CN116217745A - 一种藤茶多糖、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种藤茶多糖、制备方法及应用，采取水提醇沉法获得粗多糖，再对粗多糖进行脱蛋白和除盐处理，最后利用离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析对粗多糖进行分离纯化，首次制备出两种藤茶多糖纯品（单一多糖），藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2，结构分析表明所得藤茶多糖为酸性多糖，富含半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。制备方法温和，完好地保存了多糖分子上的糖链部分，同时制备过程中乙醇比例高且醇沉时间长，多糖得率高；所制备的藤茶多糖AGP1和AGP2具备免疫调节活性，可以显著激活巨噬细胞，诱导细胞免疫因子的表达，可应用于食品、保健品、饲料添加剂及药品等。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖、制备方法及应用，尤其是一种以藤茶为原料提取纯化的藤茶多糖、制备方法及应用。
背景技术
藤茶，学名显齿蛇葡萄（AmpeLopsis grossedentata），系葡萄科（Vitaceae），蛇葡萄属（Ampelopsis）。藤茶全株可入药，具有清热解毒、消炎止痛、止血消肿的功效，民间用其治疗各种皮肤疾病（湿疹、皮炎、牛皮癣等）以及风热感冒带来的各种症状（咽喉肿痛、口舌生疮等），并用于防治糖尿病、高血压、心脏病等疾病。现代药理学表明，藤茶具备降血糖、降血脂、抑菌、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等多种生物学活性。
目前，所报道的藤茶多糖仅限于粗多糖（混合多糖），而非藤茶多糖纯品（单一多糖），即未进行除杂、分离、纯化等步骤，粗多糖含有大量的蛋白分子、色素、无机盐以及其他小分子杂质，产品纯度低，结构复杂且未知等因素严重影响其生物学活性的研究进程。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种藤茶多糖、制备方法及应用。
本发明的技术解决方案是：一种藤茶多糖AGP1，由→4,6)Gal(1→重复连接构成主链；分子量为5.60×105 Da，糖醛酸含量为40.77%，中性糖含量为42.92%；单糖组成是21.6%的半乳糖醛酸，24.2%的葡萄糖醛酸，31.8%的半乳糖，10.2%阿拉伯糖，7.4%的葡萄糖，3.4%的甘露糖、0.9%的鼠李糖和0.5%的岩藻糖。
一种藤茶多糖AGP2，以→2)Gal(1→和→2,3,4)Glu(1→构成主链；分子量为7.24×105Da，糖醛酸含量为42.59%，中性糖含量为44.37%；单糖组成是33.5%的半乳糖醛酸，26.8%的葡萄糖醛酸，23.3%的半乳糖，6.0%阿拉伯糖，3.3%的葡萄糖，6.2%的甘露糖，0.5%的鼠李糖和0.4%的岩藻糖。
一种上述藤茶多糖的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 原料粉碎：取藤茶茶叶晾晒干燥，粉碎机粉碎至均匀粗粉；
b. 热水提取：取藤茶粗粉，按水料比25：1加入蒸馏水，在95 ℃的水浴锅中热浸提4 h，稍加冷却后过滤并浓缩，得浓缩液；
c. 醇沉：在浓缩液中加入4倍体积的工业乙醇混匀后4℃静置过夜，抽滤，得到一次沉淀；将一次沉淀用少量蒸馏水溶解，再加入等体积工业乙醇4℃静置过夜，抽滤，得到二次沉淀；将二次沉淀冷冻过夜，真空干燥，得到藤茶水溶性粗多糖；
d. 脱蛋白：将藤茶水溶性粗多糖配制成5 mg/ml的水溶液，依次进行四次脱蛋白操作：第一次加入等体积的Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4：1），混合震荡20 min，4000 r/min离心5 min，保留上清液；第二至第四次均是在上清液中加入五分之一体积的Sevage试剂，混合震荡20 min，4000 r/min离心5 min，保留上清液；将上清液浓缩后冻干，得到脱蛋白多糖；
