CN113637089B

CN113637089B - 一种醇水两溶性党参葡果聚糖、制备工艺及抗肿瘤应用

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Publication number: CN113637089B
Application number: CN202110895231.3A
Authority: CN
Inventors: 刘安军; 于娟; 纪海玉
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113637089A

Abstract

本发明涉及一种党参葡果聚糖，该多糖具有醇水两溶特性。制备方法为：将党参粉末加入到的蒸馏水中，超声波辅助下热水浸提，抽滤，离心，取上清，经真空旋转蒸发仪进行浓缩，得到党参浓缩液，向得到的浓缩液中加入无水乙醇溶液，混匀后冰箱放置过夜，离心，弃沉淀后再次旋蒸去除乙醇，再利用Sephadex‑G25凝胶柱进行分离，收集无还原糖的主要多糖组分，冻干后得到低分子量党参葡果聚糖。经小鼠体内抗肿瘤实验得到其100mg/kg的灌胃剂量时对H22荷瘤小鼠抑瘤率可达53.98％。本发明高效利用了水溶醇沉工艺中的醇溶废弃物，对其中的醇水两溶性多糖进行提取分离，结果表明这部分葡果聚糖不仅结构简单，生物活性强，而且生产质量高。

Description

一种醇水两溶性党参葡果聚糖、制备工艺及抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于党参葡果聚糖活性研究领域，涉及抗肿瘤活性的研究，尤其是一种醇水两溶性党参葡果聚糖制备工艺及抗肿瘤应用。

背景技术

党参是一种著名的药食同源多年生草本植物，具有强大的生物活性，包括增强免疫、健脾、养肺，由于成本较低，可以考虑作为人参的可靠替代品。党参多糖已被证实为其主要有效活性成分，并具有免疫调节、抗病毒和抗癌活性，应用前景广泛。采用碱液、超声波、酶和微波等多种辅助条件已被广泛应用于提高不同来源多糖的提取得率，从而有利于其工业化生产和实际应用。超声波辅助处理是目前应用最广泛的一种辅助方法，具有能耗更低，条件更温和的特点，可在液体介质中产生声空化气泡，加速多糖的溶解，通过破坏细胞壁来提高多糖提取率。据报道，与传统提取方法相比，超声波辅助提取可明显提高多糖得率52-129％。据报道，不同的提取方法会显著影响提取率、结构特征和生物学特性。传统的党参多糖提取方法主要采用热水为提取溶剂，用终体积分数为75～80％的乙醇进行沉淀，但忽略了75～80％乙醇中溶解的成分，造成资源浪费。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的水溶醇沉技术中所得多糖结构复杂，水溶性差，得率和活性低等不足，提供一种党参葡果聚糖及其制备方法，所得低聚糖结构简单，生物活性强，生产质量高。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种党参葡果聚糖，该多糖具有醇水两溶特性，多糖含量为92.85±3.52％，蛋白含量为2.25±0.06％，糖醛酸含量为0.28±0.02％，平均分子量约为3.24×10³Da，果糖/葡萄糖的摩尔比为2.73:1.00，具有β-和α-两种糖苷键构型，由β-(2→1)-果聚糖链接α-(1→3)-葡聚糖为主链组成。

该党参葡果聚糖的制备方法，步骤如下：

(1)将党参根茎粉末加入到的蒸馏水中，含量为0.01g/ml～0.05g/ml，超声辅助热水浸泡2-3h，抽滤，离心取上清，经真空旋转蒸发仪40～60℃进行浓缩，得到党参浓缩液；

(2)向步骤(1)得到的浓缩液中，加入无水乙醇溶液至体积分数80％，混匀后冰箱4℃放置过夜，离心，弃沉淀后再次旋蒸去除乙醇，再利用Sephadex-G25凝胶柱进行分离，收集无还原糖的多糖组分，冻干后得到低分子量党参葡果聚糖。

进一步的，步骤(1)离心后的滤渣经过2～4次重复提取，与第一次提取的上清液混合再浓缩。

本发明进一步保护党参葡果聚糖在制备抗肿瘤细胞H22药物中的应用。

本发明进一步保护党参葡果聚糖在制备肿瘤小鼠增强机体免疫能力药物中的应用。包括正常人的肿瘤预防以及肿瘤患者术后的康复，预防肿瘤复发等。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明在传统的党参多糖提取方法水溶醇沉法中被抛弃的80％乙醇溶液中分离出了一种低分子量的葡果聚糖，该多糖结构组成简单，具醇水两溶特性，分子量为3.24×10³Da，具有典型的多糖特征，几乎不含蛋白质、核酸和糖醛酸，其单糖组成为果糖和葡萄糖(2.73:1.00)，经小鼠体内抗肿瘤实验得到其100mg/kg的灌胃剂量时对H22荷瘤小鼠抑瘤率可达53.98％。

