶粗多糖通过Sevag法除蛋白具体按照以下步骤：用清水复溶藤茶粗多糖，减压浓缩至乙醇除净，得到藤茶粗多糖液；按照藤茶粗多糖液：Sevag试剂体积比4:1的比例，向藤茶粗多糖液中加入Sevag试剂，Sevag试剂为体积比4:1的氯仿和正丁醇混合液，磁力搅拌25min，4℃下以10000r/min的转速离心15min，得到上层清液；重复多次Sevag法除蛋白的操作，合并上层清液，得到除去蛋白的藤茶粗多糖；
所述采用活性炭除去色素具体按照以下步骤：往除去蛋白的藤茶粗多糖中加入活性炭，于50℃水浴磁力搅拌10min以除去色素，过滤取滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到纯净的藤茶粗多糖。
上述的藤茶酸性多糖AGP-2a在制备抗炎化妆品中的用途。
本发明的原理是：
藤茶多糖存在于藤茶原料中，通过水提的方式可使其富集在干燥的藤茶水提物中。用水溶解干燥的藤茶水提物，然后通过“水提醇沉”的方式可将其沉淀出来，然后通过Sevag法除蛋白、活性炭去色素后，最后使用具有分子筛效应的DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱和葡聚糖凝胶-G75色谱柱，结合梯度洗脱，则可将其逐步分离纯化，最终得到分子量均一的藤茶酸性多糖AGP-2a。
在研究藤茶多糖的抗炎活性过程中，由于炎症反应是机体对于刺激的一种有益的自我保护的防御反应，在炎症发生过程中，先天免疫系统中的巨噬细胞受到刺激后会释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等与炎症相关的细胞因子。因此，可以在巨噬细胞培养基中加入藤茶多糖，通过对比检测巨噬细胞受到刺激后中NO、TNF-α、IL-6等物质的浓度变化即可知道藤茶多糖是否具有抗炎活性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)按照本发明提取分离工艺可以制备得到一种分子量均一的藤茶酸性多糖AGP-2a，其分子量为44kDa。
(2)本发明所得藤茶酸性多糖AGP-2a，具有优异的抗炎作用，可用于化妆品、药品等产品中作抗炎成分使用。
(3)本发明进一步解析了藤茶中的活性成分组成和结构，为深入了解藤茶生理活性所具有的物质基础提供了理论依据。
附图说明
图1是DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B分离藤茶粗多糖的洗脱曲线。
图2是葡聚糖凝胶G75色谱柱纯化藤茶酸性多糖AGP-2a组分的洗脱曲线。
图3是藤茶酸性多糖AGP-2a单糖组成分析。
图4是藤茶酸性多糖AGP-2a用FT-IR光谱仪在4000-400cm-1范围内的扫描图。
图5是藤茶酸性多糖AGP-2a的1H NMR图。
图6是藤茶酸性多糖AGP-2a的13C NMR图。
图7是藤茶酸性多糖AGP-2a的HSQC图。
图8是藤茶酸性多糖AGP-2a的COSY图。
图9是藤茶酸性多糖AGP-2a的HMBC图。
图10是藤茶酸性多糖AGP-2a在水溶液中的平面结构图。
图11是藤茶酸性多糖AGP-2a多糖的三维图像。
图12是藤茶酸性多糖AGP-2a刚果红多糖配合物在不同浓度NaOH溶液中的最大吸收波长。
图13是藤茶酸性多糖AGP-2a的SEM分析图。
图14是藤茶酸性多糖AGP-2a对巨噬细胞RAW264.7细胞活性的影响。
图15是藤茶酸性多糖AGP-2a对巨噬细胞RAW264.7细胞分泌NO的影响。
图16是藤茶酸性多糖AGP-2a对巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α的影响。
图17是藤茶酸性多糖AGP-2a对巨噬细胞RAW264.7细胞分泌IL-6的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
以下实施例中数据处理方法为：所有实验均采用三次平行处理；采用SPSS 19.0软件包进行数据处理；显著性水平取0.05，数据表示形式为平均值±标准差。
实施例1：藤茶酸性多糖AGP-2a的制备
1、取干燥的藤茶水提物(20g)用200ml纯净水于95℃水浴至完全溶解，趁热加入3倍体积的无水乙醇，直至溶解液中乙醇体积百分比浓度为65％为止；
