CN107802646A - 一种肿瘤治疗药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种红细胞囊泡来源的肿瘤治疗药物，包含红细胞囊泡和包裹于所述红细胞囊泡中的治疗药，其中所述红细胞囊泡为凋亡后的红细胞释放的囊泡，所述治疗药为作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。作为靶向药物，本发明的药物能更好地靶向作用于肿瘤部位，提高化疗药的药效，同时极大减轻了使用外源载体运载药物给药对机体的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肿瘤药物，尤其涉及一种红细胞囊泡来源的肿瘤化疗药物。
背景技术
随着人类居住的生态环境日益恶化，诱导人类肿瘤疾病高发，而肿瘤已成为严重威胁着人类健康的重大疾病，如何对其进行有效治疗一直是科学届致力研究的课题。其中，最常规的肿瘤治疗方法为化疗，在消灭肿瘤细胞的同时，也会杀伤正常细胞，不仅给肿瘤患者带来严重的毒副作用，甚至往往导致肿瘤患者化疗的失败。
化疗药物对机体的毒副作用的本质是化疗药物对正常组织细胞的杀伤。为有效避免化疗药物对正常组织细胞的非特异性杀伤，人们通过载体工具将化疗药物包裹起来，选择性地作用于肿瘤部位释放，甚至作用于肿瘤细胞内部，进而杀伤肿瘤细胞，常规的如由纳米材料人工合成的微载体包括：PLGA(聚乳醛乙醇酸共聚物)、脂质体、PEG-PE(聚乙二醇-脑磷脂共聚物)等，已被用于包裹化疗药物，并证实可以将化疗药物输送到肿瘤部位，提高药物对肿瘤细胞的杀伤作用。由于纳米材料相对于机体是外源性物质，其本身对生物体存在毒副作用；同时，目前应用于临床的纳米颗粒的粒径规格极易通过正常组织细胞，进一步增加了它对机体的毒副作用；另外，一些纳米颗粒是由所特定材料及复杂的工艺加工而成，造成纳米颗粒载体成本高企，不利于临床推广应用。
因此，研制出一种纳米级运载体来降低化疗药物对机体毒副作用，同时又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力成为肿瘤治疗领域亟待解决的问题。
中国专利申请201110241369.8公开了一种肿瘤化疗药物制剂，其采用凋亡肿瘤细胞囊泡包裹化疗药物制成，虽然相对于其他纳米药物有一些优势，仍存在细胞来源受限、生产成本较高等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种红细胞囊泡来源的肿瘤治疗药物，将来源于红细胞凋亡所产生的囊泡作为肿瘤治疗药物的载体包裹药物而成，作为靶向药物，能更好地靶向作用于肿瘤部位，提高药物的药效，同时极大减轻了使用外源载体运载药物给药对机体的毒副作用。包裹相同化疗药的前提下，源自凋亡红细胞的细胞囊泡比源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡对肿瘤的治疗效果更好。
根据本发明的一方面，提供一种肿瘤治疗药物，包含红细胞囊泡和包裹于所述红细胞囊泡中的治疗药，其中所述红细胞囊泡为凋亡的红细胞释放的囊泡，所述治疗药为作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。
作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药可以是任何被临床使用的对治疗肿瘤有效的药物，包括但不限于各种化疗剂、生物制剂、某些中药制剂等。在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供的一种上述红细胞囊泡来源的肿瘤化疗药物，为将作为治疗有效成分的化疗药包裹到来源于红细胞凋亡所产生的囊泡中。