2、本发明高效利用了水溶醇沉工艺中的醇溶废弃物，对其中的葡果聚糖进行提取分离，结果表明这部分多糖得率高，结构简单，通过动物实验发现其具有显著地体内增强免疫和抗肿瘤的生物活性。

附图说明

图1中(A)为本发明党参葡果聚糖的葡聚糖凝胶柱洗脱曲线、(B)为紫外全波长扫描图谱，(C)为高效凝胶渗透色谱。

图2中(A)为本发明党参葡果聚糖的气相色谱图，(B)为红外光谱图；图中：1鼠李糖；2阿拉伯糖；3木糖；4甘露糖；5葡萄糖；6半乳糖；7肌醇。

图3为本发明党参葡果聚糖的一维核磁共振谱图，其中(A)为¹H谱图；(B)为¹³C谱图；(C)为DEPT¹³⁵谱图。

图4为本发明党参葡果聚糖的二维核磁共振谱图，其中(A)为COSY谱图；(B)为HSQC-蓝色/HMBC-红色谱图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种党参葡果聚糖的制备方法，将党参根茎粉末100g置于3000ml蒸馏水中，超声辅助热水浸泡2～3h，抽滤，取上清，弃沉淀。对抽滤后的滤渣再次提取一次，步骤同上，将两次得到上清液混合后，经旋转蒸发仪50℃真空条件下进行浓缩，得到党参浓缩液，加入4倍体积的无水乙醇，混匀后4℃冰箱放置过夜，最后离心弃沉淀后将上清再次旋蒸去除乙醇，而后经葡聚糖凝胶进行分离纯化(收集图1中(A)的11～12管)，除掉还原性单糖和小分子杂质，得到一种低分子量党参葡果聚糖。

采用苯酚硫酸法检测党参葡果聚糖的多糖含量为92.85±3.52％，采用考马斯亮蓝法检测其中的蛋白含量为2.25±0.06％，采用咔唑硫酸比色法测定其糖醛酸含量为0.28±0.02％。如图1中(B)所示，208nm处的主峰为多糖的特征吸收峰，此外，在260nm和280nm处没有明显的吸收峰，说明低分子量党参葡果聚糖几乎不含核酸和蛋白质，这与化学成分结果一致。如图1中(C)所示，多糖液相图谱中的的保留时间(Rt)是12.316min，然后通过标准曲线(Lg(Mw)＝10.2120-0.5441Rt,R²＝0.9962)可以计算出其平均分子量约为3.24×10³Da。

采用气相色谱和红外光谱测定了党参葡果聚糖的单糖组成和特征官能团，结果如图2所示。如图2中(A)所示，气相色谱结果表明，党参葡果聚糖主要由葡萄糖(Glc)组成。但在HP-5色谱柱下无法检测到果糖的衍生物，因此，采用盐酸间苯二酚溶液测定其中果糖(Fru)含量为67.99％。结合总糖含量，可以计算出党参葡果聚糖中Fru/Glc的摩尔比为2.73:1.00。如图2中(B)所示，通过FTIR光谱仪在4000-400cm-1的扫描范围内检测了该多糖的特征官能团。在3385.65cm^-1(O-H伸展振动)，2931.38cm^-1(甲基和亚甲基C-H键的伸展振动)，1408.70cm^-1和1274.71cm^-1(C-H弯曲振动)等多处强吸收峰代表了多糖的特征峰。在1637.17cm^-1的吸收峰表示结合水的存在。在1200-1000cm^-1范围内的峰值归因于党参多糖中C-O-H侧基和C-O-C糖苷环的特征)。此外，935.49cm^-1和833.96cm^-1的特征吸收表明该多糖中存在β-和α-糖苷键。由此推测，该党参葡果聚糖是一种中性多糖，同时具有β-和α-两种糖苷键构型。

通过¹H、¹³C和Dept135核磁共振波谱分析多糖的H原子和C原子分布，从而推断多糖可能的结构。一维NMR分析的结果如图3所示。图3中(A)为多糖的¹H谱。一般来说多认为糖的异头质子的信号峰主要在δ为4.3-5.9区域，α-糖苷异头碳的质子信号在δ为5.0-6.0区域。图3中(A)在δ为5.413和5.422处有两个的信号峰，说明多糖中存在α型吡喃糖，这与红外的结果相吻合；δ为4.723处为D₂O的溶剂峰，可能由于多糖溶液中的多糖浓度较低，导致溶剂峰的强度较大；δ为3.4-4.4处为H2-H5的信号峰区域，其强度显著高于异头质子区域，说明有果糖存在。图3中(B)为多糖的¹³C谱。结合上文结果，可知δ为95.413处为α-Glc的异头碳信号峰，而δ为105.89～106.49为β-Fru的异头碳信号峰，与图3中(C)酮糖δ为105.89～106.49无信号峰一致。此外结果显示，党参葡果聚糖含有α-和β-两种糖苷键构型，与红外光谱分析结果一致。