2、将溶解液置于4℃条件下冷却，2h后过滤取沉淀，洗涤，得到藤茶粗多糖；
3、用清水复溶步骤2所得藤茶粗多糖至100ml，减压浓缩至乙醇除净，得到藤茶粗多糖溶液；按照藤茶粗多糖液：Sevag试剂体积比4:1的比例，向藤茶粗多糖液中加入Sevag试剂，Sevag试剂为体积比4:1的氯仿和正丁醇混合液，磁力搅拌25min，4℃下离心15min(转速为10000r/min)，合并上层清液(Sevag法除蛋白过程重复5次)，得到除去了蛋白的藤茶粗多糖；
4、向除去了蛋白的藤茶粗多糖中加入活性炭(0.4g)，于50℃水浴磁力搅拌10min以除去色素，过滤取滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到纯净的藤茶粗多糖；
5、将步骤4所得纯净的藤茶粗多糖(150mg)溶解于超纯水(10mL)中，10000r/min，4℃下离心15min，取上清液过0.45μm滤膜后通过DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B，采用0-0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.2mL/min，每管收集10mL。苯酚-硫酸法检测多糖组分，以收集洗脱液的管数为横坐标，样品在490nm处吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，如图1所示。
6、根据图1的洗脱曲线，合并收集的第98-135管洗脱峰溶液，用透析袋(3.5kDa)透析48h后，减压浓缩，冷冻干燥得到纯度较高(即分子量均一程度较高)的藤茶多糖AGP-2。
7、取50mg步骤6所得藤茶多糖AGP-2溶解于超纯水(5mL)，过0.45μm滤膜后通过葡聚糖凝胶-G75色谱柱，采用超纯水洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL，并使用苯酚-硫酸法检测多糖组分，以收集洗脱液的管数为横坐标，样品在490nm处吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，如图2所示。根据图2的洗脱曲线，合并收集第9-25管中的洗脱峰部分，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量均一的藤茶酸性多糖AGP-2a(24.8mg)。
由图1可以看出，将去蛋白和色素之后的藤茶粗多糖通过DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B进行梯度洗脱(0-0.3mol/L NaCl)后，可以将藤茶粗多糖分离成AGP-0、AGP-1、AGP-2和AGP-3等4种分子量比较均一的藤茶多糖组分。
由图2可以看出，继续用葡聚糖凝胶-G75色谱柱对收集并冻干得到的藤茶多糖AGP-2进行纯化，采用超纯水洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL，并使用苯酚硫酸法测定糖含量，合并收集第9-25管中的洗脱峰部分(图2)，减压浓缩，冷冻干燥可获得纯度更高(分子量更加均一)的藤茶酸性多糖AGP-2a。对藤茶酸性多糖AGP-2a进行以下分析：
(1)分子量
使用HPLC系统对AGP-2a(10mg/mL)进行分子量测定，采用Ultranhydrogel Linear色谱柱(30cm×7.8mm)，以25mmol/LNaH2PO4-25mmol/LNa2HPO4(pH 6.7，0.05％NaN3)作为洗脱液(流量＝0.8mL/min)进行平衡。使用示差折光检测器监测洗脱液。通过注入已知分子量(1.0、5.0、12.0、25.0、50.0、150.0和670.0kDa)的葡聚糖标准液(10μL)校准色谱柱。根据不同葡聚糖标准品的标准曲线方程、检测仪器本身所带的分析模块和AGP-2a的保留时间可以得到，AGP-2a的重均分子量约为44kDa。
(2)单糖组成分析