更具体地，本发明提供的上述红细胞囊泡来源的肿瘤化疗药物，包括来源于红细胞凋亡所产生的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药。
本发明提供的上述红细胞囊泡来源的肿瘤化疗药物，用于包裹化疗药的红细胞囊泡(载体)为来源于普通人的红细胞凋亡而成，本发明中所述的包裹于红细胞囊泡中的化疗药，可以为本发明申请日以前和\或以后被临床应用的化疗药，也可以是本发明申请日以前和\或以后被临床应用的化疗药中的有效成分(可以不含有或不完全含有药物辅料)，即，制备本发明的药物时，可以使用治疗肿瘤的临床用药组成中的有效成分，也可以直接使用已经临床应用于肿瘤治疗的各种商购药。所以，本发明中所涉及的药物剂量，均应理解为该药物的有效成分量。具体化疗药可以是临床上用于治疗各类肿瘤的化疗药，如：肺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌或胶质瘤等的化疗药，可以是单一化疗药或多种化疗药联合。
根据本发明药物的优选方案，所包含的化疗药可以是已经在临床上使用的药物，如：注射制剂，口服制剂或片剂、粉剂、颗粒剂(可以将其溶解后使用，溶解后与红细胞囊泡进行孵育以包裹进红细胞囊泡)。
作为本发明的优选实施方案，由所述红细胞囊泡包裹药物所形成的肿瘤治疗药物制剂的粒径为50-500nm。所述基于红细胞来源的肿瘤化疗药物中含有的化疗药的剂量受在制备过程中加入到红细胞培养液的化疗药的量的多少所控制，但最大药物含量取决于所用的化疗药在红细胞囊泡中的最大饱和度。所以，在该最大药物含量范围内，可以得到不同规格的药剂。
本发明还提供了制备所述红细胞囊泡来源的药物的方法，即通过任何可行的方法将肿瘤治疗药物包裹进所述红细胞囊泡，所使用的红细胞囊泡通过使红细胞凋亡而得到。
用作包裹药物的红细胞囊泡可以使用任何能使红细胞凋亡的方法获得，这些使红细胞凋亡的方法包括但不限于：将红细胞与化疗剂、放射线、紫外线接触，使得红细胞凋亡。再将所需要的肿瘤治疗药物与凋亡的红细胞接触，使所述药物被包裹进入凋亡的红细胞中，获得本发明的药物制剂。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供的所述的基于红细胞来源的肿瘤治疗药物的制备方法，包括：对红细胞施用化疗药使之凋亡，收集凋亡红细胞所释放的包药囊泡，该包药囊泡即为红细胞囊泡包裹治疗肿瘤的化疗药后形成的所述药物；或者使用紫外线照射红细胞，使红细胞凋亡，收集凋亡红细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述红细胞囊泡与治疗肿瘤的药物进行孵育，使所述治疗药物被红细胞囊泡包裹，然后收集包药囊泡，该包药囊泡即为红细胞囊泡包裹治疗药物后形成的所述药物；或者使用紫外线照射后立即加入作为有效成分的化疗药物，促使红细胞凋亡，收集凋亡红细胞所释放的包药囊泡，该包药囊泡即为红细胞囊泡包裹治疗药物后形成的所述药物。
本发明所述诱导红细胞凋亡，可以按照本领域技术人员公知的判断标准，例如观察红细胞缩小、变暗，即可认为其已经凋亡；将红细胞囊泡与化疗药进行孵育使红细胞囊泡包裹化疗药可以通过在常温条件将添加了化疗药的红细胞囊泡体系进行2-4小时的静置来实现。
本发明所述的方案中，优选使用紫外照射或化疗药物诱导红细胞凋亡，对于红细胞囊泡的收集可使用常规离心机和冷冻高速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过高速离心机，在低温条件下(4℃左右)，以500-50,0000g的离心力，收集细胞囊泡。同样的，对于包裹药物的红细胞囊泡的收集也可使用超速离心机在低温条件下进行。优选的，通过离心机，在低温条件下(4℃左右)，以500-50,0000g的离心力，收集包裹药物的红细胞囊泡。优选的收集红细胞囊泡的方法为密度梯度离心法，以1000-50,0000g的离心力，收集红细胞囊泡。对于使用紫外线照射红细胞获得的红细胞囊泡与治疗肿瘤的化疗药的孵育，优选的，化疗药以接近该化疗药在红细胞囊泡载体中的最大饱和度的量加入到红细胞囊泡中，并在常温条件下孵育，最终使得化疗药被红细胞囊泡包裹。