二维NMR分析的结果如图4所示，其中图中的A表示Fru、B表示Glc，而图4中(A)表示COSY谱图，而图4中(B)表示HSQC/HMBC谱图。首先通过COSY谱图，对两种单糖元中的H1～H6分别进行确切的化学位移归属。然后通过HSQC谱图中C-H近程相关特性对两种单糖元的C1-C6的化学位移进行归属。最后通过HMBC谱图中的C-H远程相关特性对两种单糖元的键连方式进行分析。结果显示该党参葡果聚糖主要由β-(2→1)-果聚糖链接α-(1→3)-葡聚糖为主链组成，与前文研究结果一致。

关于对党参葡果聚糖的体内抗肿瘤作用分析如下：

1、各组小鼠肿瘤、胸腺和脾脏重量

雌性Blab/c小鼠共50只，8周龄，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可号SYXK(京)2019-0010。小鼠饲养环境相对湿度45-55％、可控温度20-25℃，12h光照/12h黑暗循环。所有动物相关实验均在我们的实验动物房中进行，实验动物房饲养许可证编号为SYXK(津)2018-0001。

饲养7d后，将小鼠随机分为5组(10只/组):空白组、模型组，阳性对照组(环磷酰胺，CTX,25mg/kg)组和党参多糖组(低剂量50mg/kg、高剂量100mg/kg)，称初始体重。空白组和模型组小鼠灌胃0.2mL生理盐水(0.9％)，多糖组小鼠按相应浓度灌胃多糖，每日1次，连续2周。然后对所有小鼠接种H22肿瘤细胞(除空白组)，阳性组开始腹腔注射对应浓度的环磷酰胺，其余各组小鼠继续灌胃15d，实验结束后，眼球取血称重并处死所有小鼠，然后收集肿瘤、胸腺和脾脏称重。

表1各组小鼠肿瘤、胸腺和脾脏重量

注：*,与空白组相比p<0.05；^#,与模型组相比p<0.05.

表1结果显示，与空白组相比，模型组小鼠肿瘤恶性增殖，胸腺重量显著降低，脾脏重量显著上升(p<0.05)，表明其免疫器官受到破坏。腹腔注射CTX显著减小了肿瘤重量，但是胸腺和脾脏重量均较模型组显著降低(p<0.05)，暗示其严重的毒副作用。而与模型组相比，灌胃不同剂量的多糖可显著以剂量依赖性的方式减小肿瘤重量，提高胸腺重量，预防脾脏肿大(p<0.05)，经计算高剂量党参葡果聚糖对H22荷瘤小鼠的抑制率可达53.98％。

2、各组小鼠血常规指标分析

党参葡果聚糖对H22荷瘤小鼠血常规指标的影响检测结果见表2。

表2各组小鼠血常规指标分析

血液常规检查指标主要包括白细胞亚群(淋巴细胞、中间细胞和粒细胞)百分比和的数量，红细胞状态(红细胞、血红蛋白、红细胞平均体积、红细胞压积、血红蛋白、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、红细胞分布宽度系数)、血小板状态(血小板数量、平均血小板体积、血小板压积、血小板分布宽度)。由表2可见，与空白组相比，模型组和阳性组H22荷瘤小鼠粒细胞数量/比例和血小板水平升高，淋巴细胞数量/比例、红细胞数量和血红蛋白水平降低，说明癌细胞的增殖或化学药物的治疗会抑制淋巴细胞的活性，诱导宿主贫血和炎症反应。而党参葡果聚糖灌胃可有效提高抗肿瘤淋巴细胞免疫功能，减轻肿瘤引起的不良反应。

3、各组小鼠血常规指标分析

党参葡果聚糖对H22荷瘤小鼠免疫细胞(脾淋巴细胞、脾NK细胞和巨噬细胞)活性的影响检测结果见表3。

表3各组小鼠免疫细胞活性分析

注：*,与空白组相比p<0.05；^#,与模型组相比p<0.05.