将混合标准单糖与多糖组分的色谱图进行比较，可以看出AGP-2a多糖组分均由Man、GlcA、GalA、Glc、Gal和Ara组成，系一种典型的酸性多糖(图3)。其单糖摩尔比为7.84：7.52：9.03：36.22：25.83：13.56，表明Glc和Gal可能是AGP-2a的主要骨架。
(3)甲基化分析
利用甲基化糖醇的保留时间和质谱鉴定了AGP-2a甲基化糖的峰，从中发现了Terminal-Araf,1,3-Linked Araf,Terminal-Glcp,1,2-Linked Araf,1,6-Linked Glcp,1,6-Linked Galp,1,4-Linked Glcp,1,3,6-Linked Manp,1,3,4-Linked Galp等9个衍生物。根据峰面积得到各糖苷键的比值(表1)，结果与单糖组成分析基本一致。其中，1,4-Linked Glcp在AGP-2a中占总糖苷键的大多数，表明1,4-Linked Glcp可能构成AGP-2a的骨架。
表1 AGP-2a的甲基化分析
(4)红外光谱分析
AGP-2a的FT-IR光谱如图4所示，在400-4000cm-1范围内有较多吸收峰。其中，3412.13cm-1和2929.92cm-1处有两个吸收峰，分别与O-H的伸缩振动和C-H不对称伸缩振动有关。此外，1610.58cm-1的峰表明存在糖醛酸，1415.77cm-1的峰是C-H的弯曲振动。同时，C-O-H拉伸振动和C-O-C糖苷带振动表明在1153.45cm-1、1080.15cm-1和1024.21cm-1处有强吸收峰，这确定了吡喃糖环的存在。FT-IR结果表明，AGP-2a具有典型的多糖吸收峰。
(5)核磁共振分析
根据单糖组成和甲基化分析结果，再结合1D(1H，13C)和2D(COSY，HSQC，HMBC)NMR，对所有糖残基的化学位移进行了归属(表2)，并且得到了各残基之间的关系，最终得到了多糖链结构。
表2AGP-2a的1H and 13C NMR化学位移分析
根据1H NMR(图5)、13C NMR(图6)和HSQC(图7)的交叉峰，AGP-2a在δ5.26,5.22,5.04,4.97,4.89,4.90,4.79,4.53,4.46,4.32ppm表现出10个异位质子信号。对应的异位碳信号为δ108.11,99.57,109.23,106.98,98.92,107.3,98.44,100.53,104.24,102.79ppm(分别标记为A,B,C,D,E,F,G,H,I,J)。表明AGP-2a具有α-和β构型，这与FT-IR中存在800cm-1至900cm-1之间的弱峰结果一致。1H NMR中δ1.90-2.00ppm的质子信号和13C NMR中δ20.22的碳信号表明AGP-2a具有乙酰基。δ52.66ppm和δ174.16ppm的碳信号表明AGP-2a多糖均存在甲基和糖醛酸。
对于AGP-2a中的残基A,在δ5.26ppm和δ108.86ppm处发现了较强的异位质子和异位碳信号，表明残基A为呋喃糖中的α异构碳。在COSY(图8)谱中存在δ5.26/3.77,3.77/4.02,4.02/3.82,3.82/3.53的交叉峰，表明残基A的H2-H5信号在δ3.77,4.02,3.82,3.53ppm.利用HSQC谱得到相应的C2-C5信号为δ73.3,81.36,74.27,60.57ppm,碳信号没有前场位移证明残基A为端基残基，即Terminal-Araf。
AGP-2a的HMBC(图9)图表明，残基A的H1(δ5.26)与残基C的C3(δ83.86)的交叉峰证明存在A-C链接。残基B的H1(δ5.22)分别与自身的C4(δ76.25)和残基I的C6(δ72.66)具有交叉峰，并且残基B的H4(δ3.47)与自身的C1(δ99.57)和残基I的C1(δ104.24)也具有交叉峰，证明存在B-B和B-I链接。残基C的H1(δ5.22)与残基F的C2(δ83.42)的交叉峰代表存在C-F链接。δ4.97/83.86信号峰分别归属于残基D的H1和残基C的C3，证明存在D-C链接.δ4.89/83.42信号峰分别归属于残基E的H1和残基F的C2，表明存在E-F链接。同理，剩余的δ4.90/76.36,δ4.90/76.25,δ4.79/76.25,δ4.53/78.94,δ4.53/69.29,δ4.46/77.55,δ4.46/83.42,δ4.32/68.64分别证明存在F-B,F-H,G-B,H-J,I-E,I-H,J-D链接。