对于所收集到的包裹药物的红细胞囊泡，可以按照常规方法制成药物制剂，如注射制剂。例如，将收集到的包裹药物的红细胞囊泡用生理盐水悬浮后制成注射液。
本发明提供的基于红细胞来源的包药囊泡可以按照常规临床治疗方法给药，例如针对膀胱癌可以经尿道膀胱灌注将所述基于红细胞来源的包药囊泡制剂靶向给药到膀胱癌肿瘤，对于卵巢癌肿瘤可以直接腹腔注射给药，给药剂量可按照或者低于所施用的化疗药的常规剂量进行使用。
根据本发明的药物，通过控制化疗药的加入量从而获得不同规格(有效成分的含量)的药物制剂，方便对不同阶段的肿瘤患者的给药。所得到的药物囊泡中化疗药物含量可以根据所选择的药物的性质、该药物对特定肿瘤的给药情况以及所要治疗的肿瘤患者的患病阶段等实际情况而确定。
本领域技术人员可根据所要治疗的肿瘤类型及所使用的作为有效成分的化疗药的不同，根据以上描述的基于红细胞来源的肿瘤化疗药物的制备方法，选择适当的诱导红细胞凋亡的方法，收集包裹药物的红细胞囊泡的方法及合适的红细胞囊泡与治疗肿瘤的化疗药量的比例等条件，只要最终获得的红细胞囊泡内包裹的作为有效成分的化疗药足以发挥所期望的治疗效果即可。
根据本发明的另一方面，也提供含有本发明肿瘤治疗药物的药物组合物，可以将本发明的药物添加药学和/或生理学上可接受的各种辅料和/或添加剂而制备药物组合物。优选的药物组合物以液体制剂的形式提供，其含有PBS缓冲液或生理盐水。
作为本研究领域的基础知识，细胞的球状结构是通过细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到外来条件(例如：化疗药、紫外照射等)刺激时，会诱导细胞发生凋亡。此时，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝失去附着断裂，向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中。目前，人们已经将这种细胞囊泡包裹化疗药物制成药物制剂，被称为“包药囊泡”。而所应用的细胞囊泡多为基于肿瘤细胞来源的细胞囊泡，其粒径大小在100-1000nm。而本发明所提供基于红细胞来源的细胞囊泡，其粒径大小在50-500nm。相比肿瘤细胞来源的包药囊泡，本发明所述的基于红细胞来源的包药囊泡具有良好的均一性，能更加高效通过肿瘤毛细血管组织杀伤肿瘤细胞(在机体的肿瘤部位，组成其血管的细胞之间的缝隙增大到100-780nm)，而对正常组织不会产生任何损伤(机体正常组织的通透性一般在5-10nm)，在包裹相同化疗药物及含药量相等的前提下，红细胞来源细胞囊泡比肿瘤细胞来源细胞囊泡数量更多、粒径更小，能容易地被肿瘤细胞的摄取，其治疗肿瘤效果比肿瘤细胞来源的细胞囊泡更好；同时克服了肿瘤细胞来源的包药囊泡的一些重大缺陷，首先，相对于肿瘤细胞，因机体内红细胞的数量远多于肿瘤细胞，无需像肿瘤细胞一样要进行大规模扩大培养，可以直接从机体获取，从而极大的降低了生产成本；其次一种肿瘤细胞来源的包药囊泡只能治疗与该肿瘤细胞相关的癌肿，而红细胞来源的包药囊泡可以同时治疗多种癌肿，进而扩大了肿瘤治疗的类型和范围；因此本发明的基于红细胞来源的肿瘤化疗药物制剂在治疗肿瘤的过程中可根据实际情况适当降低该药物制剂的给药量或选择化疗药量的规格较小的药剂进行包裹，以达到与直接进行化疗时同样的治疗效果。
更具体的，本发明公开的红细胞囊泡来源的肿瘤治疗药物具有如下优点：
1、本发明所述的药物通过用红细胞囊泡包裹肿瘤治疗药可减少外源载体给药对机体的毒副作用，使药物靶向作用肿瘤部位，减轻了药物对机体的毒害作用，提高了药效。
