CN105902562A - 一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用,针对传统水提醇沉工艺制备的白及多糖产品纯度低、分子量未知等缺陷,通过反复实验和大量研究,选用特定分子量范围的天然葡甘露聚糖原料,通过水提取—蛋白酶酶解—微滤等组合技术工艺,成功研制出高纯度的均一多糖提取物,所述制备工艺简洁、产品质量可控,容易实现放大生产。经动物试验研究发现,本发明的葡甘露聚糖提取物能够升高白细胞,防治放化疗患者的骨髓抑制,提高免疫力,无毒副反应,改善和提高癌症患者中医症候和生活质量。
Description
技术领域:
本发明涉及一种由天然植物中提取的葡甘露聚糖提取物,本发明同时涉及所述葡甘露聚糖提取物在制备防治白细胞减少症药物中的应用,属生物医药领域。
背景技术:
正常人血液中白细胞总数为4~10×109/L,当机体受到药物(例如抗肿瘤药物及免疫抑制剂)、理化因素(例如放射线和化学物损伤)、严重感染(某些病毒、细菌感染)等因素的影响,致血液中白细胞数量持续低于4×109/L 时,即称为白细胞减少症(Leukopenia);中性粒细胞是白细胞的主要成分,其绝对计数低于2.0×109/L,称为中性粒细胞减少,低于0.5×109/L时,称为粒细胞缺乏症。白细胞减少症是肿瘤放化疗中常见的严重副作用,它可引起机体的免疫力下降,病人容易诱发反复感染。临床上用来治疗白细胞减少症的常用药物是集落刺激因子(CSF),该药升白效应迅速,可动员、加快骨髓细胞的分化、成熟并释放入外周血;但CSF无法有效地修复反复受损的骨髓、造血微循环,作用时间短,反复使用后出现每次药效递减现象,并且其价格昂贵、副反应较为明显。其他药物例如利血生,维生素B4,地榆升白片,鲨肝醇以及肌苷等疗效还不理想。开发有确切疗效、毒副作用小的防治白细胞减少症的药物仍是临床上的迫切需要。
近年来,多糖的免疫调节作用受到广泛关注,其中香菇多糖、银耳多糖等具有一定升白作用。葡甘露聚糖是一种常见的天然黏性多糖,其主链由D-甘露糖和D-葡萄糖组成,一般通过β-1→4位糖苷键连接,并带有部分支链结构和乙酰基修饰。该类多糖主要在植物中发现,例如魔芋、芦荟、白及(又名白芨,Bletilla striata)等,在天然食品、化妆品、医药用品等领域应用广泛,具有显著经济价值。白及多糖是传统中药白及中的主要有效成份,具有收敛、止血、补肺等功能并用于相关药品中。张颖较为系统地报道“白芨多糖对骨髓造血及免疫功能的作用研究”(重庆医科大学,硕士学位论文,2009),结果表明,经水提、醇沉等工艺制备获得的白芨多糖,在环磷酰胺所致的小鼠造血功能损伤试验中,与模型组相比,白及多糖150 mg/kg和500 mg/kg灌服给予,连续6天,呈剂量和时间依赖性升高骨髓造血功能低下小鼠的外周血白细胞数,并加快骨髓有核细胞数和脾集落形成细胞数的恢复,提示白及多糖对造血功能低下的骨髓有促进造血的作用;白及多糖对免疫功能低下小鼠的非特异性免疫和特异性T及B细胞免疫反应也均有促进作用。
发明人在研制升白中药过程中,意外发现白及多糖具有明确的药理活性,其作用与白及多糖的分子量密切相关,现有文献尚未涉及到白及多糖的具体结构与升白活性的构效关系研究。
发明内容:
本发明的目的是提供一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用。
一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用,所述葡甘露聚糖为分子量范围10-500 kD的均一多糖,其纯度大于90%。
本发明所述的葡甘露聚糖由D-甘露糖和D-葡萄糖组成,主链通过β-1→4位糖苷键连接,并带有部分支链结构和乙酰基修饰。
本发明所述的葡甘露聚糖为天然来源的魔芋多糖、白及多糖或其水解产物。
优选的,所述葡甘露聚糖为分子量范围20-300 kD的白及多糖。
其中,魔芋多糖、白及多糖或其水解产物可参考已公开的文献进行制备,例如张燕“白及多糖的酸水解动力学研究”(苏州大学硕士学位论文,2010)、李楠“白及多糖酶降解动力学研究”(苏州大学硕士学位论文,2012)等论著。
一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用,所述的葡甘露聚糖可制成本领域药物制剂的各种常规剂型,包括口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂,注射液、冻干粉针。