综上所述，AGP-2a的单糖分子组成链如下式(Ⅰ)所示：
(6)AFM分析
实验利用原子力显微镜(AFM)对AGP-2a的超微结构和表面形态进行了观察。结果表明，AGP-2a的高度为0.86nm左右，平面图像显示AGP-2a分布较为分散(图10)。
AGP-2a多糖的三维图像(图11)均显示出表面形貌为凹凸不平，由许多高低不等、似山峰形状的突起结构组成，排列成不规则的突起结构，说明AGP-2a具有分支结构。
(7)刚果红分析
通常，三股螺旋多糖与刚果红结合后，刚果红-多糖配合物的最大吸收波长会发生红移，呈现先上升后下降的趋势。因此，可以采用刚果红法测定AGP-2a的三螺旋结。如图12所示，随着NaOH浓度的增加，AGP-2a的最大吸收波长减小，说明AGP-2a不存在三螺旋结构。
(8)SEM分析
多糖的空间结构通常比核苷酸和蛋白质更复杂。AGP-2a的SEM结果如图13所示。AGP-2a的形貌特征为松散的不规则粗片状结构，表面上还有不少孔洞。
实施例2：藤茶酸性多糖AGP-2a的抗炎活性试验
1、藤茶酸性多糖AGP-2a能提高巨噬细胞活力，不存在细胞毒性。
在添加10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基中培养RAW264.7巨噬细胞(由中国科学院细胞库提供，中国上海)。细胞培养在37℃、5％ CO2湿化气氛的培养箱中进行。之后将RAW264.7细胞置于96孔板中，以1×105cells/mL的密度培养24h。取出培养基，加入含有不同浓度的实施例1所得AGP-2a(0.2-1.6mg/mL)的新鲜培养基培养24h，采用CCK-8法测定细胞存活率。
由图14可以看出，在添加了200、400、800和1600μg/mLAGP-2a浓度(NC为没有加入AGP-2a的对照)下，RAW264.7细胞活性增强，说明AGP-2a对RAW 264.7细胞活力没有抑制作用，无细胞毒性。
2、AGP-2a体外抗炎活性
将RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板中。以1×105cells/mL的密度培养24h后，分别用不同浓度的实施例1所得AGP-2a(0.2-1.6mg/mL)的新鲜培养基培养2h。再加入含有LPS(1μg/mL)的DMEM培养基(空白组加入不含LPS的培养基)。培养24h后，采用小鼠IL-6和TNF-αELISA试剂盒分别检测上清液中IL-6和TNF-α水平，同时采用NO检测试剂盒测定上清液中的NO含量。
LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可与巨噬细胞的TLR 4受体结合，诱发炎症。因此，在无细胞毒性的情况下，选择LPS作为刺激剂，在RAW264.7细胞的细胞水平上激活巨噬细胞，模拟炎症疾病。在培养基中加入LPS后，巨噬细胞对LPS作出反应，合成并释放炎症介质，如NO，并产生促炎细胞因子，如TNF-α和IL-6。
由图15-17可以看出，与空白组对照组(NC)相比，LPS激活RAW264.7细胞后NO、TNF-α和IL-6表达量均显著增加(p<0.05)，表明炎症被激发。
由图15可以看出，培养基中加入AGP-2a后，AGP-2a表现出对LPS激活细胞产生NO的抑制作用，当浓度大于200μg/mL时具有显著的抑制作用(p<0.05)，且浓度越高，抑制效果越好。在浓度达到1600μg/mL时，AGP-2a处理LPS激活细胞后NO表达量降低了57.31％。
由图16和图17可以看出，AGP-2a表现出对LPS激活细胞产生TNF-α和IL-6的抑制作用，所有浓度下均表现出显著的抑制作用(p<0.05)，且具有浓度依赖性。在浓度达到1600μg/mL时，AGP-2a处理LPS激活细胞后TNF-α表达量降低了26.06％，IL-6表达量降低了17.62％。结果说明AGP-2a表现出较好的抗炎活性。
综合上面结果可知，AGP-2a具有明显的体外抗炎活性。
实施例3制备不同剂型的抗炎化妆品