e. 离子交换柱层析：DEAE-纤维素用0.5 mol/L的NaCL溶液平衡，依次用蒸馏水、0.10 mol/L、0.30 mol/L、0.50 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，浓缩后透析48 h除盐，冷冻干燥后获得多糖粗品；
f. 凝胶过滤柱层析：Sephadex G-300凝胶色谱柱以蒸馏水洗脱纯化多糖粗品，浓缩冷冻干燥后获得两种多糖纯品，命名为藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2。
一种上述的藤茶多糖在制备激活免疫细胞药物中的应用。
本发明是以藤茶为原料，采取水提醇沉法获得粗多糖，再对粗多糖进行脱蛋白和除盐处理，最后利用离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析对粗多糖进行分离纯化，首次制备出两种藤茶多糖纯品，藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2，结构分析表明所得藤茶多糖为酸性多糖，富含半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。制备方法比较温和，完好地保存了多糖分子上的糖链部分，同时制备过程中乙醇比例高且醇沉时间长，多糖得率高；所制备的藤茶多糖AGP1和AGP2具备免疫调节活性，可以显著激活巨噬细胞，诱导细胞免疫因子的表达，可应用于食品、保健品、饲料添加剂及药品等领域。
附图说明
图1是本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的单糖组成与标准品对比图。
图2是本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的GC-MS总粒子流图。
图3是本发明实施例藤茶多糖AGP1的紫外吸收光谱图。
图4是本发明实施例藤茶多糖AGP2的紫外吸收光谱图。
图5是本发明实施例藤茶多糖AGP1的红外吸收光谱图。
图6是本发明实施例藤茶多糖AGP2的红外吸收光谱图。
图7是本发明实施例藤茶多糖AGP1的1H核磁共振谱图。
图8是本发明实施例藤茶多糖AGP2的1H核磁共振谱图。
图9是本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的对巨噬细胞免疫因子IL-6表达的影响示意图。
具体实施方式
本发明的一种上述藤茶多糖的制备方法，依次按照如下步骤进行：
a. 原料粉碎：取藤茶茶叶晾晒干燥，粉碎机粉碎至均匀粗粉；
b. 热水提取：取藤茶粗粉，按水料比25：1加入蒸馏水，在95℃的水浴锅中热浸提4h，稍加冷却后过滤并浓缩，得浓缩液；
c. 醇沉：在浓缩液中加入4倍体积的工业乙醇混匀后4℃静置过夜，抽滤，得到一次沉淀；将一次沉淀用少量蒸馏水溶解，再加入等体积乙醇4℃静置过夜，抽滤，得到二次沉淀；将二次沉淀冷冻过夜，真空干燥，得到藤茶水溶性粗多糖；粗多糖得率为5.74%；
d. 脱蛋白：将藤茶水溶性粗多糖配制成5 mg/ml的水溶液，依次进行四次脱蛋白操作：第一次加入等体积的Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4：1），混合震荡20 min，4000 r/min离心5 min，保留上清液；第二至第四次均是在上清液中加入五分之一体积的Sevage试剂，混合震荡20 min，4000 r/min离心5 min，保留上清液；四次脱蛋白处理后，将上清液浓缩后冷冻干燥，得到脱蛋白多糖；
e. 离子交换柱层析：DEAE-纤维素用0.5 mol/L的NaCL溶液平衡，依次用蒸馏水、0.10 mol/L、0.30 mol/L、0.50 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，浓缩后透析48 h除盐，冷冻干燥后获得多糖粗品；
f. 凝胶过滤柱层析：Sephadex G-300凝胶色谱柱以蒸馏水洗脱纯化多糖粗品，浓缩冷冻干燥后获得两种多糖纯品，命名为藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2，纯化得率分别为36.2%和41.5%。
实验：