其中,口服制剂的优选给药剂量在50-200mg/kg范围;注射剂优选给药剂量在20-200mg/kg范围。
一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用,所述葡甘露聚糖作为制剂的制备方法,采用以下步骤:
(1)选取葡甘露聚糖,采用水提取,蛋白酶进行酶解,加入活性炭助滤剂处理,过滤,滤液进一步采用100-1000 nm微滤膜过滤,浓缩,干燥,得葡甘露聚糖原料;
(2)由(1)所得葡甘露聚糖原料,经进一步配制,分装,灭菌,得葡甘露聚糖制剂。
所述步骤(1)中蛋白酶从商业途径获得和使用,其中优选木瓜蛋白酶。
所述步骤(1)中干燥方法选自冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥中的一种,其中优选冷冻干燥。
所述步骤(2)中葡甘露聚糖制剂优选为注射制剂。
本发明的积极进步效果在于:本发明针对传统水提醇沉工艺制备的白及多糖产品纯度低、分子量未知等缺陷,通过反复实验和大量研究,选用特定分子量范围的天然葡甘露聚糖原料,通过水提取—蛋白酶酶解—微滤等组合技术工艺,成功研制出高纯度的均一多糖提取物,所述制备工艺简洁、产品质量可控,容易实现放大生产。经动物试验研究发现,本发明的葡甘露聚糖提取物能够升高白细胞,防治放化疗患者的骨髓抑制,提高免疫力,无毒副反应,改善和提高癌症患者中医症候和生活质量。
本发明内容是通过系统研究和大量创造性实验完成的,以下述具体实施例进行说明。
附图说明:
图1:本发明实施例3中白及多糖BT50的HPGPC谱图。
图2:本发明实施例3中白及多糖BT50的紫外谱图。
图3:本发明实施例3中白及多糖BT50的红外谱图。
图4:本发明实施例3中白及多糖BT50的1H-NMR谱图。
图5:本发明实施例3中白及多糖BT50的13C(下图)和DEPT-135-NMR谱图(上图)。
具体实施例
本发明所述的葡甘露聚糖及其在制备防治白细胞减少症药物中的应用,以白及多糖和魔芋多糖制备方法为例,是按如下实施例所表示的方法制造或发现的,所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
本发明实施例中,所述均一多糖是指该多糖样品在HPGPC(高效凝胶色谱)分析谱图中的色谱峰为正态分布的高斯曲线,所述葡甘露聚糖分子量均为平均重均分子量(Mw)并采用MALS(多角度激光光散射仪)分析。
实施例1:白及多糖BT300的制备
白及药材为市售品,其中所含白及多糖经HPGPC分析为Mw 344 kD的均一多糖。
取白及药材饮片1.0 kg,分别加入20kg水提取2次,每次1.5hr,提取液减压浓缩至10 L,用200目滤布过滤,滤液加入20g木瓜蛋白酶在50-60℃酶解6h以上,再加入100g活性炭煮沸30min,离心,过滤,滤液用1000 nm微滤膜过滤,加入1.5倍95%乙醇使沉淀,抽滤,60℃以下减压干燥,得白及多糖BT300(138g)。
采用HPGPC法分析葡甘露聚糖的分子量及其纯度。色谱条件:色谱柱TSK PW4000柱(7.8 mm×300 mm);流动相水,流速0.6 mL·min-1;RI/MALS(wyatt公司)或ELSD(奥泰公司)检测;柱温40℃;供试品溶液浓度10mg/mL,进样量10-20 μL;分析时间30 min。测得BT300为Mw344.5 kD的均一多糖,纯度93%。白及多糖(10~300 kD)系列对照品为自制,其分子量采用HPGPC-测定。
实施例2:不同来源白及多糖的制备
收集各产地的商品白及药材,采用实施例1方法制备白及多糖并进行HPGPC分析,结果如下表。
结果表明:多数产地白及药材制备的白及多糖为Mw 86.2~344.5 kD的均一多糖,纯度大于90%,但不同产地和来源的白及药材分子量不同;此外,BJ-7中还有两个分子量规格多糖。结果表明,需要对白及药材中的白及多糖分子量进行质量控制,才可以制备获得药效稳定的固定分子量规格白及多糖提取物。
实施例3:白及多糖BT10~BT110的制备
参照张燕文献方法(白及多糖的酸水解动力学研究,苏州大学硕士学位论文,2010)进行。