3、本发明的基于红细胞来源的肿瘤化疗药物，其包裹药物的红细胞囊泡粒径(50-500nm)相比于包裹药物的肿瘤细胞囊泡的粒径(100-1000nm)更小、更均一。因此，包裹药物的红细胞囊泡比包裹药物的肿瘤细胞囊泡更稳定、更容易进入肿瘤细胞内。在含药量相等的情况下，包裹药物的红细胞囊泡比包裹药物的肿瘤细胞囊泡数量更多、粒径更小。所以，包裹药物的红细胞囊泡更容易被肿瘤细胞所摄取，治疗效果比包裹药物的肿瘤细胞囊泡更好。
4、相同数量的红细胞、肿瘤细胞，红细胞产生细胞囊泡的收益率比肿瘤细胞产生细胞囊泡的收益率更高。
5、本发明的基于红细胞来源的包药囊泡的结构比肿瘤细胞来源的包药囊泡更稳定。因为，经1％TrtionX-100和不同浓度的SDS的溶液处理后，红细胞来源的包药囊泡的数量及对肿瘤细胞的杀伤效果均优于肿瘤细胞来源的包药囊泡。同时在4℃条件存贮可延长红细胞来源的包药囊泡活性，且中性或弱碱性(pH7～pH 8.5)环境更有利于红细胞来源的包药囊泡的存储。
6、相对于肿瘤细胞而言，红细胞来源于人体血液，可直接采取人的血液获得，无需进行大规模细胞培养，成本小，操作简单。
7、相对于肿瘤细胞而言，红细胞囊泡可以针对绝大部分肿瘤，而一种肿瘤细胞囊泡只针对于产生该肿瘤细胞囊泡的肿瘤，扩大了肿瘤的治疗类型和范围，降低了成本和风险，使得操作更简洁。
附图说明
图1-1为包裹药物的红细胞囊泡场发射扫描电镜图，显示了红细胞来源囊泡的形态；
图1-2为包裹药物的H22肿瘤细胞囊泡场发射扫描电镜图，显示了H22肿瘤细胞来源囊泡的形态；
图1-3为红细胞来源囊泡粒径检测结果，显示了红细胞来源囊泡的粒径大小；
图1-4为H22-MPs粒径检测结果，显示了H22细胞来源囊泡的粒径大小；
图1-5显示了单位细胞内包裹药物的红细胞囊泡、包裹药物的H22肿瘤细胞囊泡的收益率；
图2显示了红细胞囊泡、H22肿瘤细胞囊泡包裹甲氨蝶呤含量；
图3显示了包裹药物的红细胞囊泡对多种肿瘤细胞的杀伤效果；
图4-1显示了经不同有机溶剂储存24小时后的包裹药物的红细胞囊泡、包裹药物的H22肿瘤细胞囊泡数量之间的差异；
图4-2经不同有机溶剂储存24小时后的包裹药物的红细胞囊泡、包裹药物的H22肿瘤细胞囊泡对H22细胞杀伤效果；
图5-1显示了在不同环境条件下包裹药物的红细胞囊泡数量随存储天数的变化；
图5-2显示了在不同pH条件下包裹药物的红细胞囊泡数量随存储天数的变化；
图6-1显示了在不同环境条件不同存储天数下包裹药物的红细胞囊泡对H22细胞杀伤效果；
图6-2显示了在不同pH条件不同存储天数下包裹药物的红细胞囊泡对H22细胞杀伤效果；
图7显示了BABL/c小鼠肝癌腹水模型生存曲线；
图8显示了C57BL/6小鼠肺癌模型生存曲线；
图9-1显示了各实验组BABL/c小鼠谷丙转氨酶和血清肌酐含量；
图9-2显示了各实验组BABL/c小鼠凝血中APTT和PT值。
具体实施方式
为了说明本发明的技术方案，证实红细胞来源的细胞囊泡能够包裹化疗药，包裹了化疗药的红细胞囊泡对肿瘤细胞能够有效杀伤，并且在体内不产生明显的毒副作用，下面结合附图和实施例进一步说明本发明，下述实施例不构成对本发明的任何限制。
本发明使用的术语“肿瘤细胞囊泡”是由凋亡肿瘤细胞产生的，没有包裹化疗药物；“红细胞囊泡”是由凋亡红细胞产生的，没有包裹化疗药物；包裹药物的细胞囊泡称为包裹药物的肿瘤细胞囊泡或包裹药物的红细胞囊泡。
下述为实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物、实验动物、仪器设备及部分溶液配制：