如表3所示，结果显示，在不同组间H22荷瘤小鼠中这四种细胞的活性表现出相似的趋势。模型组H22肿瘤细胞无限增殖可明显抑制抗肿瘤免疫，导致其四种免疫细胞能力较空白组均明显下降(p<0.05)。与模型组比较，CTX处理后各种免疫细胞活性未见显著差异，但巨噬细胞能力显著降低(p<0.05)，暗示其对荷瘤小鼠具有严重的副作用。而不同剂量的党参多糖处理可在体内以剂量依赖性的方式显著提高淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞的活力(p<0.05)，从而提高机体抗肿瘤免疫能力，抑制体内肿瘤细胞的增殖。

4、各组小鼠T淋巴细胞亚群比例分析

癌症的免疫疗法主要是通过刺激免疫细胞，进而提高机体免疫力，达到杀死癌细胞，控制肿瘤扩散的目的，尤其是T细胞介导的细胞免疫。T淋巴细胞根据其表面分子不同，可以进一步分为细胞毒性T细胞和辅助性T细胞，分别与FITC-CD8⁺和PE-CD4⁺结合。因此，我们采用流式细胞术检测小鼠外周血中T淋巴细胞亚群的比例，分析结果如表4所示。

表4各组小鼠T淋巴细胞亚群比例分析

注：*,与空白组相比p<0.05；^#,与模型组相比p<0.05.

结果显示，与空白组相比，模型组小鼠CD4⁺T细胞在白细胞中所占百分比明显降低(p<0.05)，说明H22实体瘤的恶性增殖可抑制CD4⁺T细胞的活性，从而为自身的发展创造有利条件。而阳性组腹腔注射CTX，同样造成了类似的效果，且CD8⁺T细胞的比例甚至较模型组更低，暗示其具有很强的毒副作用。经党参葡果聚糖处理后，与模型组相比，H22荷瘤小鼠外周血中CD4⁺T细胞的比例显著提高(p<0.05)，结果表明该多糖可有效提高荷瘤小鼠CD4⁺T细胞免疫能力，提高其对肿瘤细胞的识别杀伤能力。

5、各组小鼠细胞因子表达水平分析

细胞因子，是一种不同细胞分泌的蛋白质，也是许多疾病包括癌症在内的指标或调节因子。TNF-α能促进肿瘤血管的破坏，诱导癌细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。IFN-γ主要由T细胞和NK细胞产生，在激活包括淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞在内的所有免疫细胞特别是抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用。IL-2是一种由T细胞产生的白细胞刺激因子，被认为是一种促进T细胞和NK细胞活性的生长因子，对癌细胞具有抑制作用。IL-4是一种由多种免疫细胞衍生的分子，通过调节免疫反应和免疫微环境介导常见的抗肿瘤、抗炎等生物学功能。各组小鼠血清细胞因子表达水平结果见表5。

表5各组小鼠细胞因子表达水平分析

注：*,与空白组相比p<0.05；^#,与模型组相比p<0.05.

据报道，这些细胞因子与实体肿瘤的增殖和侵袭密切相关。如表5所示，模型组小鼠由于实体肿瘤的生长，导致血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-4的表达水平较空白组明显降低(p<0.05)，从而有利于肿瘤的生长。经CTX处理后，荷瘤小鼠血清中这四种细胞因子的表达水平与模型组相比未见显著差异，表明其虽然可抑制肿瘤细胞的增殖，但同时降低了机体免疫能力。而不同浓度的党参多糖处理可以明显改善这些免疫相关细胞因子的表达，从而增强抗肿瘤免疫，抑制H22肿瘤细胞的增殖。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种党参葡果聚糖，其特征在于：该多糖具有醇水两溶特性，多糖含量为92 .85± 3.52％，蛋白含量为2 .25±0 .06％，糖醛酸含量为0 .28±0 .02％，平均分子量为3 .24×10³ Da，果糖/葡萄糖的摩尔比为2 .73:1 .00，具有β-和α-两种糖苷键构型，由β-(2→1)-果聚糖链接α-(1→3)-葡聚糖为主链组成。

2.根据权利要求1所述的党参葡果聚糖的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)将党参根茎粉末加入到的蒸馏水中，含量为0 .01g/ml～0 .05g/ml，超声辅助热水浸泡2-3h，抽滤，离心取上清，经真空旋转蒸发仪40～60℃进行浓缩，得到党参浓缩液；

3.根据权利要求2所述的党参葡果聚糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)离心后的滤渣经过2～4次重复提取，与第一次提取的上清液混合再浓缩。

4.一种权利要求1所述的党参葡果聚糖在制备抗肿瘤细胞H22药物中的应用。

5.一种权利要求1所述的党参葡果聚糖在制备增强机体免疫能力药物中的应用。