1、根据常规方法，通过混合以下项可制备用于抗炎的藤茶酸性多糖化妆水：2.0wt％的实施例1所得藤茶酸性多糖AGP-2a、5.0wt％的1,3-丁二醇、1.7wt％的油醇、3.0wt％的乙醇、3.4wt％的聚山梨酯20、2.1wt％的二苯甲酮-9、0.9wt％的聚羧乙烯、3.5wt％的甘油、微量的香料、微量的防腐剂，以及余量为纯净水。
2、根据常规方法，通过混合以下项制备用于抗炎的藤茶酸性多糖营养霜：5.5wt％的实施例1所得藤茶酸性多糖AGP-2a、3.5wt％的甘油、3.2wt％的凡士林、2.4wt％的三乙醇胺、5.0wt％的液状石蜡、3.3wt％的角鲨烷、2.5wt％的蜂蜡、5.5wt％的生育酚乙酸酯、3.0wt％的聚山梨酯60、1.2wt％的聚羧乙烯、3.1wt％的山梨坦倍半油酸酯、微量的香料、微量的防腐剂，以及余量为纯净水。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种具有抗炎活性的藤茶酸性多糖AGP-2a在制备抗炎化妆品中的用途，其特征在于：该藤茶酸性多糖AGP-2a的单糖分子组成链如下式(Ⅰ)所示：
所述藤茶酸性多糖AGP-2a的重均分子量为44kDa；
所述藤茶酸性多糖AGP-2a由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖单糖组成，其中各单糖的摩尔比为7.84：7.52：9.03：36.22：25.83：13.56。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：针对该藤茶酸性多糖AGP-2a的结构分析表明→4)-α-D-Glcp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→为其主要骨架。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述藤茶酸性多糖AGP-2a按照以下操作步骤制备得到：
(1)取干燥的市售藤茶水提物直接用水于85℃下水浴至完全溶解，趁热加入无水乙醇，直至溶解液中乙醇体积百分比浓度达到60-65％为止；将溶解液置于4℃条件下冷却，2h后过滤取沉淀，无水乙醇洗涤，得到藤茶粗多糖；将藤茶粗多糖通过Sevag法除蛋白，再采用活性炭除去色素，得到纯净的藤茶粗多糖；
(2)将步骤(1)所得纯净的藤茶粗多糖溶解于超纯水中，通过DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱，采用0-0.3mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2.2mL/min，每管收集10mL，合并收集第98-135管洗脱峰溶液；
(3)将步骤(2)合并收集的第98-135管洗脱峰溶液，用3.5kDa透析袋透析48h后，减压浓缩，冷冻干燥得到藤茶多糖；
(4)取步骤(3)所得藤茶多糖溶解于超纯水中，过0.45μm滤膜后通过葡聚糖凝胶-G75色谱柱，采用超纯水洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL，合并收集第9-25管中的洗脱峰部分，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量均一的藤茶酸性多糖AGP-2a。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：
步骤(1)所述将藤茶粗多糖通过Sevag法除蛋白具体按照以下步骤：用清水复溶藤茶粗多糖，减压浓缩至乙醇除净，得到藤茶粗多糖液；按照藤茶粗多糖液：Sevag试剂体积比4:1的比例，向藤茶粗多糖液中加入Sevag试剂，Sevag试剂为体积比4:1的氯仿和正丁醇混合液，磁力搅拌25min，4℃下以10000r/min的转速离心15min，得到上层清液；重复多次Sevag法除蛋白的操作，合并上层清液，得到除去蛋白的藤茶粗多糖；
所述采用活性炭除去色素具体按照以下步骤：往除去蛋白的藤茶粗多糖中加入活性炭，于50℃水浴磁力搅拌10min以除去色素，过滤取滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到纯净的藤茶粗多糖。
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