细胞：H22小鼠肝癌细胞(H22细胞)、A2780人卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MGC-803、人结直肠癌T84、人肝癌细胞系HepG2、人卵巢癌细胞系Ho-8910、人宫颈癌细胞系Hela、人前列腺细胞系PC-3、人食管癌细胞系EC109、人鼻咽癌细胞系CNE、人肾癌细胞系A498、人皮肤鳞癌细胞系A-431、人淋巴母细胞NCI-BL2009、人纤维肉癌细胞HT-1080、人膀胱癌细胞系T24、人白血病细胞系K562、人早幼粒白血病细胞HL60、人黑色素瘤细胞A875、人急性淋巴细胞性白血病细胞MOL7-4、人红白细胞白血病HEL以及人胶质瘤细胞系U251，均可从美国ATCC公司或中国典型培养物保藏中心CCTCC购买。
试剂及药品：3μm商业化标准磁珠(细胞囊泡相对计数磁珠)购自美国SIGMA-ALDRICH公司、甲氨蝶呤(MTX)购自同济医学院附属同济医院(武汉)。
其他未特别言明均为市售
实验动物：BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠购自湖北省疾病预防控制中心下属的湖北省医学实验动物研究中心；
仪器设备：Sirion 200型场发射扫描电镜、Nano ZS90纳米粒径电位仪、BDFACSCantoII型流式细胞仪、UItiMate 3000型高效液相色谱仪
溶液配制
细胞囊泡破膜液：20mM Tirs-HCl，1％TritonX-100，150mM NaCl，1mM EDTApH7.5。
注：以下实施例中，对照组简称为control，包裹MTX的红细胞囊泡给药组简称为Ery-MPs(MTX)，包裹MTX的H22肿瘤细胞囊泡给药组简称为H22-MPs(MTX)，包裹MTX的Lewis肺癌细胞囊泡给药组简称为LLC-MPs(MTX)，化疗药甲氨蝶呤给药组简称为MTX。
【实施例1】：紫外线诱导小鼠肝癌细胞、小鼠红细胞凋亡产生细胞囊泡与化疗药孵育后获得包裹化疗药的细胞囊泡的形态观察及粒径测定
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，正常小鼠红细胞，甲氨蝶呤。
2、实验步骤
1)用1640细胞培养液培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞总数量达到3×108；采集一定量的正常小鼠血液到抗凝血管，加等量的PBS，混匀。选用2000rpm离心5分钟，去上清。用无Ca2+、Mg2+Hank’s液将红细胞洗涤3次，前2次2000rpm离心5分钟，后一次2000rpm离心10分钟，去上清。选用血球计数板，计算红细胞浓度，从中取出总数量为3×108的小鼠红细胞。
制备三份上述H22细胞、正常小鼠红细胞。将每份上述细胞分别转移至10ml 1640细胞培养液中，然后进行紫外照射1h，之后添加化疗药甲氨蝶呤使其在培养液中的药物浓度达到1mg/ml，孵育20h。
2)将所得到的H22-MPs(MTX)和Ery-MPs(MTX)培养液，分别进行逐步离心取上清液，即以2000rpm、5000rpm的转速各离心10分钟，以除去细胞及碎片。
将所得的上述两种上清液以14000g的离心力离心1.5分钟，取离心后的上清进一步离心，再以14000g的离心力离心1h，弃掉上清液，然后用PBS漂洗沉淀表面，最后分别用1ml PBS重悬，即得到三份H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)。
3)将其中一份H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)进行场发射扫描电镜扫描拍照前处理：细胞囊泡的固定、脱水、冷冻真空干燥、上镜前导电处理。
细胞囊泡的固定：用PBS漂洗H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)表面，然后以14000g的离心力离心1h，分别得到H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)沉淀。然后用500μl 2.5％的戊二醛分别重悬，在4℃条件下避光过夜，吸出固定剂(2.5％的戊二醛)。1ml PBS清洗10min，之后以14000g的离心力离心1h，重复一遍。再用500μl 2.5％的戊二醛固定1h，然后1ml PBS清洗10min，之后以14000g的离心力离心1h，重复一遍。