取实施例1白及多糖BT300约100g,用0.01mol/L HCl溶解配制为2.0%浓度,在75-95 ℃恒温水溶水解1.5-4h,中和至pH6-7,在50-60℃浴加入0.1g木瓜蛋白酶酶解6h,再加入0.5g活性炭煮沸30min,离心,过滤,滤液用200 nm微滤膜过滤,冷冻干燥,获得相应水解白及多糖(60-80g)。采用HPGPC法分析三种试制产品分子量,分别为BT110(Mw104 kD)、BT50(Mw46 kD)、BT20(Mw18 kD),均为纯度大于95%的均一多糖。
白及多糖的结构分析:以BT50为代表,对其结构进行分析,结果表明,BT50采用MALS分析分子量Mw 46 kD,多分散系数Mw/Mn = 1.457,HPGPC图谱(附图1)分析色谱峰纯度大于98%;全水解分析其单糖组成为甘露糖∶葡萄糖= 2.31。波谱分析:UV图谱(附图2)分析仅有195nm末端波长最大吸收峰;IR图谱(附图3)分析与文献报道白及多糖IR图一致,包括指纹区吸收峰、特征的乙酰基吸收峰(1742 cm-1);NMR分析:采用600M Hz核磁仪,D2O为溶剂,在60℃测定BT50的1H(附图4)、13C 和DEPT-135(附图5)以及2D–NMR谱图,测试结果表明,BT50主链为β-1→4构型连接的葡萄糖(G)和甘露糖(M),分子中有乙酰甲基取代(CH3),主要信号归属如下:1H-NMR:4.75(G1),3.95(G4),3.9(G5),3.95(G3),3.58(G2),3.9-4.2(G6);5.00(M1),4.10(M4),3.8(M5),4.00(M3),4.32/4.25(M2),3.9-4.2(M6);2.40(CH3)。13C-NMR:100.2(G1),76.3(G4),72.5(G5),71.8(G3),70.7(G2),58.32(G6);97.9(M1),74.2(M4),72.8(M5),69.2(M3),67.8(M2),58.3(M6);18.3和18.0(CH3)。上述波谱数据与文献报道(张燕,白及多糖的酸水解动力学研究,苏州大学硕士学位论文,2010)一致。
实施例4:魔芋多糖样品的制备
(1)魔芋多糖KGM500的制备:魔芋多糖粗品为市售品,其中所含魔芋多糖经HPGPC分析为Mw 456 kD的均一多糖。魔芋多糖粗品50g,加10L水配制为0.5%溶液,加入5g木瓜蛋白酶在50-60℃酶解12h,再加入10g活性炭煮沸30min,离心,过滤,滤液用1000 nm微滤膜过滤,减压浓缩至5L,加入1.5倍95%乙醇使沉淀,抽滤,60℃以下减压干燥,得魔芋多糖KGM500(38g)。
(2)魔芋多糖水解物的制备:参考实施例3方法进行。称取KGM 5g,0.01mol/L HCl溶解配制为0.5%浓度,在75-95 ℃恒温水溶水解1.5-4h,中和至pH6-7,加入0.5g活性炭煮沸30min,离心,过滤,滤液用200 nm微滤膜过滤,冷冻干燥,获得相应水解魔芋多糖(3.8-4.3g)。采用HPGPC法分析三种试制产品分子量,分别为KGM200(Mw214 kD)、KGM100(Mw92kD)、KGM50(Mw48 kD),均为纯度大于92%的均一多糖。
实施例5:白及多糖BT300口服液的制备
称取实施例1白及多糖BT300共20g,用1900 mL水溶解,采用450 nm水系微孔滤膜过滤,加水配制至终体积2L,分装为100ml/瓶口服液,120℃灭菌30min,得1.0% BT200口服液。
实施例6:白及多糖BT50注射剂的制备
按实施例3方法制备白及多糖BT50共40g,用950 mL注射用水溶解,加入0.5g注射用活性炭煮沸30min,过滤,滤液用220 nm水系微孔滤膜过滤,加注射用水配制至终体积2L,分装为100ml/瓶注射液,120℃灭菌30min,得2.0% BT50注射液。
实施例7:白及多糖BT50注射用冻干粉针的制备
按实施例3方法制备白及多糖BT50共100g,冻干保护剂甘露醇100g,以750 mL注射用水溶解,加入2.0g 针用活性炭,加注射用水至1000mL,室温搅拌30min,用0.22μm 微孔滤膜过滤,分装(每只0.5g),冷冻干燥,即得。
实验例1:葡甘露聚糖的升白作用考察
采用实施例1-4中不同分子量规格葡甘露聚糖样品,进行体内升白作用试验研究。
试验采用SPF级KM小鼠, 18-22g,雌雄各半,每组10只。采用一次性腹腔注射环磷酰胺(CTX,江苏盛迪医药有限公司,批号15062725)150mg/kg,建立白细胞减少症模型。各给药组在造模第2d开始给药,1次/d,连续5d;重组人源粒细胞集落刺激因子(rGh-CSF,长春金赛药业有限责任公司,批号201505008)皮下注射给药40μg/kg,连续给药5d;模型组和正常组给予同等体积的生理盐水。第7d测定动物外周血白细胞(WBC)的影响,和模型组进行统计比较组间差异。