一、本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的理化性质测定
对所得两种多糖的理化性质分别进行测定，所得理化指标如表1所示：
表1 藤茶多糖的理化指标
结构分析表明所得藤茶多糖为酸性多糖，富含半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。
多糖纯度及分子量测定采用高效凝胶渗透色谱法，糖含量测定采用苯酚硫酸法，蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，糖醛酸含量测定采用间羟联苯法。
二. 本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的单糖组成测定及连接方式分析
分别将所得到的藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2为样品，按照下述方法处理：
（1）酸水解：样品中加入三氟乙酸，110 ℃反应2 h后，加少量甲醇洗涤，70 ℃蒸干反应液，重复洗涤操作3-5次；溶解于少量蒸馏水中，得到多糖酸水解产物；
（2）单糖组成测定：采用高效阴离子交换色谱法兼备脉冲安倍检测器，测定两种组分的单糖组成如图1所示。图1中各峰的序号对应为1.岩藻糖 2.阿拉伯糖 3.鼠李糖 4.半乳糖 5.葡萄糖 6.甘露糖 7.半乳糖醛酸 8.葡萄糖醛酸。
与标准品比对得到测定结果如表2所示：
表2 藤茶多糖的单糖组成
（3）多糖连接方式分析：对多糖进行酸水解和甲基化，并对结果进行GC-MS分析（图2），分析得到AGP1和AGP2的主链连接方式分别如表3、表4所示：藤茶多糖AGP1由→4,6)Gal(1→重复连接构成主链；藤茶多糖AGP2以→2)Gal(1→和→2,3,4)Glu(1→构成主链。
表3 AGP1的甲基化分析结果
表4 AGP2的甲基化分析结果
三. 本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的光谱分析
分别将所得到的藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2为样品，将样品配制为1.0 mg/mL的水溶液，于200 nm至800 nm波长范围内进行紫外扫描；采用衰减全反射光谱（ATR）对样品进行红外光谱扫描。
藤茶多糖AGP1和AGP2的紫外吸收光谱图如图3、图4所示。由于蛋白质在280 nm处有特征吸收，糖类物质在200 nm附近有特征吸收，因此可以通过紫外扫描初步判定糖类和蛋白质的存在。紫外扫描显示，在200 nm左右有强烈吸收，而在280 nm处有较弱吸收，说明AGP1和AGP2为糖蛋白复合物。
AGP1的红外吸收光谱如图5所示，AGP1在3286 cm-1处存在强且宽的峰，是-OH的伸缩振动峰；在2936 cm-1处存在吸收，这表示组分中存在糖类特征峰，是糖类-CH2 或-CH3的伸缩振动峰；1745 cm-1附近检测到糖醛酸的吸收峰；1599 cm-1附近检测到C=O的伸缩振动峰；1424 cm-1处为C-H的变角振动峰；1025 cm-1附近检测到C-O-C或C-O伸缩振动。
AGP2的红外吸收光谱图如图6所示，AGP2在3304 cm-1附近有强吸收，是-OH的伸缩振动峰；2924 cm-1附近检测到-CH2 或-CH3的伸缩振动峰；1746 cm-1附近检测到糖醛酸的吸收峰；1597 cm-1附近检测到C=O的伸缩振动峰；1418 cm-1处为C-H的变角振动；1024 cm-1附近检测到C-O-C和C-O伸缩振动。
四. 本发明实施例藤茶多糖AGP1和AGP2的核磁氢谱分析
称取20 mg藤茶多糖AGP1和AGP2，分别溶于1 ml D2O中，用移液枪转移至核磁管中，通过NMR光谱仪对样品进行测定。
如图7所示，AGP1的信号集中在δH3.2-5.2 ppm之间，δH4.70 ppm处为溶剂峰，δH3.2-4.2 ppm为环质子信号，本氢谱中显示AGP1异头碳上氢的化学位移为δH5.13 ppm，表示该多糖含有一类端基质子，为α构型的半乳糖的异头氢信号。
如图8所示，AGP2的信号集中在δH3.2-5.2 ppm之间，δH4.71 ppm处为溶剂峰，δH3.2-4.4 ppm为环质子信号，本氢谱中显示AGP2异头碳上氢的化学位移为δH5.13 ppm和δH5.26 ppm，表示该多糖含有两类端基质子，为α构型的半乳糖和葡萄糖的的异头氢信号。