细胞囊泡的脱水：将上述经2.5％的戊二醛固定所得的H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)沉淀分别用丙酮、醋酸异戊酯混合液(丙酮：醋酸异戊酯混合液＝1：1)脱水10min，之后以14000g的离心力离心1h，将所得的两种沉淀分别用醋酸异戊酯脱水30min，之后以14000g的离心力离心1h。
细胞囊泡的冷冻真空干燥：将经脱水处理的H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，用少量无菌清水重悬后，立即放置在4℃冰箱中预冷10min，之后放入-20℃冰箱中冷冻处理2h。之后，将冷冻样品进行冷冻真空干燥处理。
细胞囊泡的导电处理：选择合适的铜导电台，上方贴上铝导电胶，扫描面贴上碳导电胶。之后，将干燥样品分别均匀的涂在铝导电胶表面。然后进行样品表面喷射铂金处理。
样品经过上述步骤处理后，送入场发射扫描电镜观察台，进行扫面预处理。之后，场发射扫面样品，选取合适的视野进行拍照记录。
4)将另一份H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液以14000g的离心力，再次离心1h，所得沉淀物质分别用1ml PBS重悬。然后，用纳米粒度电位分析仪(DLS)分别测定样品的粒径。
5)将剩余的一份H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液分别与一定体积的已知浓度的3μm商业化标准磁珠溶液混合配制成流式计数液，然后流式细胞仪进行计数。根据流式计数所得的细胞囊泡数量与已知浓度的3μm磁珠数量的比值，即可算出H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液的浓度。最后，分别计算出H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)的收益率。
3、实验结果
图1-1、图1-2的结果显示，经过扫描电镜制样处理后，H22-MPs(MTX)的表面形态有一定程度的变化，而Ery-MPs(MTX)基本上可以保持椭球形。间接说明了Ery-MPs(MTX)比H22-MPs(MTX)更易保持椭球形结构。同时，Ery-MPs(MTX)的粒径较为均一，而H22-MPs(MTX)的粒径较为分散。图1-3、图1-4的粒径测定结果显示，Ery-MPs(MTX)的平均粒径在225nm左右，H22-MPs(MTX)的平均粒径在428nm左右，H22-MPs(MTX)的平均粒径约为Ery-MPs(MTX)平均粒径的2倍。
图1-5结果显示，1×108的H22细胞产生细胞囊泡的收益率约为14.67％；1×108的红细胞产生细胞囊泡的收益率约为31.45％。红细胞来源细胞囊泡的收益率约为H22细胞来源细胞囊泡的2.15倍。
【实施例2】：H22细胞来源囊泡与小鼠红细胞来源囊泡包裹化疗药物(甲氨蝶呤)含量检测
1、实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，小鼠红细胞，甲氨蝶呤，高效液相色谱仪。
2、实验步骤
1)用1640细胞培养液培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量总数达到1×108；按照实施例1的方法采集小鼠血液，分离红细胞，计算红细胞浓度。从中取出总数为1×108的小鼠红细胞。