(1)葡甘露聚糖口服给药的升白作用
采用实施例1-2的BT300、BT150(BJ-3),实施例4的KGM500、KGM100样品,灌胃给药50-200mg/kg,测定结果见表2。
注:与模型组比较,*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。
结果表明:测试的不同分子量的葡甘露聚糖样品口服给药50-200 mg/kg剂量时,均有一定升白作用。
张颖 “白芨多糖对骨髓造血及免疫功能的作用研究”(重庆医科大学,硕士学位论文,2009)报道,在环磷酰胺所致的小鼠造血功能损伤试验中,与模型组相比,白及多糖150mg/kg和500 mg/kg灌服给予,连续6天,呈剂量和时间依赖性升高骨髓造血功能低下小鼠的外周血白细胞数,并加快骨髓有核细胞数和脾集落形成细胞数的恢复。本试验结果进一步表明,确定分子量规格的高纯度葡甘露聚糖(白及多糖和葡甘露聚糖,10-50kD,纯度大于90%)均具有明确升白作用;同时不同分子量规格和来源的葡甘露聚糖药效不完全相同,因而应对葡甘露聚糖样品的分子量规格进行确定,以保证药效的重复性。
(2)白及多糖注射给药的升白作用
采用实施例3的BT20、BT50、BT110,实施例4的KGM50样品,尾静脉注射给药20-180 mg/kg,测定结果见表3。
注:与模型组比较,*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。
结果:本试验结果首次发现,测试的不同分子量规格的葡甘露聚糖(白及多糖和葡甘露聚糖,20-110kD)样品注射给药20-180 mg/kg时,均具有明确升白作用,其有效剂量显著低于口服给药。
Claims (10)
1.一种葡甘露聚糖在制备防治白细胞减少症药物中的应用,其特征在于:所述葡甘露聚糖为分子量范围10-500 kD的均一多糖,其纯度大于90%。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的葡甘露聚糖由D-甘露糖和D-葡萄糖组成,主链通过β-1→4位糖苷键连接,并带有部分支链结构和乙酰基修饰。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的葡甘露聚糖为天然来源的魔芋多糖、白及多糖或其水解产物。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述葡甘露聚糖为分子量范围20-300 kD的白及多糖。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的葡甘露聚糖可制成本领域药物制剂的各种常规剂型,包括口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂,注射液、冻干粉针。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于:口服制剂的优选给药剂量在50-200mg/kg范围。
7.如权利要求5所述的应用,其特征在于:注射剂优选给药剂量在20-200mg/kg范围。
8.如权利要求1-5任意一项所述的应用,其特征在于:所述葡甘露聚糖作为制剂的制备方法,采用以下步骤:
(1)选取葡甘露聚糖,采用水提取,蛋白酶进行酶解,加入活性炭助滤剂处理,过滤,滤液进一步采用100-1000 nm微滤膜过滤,浓缩,干燥,得葡甘露聚糖原料;
(2)由(1)所得葡甘露聚糖原料,经进一步配制,分装,灭菌,得葡甘露聚糖制剂。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于:所述步骤(1)中蛋白酶从商业途径获得和使用,其中优选木瓜蛋白酶;步骤(1)中干燥方法选自冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥中的一种,其中优选冷冻干燥。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于:所述步骤(2)中葡甘露聚糖制剂优选为注射制剂。
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