CN107397765A - 一种破壁灵芝孢子提取物及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种破壁灵芝孢子提取物及其提取方法和应用。本发明破壁灵芝孢子提取物在提取过程中，以环境友好的水、乙醇为溶剂，采用加热提取、透析膜过滤或超滤法等温和手段进行提取纯化，具有工艺简单、生产成本低、避免有机溶剂污染的优点，且该提取方法可以最大限度保留灵芝孢子提取物的活性；提取得到的破壁灵芝孢子提取物可用于制备辅助抗肿瘤药物、特殊医疗用途食品、功能性食品或保健品，特别适用于配合紫杉醇等抗肿瘤药物在抗癌治疗中使用，既可以提高紫杉醇等抗肿瘤药物的疗效，又可减少紫杉醇等抗肿瘤药物对机体产生的副作用，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属医药保健领域，更具体地说，本发明涉及一种可以提高抗肿瘤药物疗效的破壁灵芝孢子提取物及其提取方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类生命健康的重大疾病。目前恶性肿瘤的治疗手段包括手术、化学药物治疗、放射线治疗、免疫治疗，其中化疗是创伤较少、实施较简便的方法。常用的化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、环磷酰胺等)、抗代谢药(5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤等)、抗肿瘤抗生素(放线菌素、多柔比星等)、动植物成分药(紫杉醇、羟基喜树碱等)。然而，化疗药物在应用过程中常诱发过敏反应、骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性、肝脏毒性、胃肠道反应等不良反应。同时，化疗药物价格高昂，来源非常有限。因此寻找可有效降低化疗药物剂量、缓解不良反应的物质成为临床上亟待解决的问题。
灵芝是多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌的总称，在我国已有2000多年的应用历史，被我国重要药物经典《神农本草经》中列为“上品”。大量临床研究提示，灵芝在肿瘤治疗中有突出的减毒增效作用。灵芝孢子，是灵芝在生长成熟期从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞。目前针对灵芝孢子活性成分的研究已有不少报道，研究发现灵芝孢子具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、调节血脂降低血糖等药理活性。据临床研究报道，灵芝孢子不仅可改善癌症病人的生存质量，还可提高化疗药物的治疗效果。这些实验研究和临床报道均表明，灵芝孢子可通过调节人体免疫功能，提高生活质量，加速疾病的痊愈进程。破壁技术的进步，使破壁灵芝孢子的应用更为广泛。公开号为CN105267287A的中国专利申请披露了一种富含破壁灵芝孢子粉的中药抗肿瘤制剂及其制备方法，授权号为CN103755828B的中国专利公开了一种运用多种无机酸、有机酸，通过一系列步骤制备得到具有抗肿瘤活性的灵芝孢子多糖。
可见，灵芝孢子是当前从天然产物中开发肿瘤辅助药物的研究重点，但是目前尚未见通过简单、环境友好型试剂获得具有辅助抗肿瘤活性的灵芝孢子提取物的相关研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于：根据目前治疗肿瘤的药物，特别是紫杉醇存在资源匮乏和副作用大等问题，提供一种既可以提高抗肿瘤药物的抗肿瘤效果，还可以减少抗肿瘤药物对机体产生的副作用的破壁灵芝孢子提取物。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种破壁灵芝孢子提取物的提取方法，其包括如下步骤：
(1)取破壁灵芝孢子粉，加10～15倍重量水煎煮、过滤，得到的滤液再经减压浓缩至破壁灵芝孢子粉的1～2体积，得到浓缩液；
(2)在步骤(1)所得浓缩液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积分数为70～90％，静置过夜，取沉淀加水溶解，使其体积与所述浓缩液的体积相等，重复使用无水乙醇沉淀静置取沉淀加水溶解2～4次，得到粗提物；
(3)在步骤(2)所得粗提物中加入1～10倍体积水溶解过滤，得到的滤液经透析或超滤，截留1～120kDa分子量的成分，浓缩至干膏，即为破壁灵芝孢子提取物。