位于δH3.2-4.4 ppm处的共振峰代表了糖环上其他氢原子的化学位移。δH1-3.2ppm之间为蛋白质的氨基酸残基上氢的化学位移信号，表明多糖中含有微量的蛋白质。
五. 分别以所得到的藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2为样品，测定藤茶多糖的免疫刺激活性
（1）巨噬细胞培养：RAW264.7巨噬细胞株培养于RPMI 1640培养基中，培养基中预先加入了10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸链霉素，经0.22 μm滤膜过滤后使用；细胞在37℃，5% CO2的孵箱中孵育，三天传一代。
（2）测定细胞因子：将培养的巨噬细胞分为以下处理组：空白对照0 μg/mL、样品10μg/mL、样品50 μg/mL、样品100 μg/mL。孵育24 h后，收集细胞和培养液，采用ELISA方法测定白细胞介素6（IL-6）的含量，结果如图9所示。
结果表明：藤茶多糖AGP1和AGP2可以明显促进IL-6的表达，100 μg/mL达到最大值，分别为空白对照组的7.9倍和6.1倍，AGP1的免疫激活效果更好，提示两种藤茶多糖AGP1和AGP2具有良好的免疫激活作用。
Claims (4)
1.一种藤茶多糖AGP1，其特征在于：由→4,6)Gal(1→重复连接构成主链；分子量为5.60×105 Da，糖醛酸含量为40.77%，中性糖含量为42.92%；单糖组成是21.6%的半乳糖醛酸，24.2%的葡萄糖醛酸，31.8%的半乳糖，10.2%阿拉伯糖，7.4%的葡萄糖，3.4%的甘露糖、0.9%的鼠李糖和0.5%的岩藻糖。
2.一种藤茶多糖AGP2，其特征在于：以→2)Gal(1→和→2,3,4)Glu(1→构成主链；分子量为7.24×105Da，糖醛酸含量为42.59%，中性糖含量为44.37%；单糖组成是33.5%的半乳糖醛酸，26.8%的葡萄糖醛酸，23.3%的半乳糖，6.0%阿拉伯糖，3.3%的葡萄糖，6.2%的甘露糖，0.5%的鼠李糖和0.4%的岩藻糖。
3.一种如权利要求1或2所述藤茶多糖的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 原料粉碎：取藤茶茶叶晾晒干燥，粉碎机粉碎至均匀粗粉；
b. 热水提取：取藤茶粗粉，按水料比25：1加入蒸馏水，在95 ℃的水浴锅中热浸提4 h，稍加冷却后过滤并浓缩，得浓缩液；
c. 醇沉：在浓缩液中加入4倍体积的工业乙醇混匀后静置过夜，抽滤，得到一次沉淀；将一次沉淀用少量蒸馏水溶解，再加入等体积的工业乙醇静置过夜，抽滤，得到二次沉淀；将二次沉淀冷冻过夜，真空干燥，得到藤茶水溶性粗多糖；
d. 脱蛋白：将藤茶水溶性粗多糖配制成5 mg/ml的水溶液，依次进行四次脱蛋白操作：第一次加入等体积的Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4：1），混合震荡20 min，4000 r/min离心5min，保留上清液；第二至第四次均是在上清液中加入五分之一体积的Sevage试剂，混合震荡20 min，4000 r/min离心5 min，保留上清液；将上清液浓缩后冻干，得到脱蛋白多糖；
e. 离子交换柱层析：DEAE-纤维素用0.5 mol/L的NaCL溶液平衡，依次用蒸馏水、0.10mol/L、0.30 mol/L、0.50 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，浓缩后透析48 h除盐，冷冻干燥后获得多糖粗品；
f. 凝胶过滤柱层析：Sephadex G-300凝胶色谱柱以蒸馏水洗脱纯化多糖粗品，浓缩冷冻干燥后获得两种多糖纯品，命名为藤茶多糖AGP1和藤茶多糖AGP2。
4.一种如权利要求1或权利要求2所述的藤茶多糖在制备激活免疫细胞药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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