作为本发明破壁灵芝孢子提取物的提取方法的一种改进，步骤(2)中，所述无水乙醇的体积分数为85％。
作为本发明破壁灵芝孢子提取物的提取方法的一种改进，步骤(3)中，所述截留是截留3.5～100kDa分子量的成分。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种破壁灵芝孢子提取物，其是通过上述破壁灵芝孢子提取物的提取方法提取得到。
本发明破壁灵芝孢子提取物可用于制备辅助抗肿瘤药物、特殊医疗用途食品、功能性食品或保健品。特别适合将破壁灵芝孢子提取物与常见抗肿瘤化疗药物如紫杉醇等按照1∶1～20∶1的重量比配合使用，提高抗肿瘤化疗药物的抗肿瘤活性，并缓解抗肿瘤化疗药物对机体造成的不良反应。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种辅助抗肿瘤药物，其包括破壁灵芝孢子提取物，及药学上可接受的载体。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种特殊医疗用途食品，其包括破壁灵芝孢子提取物。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种功能性食品，其包括破壁灵芝孢子提取物。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种保健品，其包括破壁灵芝孢子提取物。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
本发明破壁灵芝孢子提取物在提取过程中，以环境友好的水、乙醇为溶剂，采用加热提取、透析膜过滤或超滤法等温和手段进行提取纯化，具有工艺简单、生产成本低、避免有机溶剂污染的优点，且该提取方法可以最大限度保留灵芝孢子提取物的活性；提取得到的破壁灵芝孢子提取物可用于制备辅助抗肿瘤药物、特殊医疗用途食品、功能性食品或保健品，特别适用于配合紫杉醇、环磷酰胺等抗肿瘤药物在抗癌治疗中使用，既可以提高抗肿瘤药物的疗效，又可减少它们对机体产生的副作用，具有良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明破壁灵芝孢子提取物及其提取方法和应用以及有益效果进行详细说明。
图1是本发明实验例1各组动物脾指数比较图。
图2是本发明实验例1各组动物胸腺指数比较图。
图3是本发明实验例1各组动物外周血白细胞参数比较图。
图4是本发明实验例1各组动物外周血红细胞参数比较图。
图5是本发明实验例1各组动物外周血血小板参数比较图。
图6是本发明实验例1各组动物外周血T细胞比例结果。
图7是本发明实施例1各组动物外周血B细胞比例结果。
图8是本发明实验例2各组动物肿瘤组织体积变化图。
图9是本发明实验例2各组动物肿瘤组织重量变化图。
图10是本发明实验例2各组动物外周血白细胞计数比例结果。
图11是本发明实验例2各组动物外周血T细胞计数比例结果。
图12是本发明实验例2各组动物外周血细胞毒性T细胞计数比例结果。
图13是本发明实验例2各组动物外周血辅助性T细胞计数比例结果。
图14是本发明实验例2各组动物肿瘤组织中细胞毒性T细胞比例结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
除非特别说明，本发明实施例采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1破壁灵芝孢子提取物的制备
(1)取市售破壁灵芝孢子粉100g，加1500mL水，100℃提取1h，离心，收集上清液，过滤，50℃下减压浓缩至约100ml，得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液，边搅拌边缓慢无水乙醇，使乙醇最终体积分数为85％，静置过夜，弃上清，保留沉淀；所得沉淀加适量水溶解，使其体积与上述浓缩液体积相当，重复上述乙醇沉淀、静置、弃上清、保留沉淀步骤3次；最终所得沉淀为粗提物。
(3)将步骤(2)所得粗提物，加150mL水溶解，过滤，滤液封装在截留分子量为3.5kDa的透析袋中，流动水透析过夜，保留截留液，转移至截留分子量为100kDa的透析袋中，用约12L水进行透析，分3次进行，每次4L，合并透过液，浓缩冻干为干膏，即得破壁灵芝孢子提取物。
实施例2破壁灵芝孢子提取物的制备
(1)取破壁灵芝孢子粉100g，加1000mL水，100℃提取1h，离心，收集上清液，过滤，滤液备用；重复上述提取步骤1次，合并提取液，60℃下减压浓缩至约150mL，得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液，边搅拌边缓慢无水乙醇，使乙醇最终体积分数为80％，静置过夜，弃上清，保留沉淀；所得沉淀加适量水溶解，使其体积与上述浓缩液体积相当，重复上述乙醇沉淀、静置、弃上清、保留沉淀步骤2次；最终所得沉淀为粗提物。
(3)将步骤(2)所得粗提物，加150mL溶解，过滤，滤液封装在截留分子量为2kDa的透析袋中，流动水透析过夜，保留截留液，转移至截留分子量为50kDa的透析袋中，用约12L水进行透析，分3次进行，每次4L，合并透过液，浓缩冻干为干膏，即得破壁灵芝孢子提取物。
实施例3破壁灵芝孢子提取物的制备
(1)取破壁灵芝孢子粉100g，加1500mL水，煎煮1h，离心，收集上清液，过滤，滤液备用；重复上述提取步骤1次，合并煎煮液，过滤，得滤液，在70℃减压浓缩至约200mL，得浓缩液；
(2)将步骤(1)所得浓缩液，边搅拌边缓慢无水乙醇，使乙醇最终体积分数为90％，静置过夜，弃上清，保留沉淀；所得沉淀加适量水溶解，使其体积与上述浓缩液体积相当，重复上述乙醇沉淀、静置、弃上清、保留沉淀步骤4次；最终所得沉淀为粗提物。
(3)将步骤(2)所得粗提物，加750mL水溶解，过滤，所得滤液，用超滤法(截留分子量为5kDa)，除去其中小于5kDa分子量的成分，保留截留液，采用超滤法(截留分子量为100kDa)，保留透过液，浓缩至干膏，即得破壁灵芝孢子提取物。
实验例1破壁灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子提取物对环磷酰胺免疫抑制作用的改善
1、材料与方法
(1)造模与给药
取Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄。适应性饲养3～7天后，按体重随机分为正常组(10只)，模型组(10只)，左旋咪唑组(10只)，市售破壁灵芝孢子粉组(2000mg/kg，10只)，破壁灵芝孢子提取物高、中、低剂量组(400mg/kg，200mg/kg，100mg/kg，各10只)。各药物组连续灌胃给药30天，正常组、模型组给予等体积纯净水。给药第21、22、23天，除正常组以外，其余各组动物腹腔注射环磷酰胺(60mg/kg)，正常组注射等体积生理盐水。
(2)取材与检测
实验过程中，每3天记录一次体重。末次给药24h后，眼眶静脉丛采集血液，部分置于洁净EDTA-K2抗凝管中，血常规分析仪检测其中白细胞、红细胞、血小板浓度；部分置于洁净肝素锂抗凝管，流式细胞术分析其中T细胞(CD3+)，B细胞(CD19+)比例。剖取胸腺和脾脏，计算脏器指数。
(3)结果
如图1～2所示，给药30天后，破壁灵芝孢子粉及破壁灵芝孢子提取物可提高免疫抑制动物的脾指数，而破壁灵芝孢子提取物还可提高该动物的胸腺指数。另一方面，破壁灵芝孢子提取物可提高模型动物外周血中白细胞、红细胞数量，而破壁灵芝孢子粉对此无明显作用(图3～5)。此外，破壁灵芝孢子粉及破壁灵芝孢子提取物均能提高外周血中T细胞比例，但降低B细胞比例(图6～7)。上述结果表明，说明破壁灵芝孢子提取物改善化疗药物环磷酰胺引起的免疫抑制作用的效果优于破壁灵芝孢子粉。
实验例2破壁灵芝孢子提取物联合紫杉醇的抗肿瘤实验
1、材料与方法
(1)造模与给药
取Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄。适应性饲养3～7天后，按体重随机分为正常组(10只)和荷瘤组(40只)。荷瘤组接种4T1乳腺癌细胞(2×105个/只)，建立小鼠乳腺癌模型。造模24h后各组按表1给药21天，连续21天，正常组和模型组给予等体积生理盐水。
表1分组与给药信息
(2)取材与检测
实验过程中，每3天记录一次体重。从第7天开始，每三天测量一次肿瘤的最长直径(a)和最短直径(b)，按以下公式估算肿瘤体积：V(mm3)＝a×b2/2。末次给药后24h，脱臼处死各组动物，剖取肿瘤，记录肿瘤重量，比较各组差异。
同时从眼眶静脉丛采集静脉血，部分置于洁净EDTA-K2抗凝管中，血常规分析仪检测其中白细胞、红细胞、血小板浓度；部分置于洁净肝素锂抗凝管，流式细胞术分析其中T细胞(CD3+)，辅助性T细胞(Th，CD3+CD4+)，细胞毒性T细胞(Tc，CD3+CD8+)比例。
剖取肿瘤后，按以下方法提取肿瘤浸润淋巴细胞，流式细胞术分析其中T细胞，Th细胞，Tc细胞比例：
①剥取肿瘤组织，PBS洗去组织上的血细胞，在2mL无血清RPMI1640培养基(含0.1％IV型胶原酶、350U/mLDNA酶、1％双抗)中剪碎分散，37℃振摇孵育4h，在200目细胞滤器上研磨，PBS缓冲液冲洗，离心收集细胞，0.5m L无血清RPMI1640培养基重悬。
②在15mL离心管中加入2mL淋巴细胞分离液和2mL无血清RPMI1640培养基，避免两种液体界面混合。将上述细胞悬液滴加在上层液体上，离心(800g，室温，15～20min)，设置较慢的加速度和减速度(如果有十档，设为第三档)。
③吸出中间云雾状淋巴细胞层，再加入5mL RPMI 1640培养基，颠倒洗涤。室温，300g离心10min收集细胞。
(3)结果
如图8、图9所示，给药21天后，紫杉醇组和联合用药组(高、低剂量组)可明显抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤组织的体积和重量明显下降，且联合用药组的抑制效果优于紫杉醇组。此外，联合用药可明显降低由紫杉醇引起的死亡(表2)。说明联合用药可有效缓解紫杉醇在治疗过程中引起的不良反应。
表2动物存活情况
对各组动物进行血常规分析表明，紫杉醇使荷瘤动物血液中白细胞比例明显下降(图10)，而联合用药可明显提高白细胞比例，说明破壁灵芝孢子提取物可有效缓解紫杉醇引起的骨髓抑制反应。进一步对外周血中T细胞比例，以及Th细胞，Tc细胞比例进行分析发现，与紫杉醇相比，破壁灵芝孢子提取物可显著提高T细胞比例，尤其可明显提高其中Tc细胞的比例(图11～13)；此外，进一步分析肿瘤浸润淋巴细胞组成发现，联合用药可提高其中Tc细胞比例(图14)。上述结果说明，本发明提取方法提取得到的破壁灵芝孢子提取物在缓解紫杉醇骨髓抑制不良反应的同时，可通过增强机体适应性免疫功能，进一步提高紫杉醇的抗肿瘤效果。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种破壁灵芝孢子提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
(1)取破壁灵芝孢子粉，加10～15倍重量水煎煮、过滤，得到的滤液再经减压浓缩至破壁灵芝孢子粉的1～2体积，得到浓缩液；
(2)在步骤(1)所得浓缩液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积分数为70～90％，静置过夜，取沉淀加水溶解，使其体积与所述浓缩液的体积相等，重复使用无水乙醇沉淀静置取沉淀加水溶解2～4次，得到粗提物；
(3)在步骤(2)所得粗提物中加入1～10倍体积水溶解过滤，得到的滤液经透析或超滤，截留1～120kDa分子量的成分，浓缩至干膏，即为破壁灵芝孢子提取物。
2.根据权利要求1所述的破壁灵芝孢子提取物的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述无水乙醇的体积分数为85％。
3.根据权利要求1所述的破壁灵芝孢子提取物的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述截留是截留3.5～100kDa分子量的成分。
4.一种破壁灵芝孢子提取物，其特征在于，由权利要求1～3中任意一条权利要求所述提取方法提取得到。
5.权利要求4所述破壁灵芝孢子提取物在制备辅助抗肿瘤药物、特殊医疗用途食品、功能性食品或保健品中的应用。
6.根据权利要求5所述破壁灵芝孢子提取物的应用，其特征在于，所述破壁灵芝孢子提取物与抗肿瘤化疗药物按照1∶1～20∶1的重量比配合使用，提高抗肿瘤化疗药物的抗肿瘤活性，并缓解抗肿瘤化疗药物对机体造成的不良反应。
7.一种辅助抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求4所述的破壁灵芝孢子提取物，及药学上可接受的载体。
8.一种特殊医疗用途食品，其特征在于，包括权利要求4所述的破壁灵芝孢子提取物。
9.一种功能性食品，其特征在于，包括权利要求4所述的破壁灵芝孢子提取物。
10.一种保健品，其特征在于，包括权利要求4所述的破壁灵芝孢子提取物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20171128 |