2)按照实施例1的方法分别制备、分离提取H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)。
3)按照实施例1的方法分别对H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)进行计数，然后分别算出H22-MPs(MTX)溶液、Ery-MPs(MTX)溶液的浓度。
4)分别取1×107H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，将其分别用PBS稀释至1ml，然后以14000g的离心力离心1h，去上清，将得沉淀，用500μLPBS清洗重悬，重复两次。
5)将上述所得500μLH22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液，以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀。用细胞囊泡破膜液裂解，冰上孵育30分钟，用超声破碎仪破碎至少40秒，之后1000g离心5分钟，留上清。
在上清中加入两倍体积的乙腈，并剧烈震荡以沉降蛋白，之后1000g离心3分钟，留上清。再次在上清中加入四倍体积的氯仿，以去除脂类物质。之后2000g离心10分钟。
收集上述两种上清，高效液相色谱法分别检测上清液中药物含量。其中，流动相是0.05M KH2PO4，10％乙腈，pH6.6，流速为1ml/min。柱温为40℃，甲氨蝶呤的紫外吸收波长为304nm。最后，分别计算两种收集上清的甲氨蝶呤含量。
3、实验结果
图2结果显示，1×107Ery-MPs(MTX)包裹甲氨蝶呤的含量约为1.12μg，1×107H22H22-MPs(MTX)包裹甲氨蝶呤的含量约为3.43μg。相同数量的H22细胞来源囊泡包裹甲氨蝶呤含量是红细胞来源囊泡包裹甲氨蝶呤含量的3.0625倍。
【实施例3】：人红细胞凋亡产生的囊泡包裹甲氨蝶呤对多种肿瘤细胞的杀伤效果
1、实验材料和试剂
人不同肿瘤细胞系包括：A2780人卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系MGC-803、人结直肠癌T84、人肝癌细胞系HepG2、人卵巢癌细胞系Ho-8910、人宫颈癌细胞系Hela、人前列腺细胞系PC-3、人食管癌细胞系EC109、人鼻咽癌细胞系CNE、人肾癌细胞系A498、人皮肤鳞癌细胞系A-431、人淋巴母细胞NCI-BL2009、人纤维肉癌细胞HT-1080、人膀胱癌细胞系T24、人白血病细胞系K562、人早幼粒白血病细胞HL60、人黑色素瘤细胞A875、人急性淋巴细胞性白血病细胞MOL7-4、人红白细胞白血病HEL以及人胶质瘤细胞系U251。
正常人的红细胞、化疗药甲氨蝶呤。
2、实验步骤
1)在DMEM血清培养液中分别培养上述肿瘤细胞系，以用于肿瘤细胞杀伤实验。采集人血液按照实施例1的红细胞收集方法，收集相应红细胞，并计算红细胞液积压中红细胞浓度。Ery-MPs(MTX)制备方法同实施例1。
2)对照组为1×105肿瘤细胞的正常培养，实验组则在培养体系中添加Ery-MPs(MTX)，(实验组中为2×106Ery-MPs(MTX)加入到1×105数量的肿瘤细胞中)。Ery-MPs(MTX)与肿瘤细胞孵育48小时之后，将每孔中液体转移至EP管中，500g离心6分钟，收集细胞沉淀。弃上清，PBS重悬清洗1次。之后，弃上清，加入100μl Bind Buffer重悬细胞沉淀。避光条件下，加入1.5μlAnnexin V和1μl PI染料，混匀。室温孵育15分钟之后，加入200μl BindBuffer。然后，用流式细胞仪检测实验组、对照组肿瘤细胞的死亡状况，结果如图3所示。
3、实验结果
由图3可以看出，包裹甲氨蝶呤的人红细胞囊泡对各肿瘤细胞均具有良好的杀伤效果，说明本发明提供的基于红细胞来源的肿瘤化疗药物适用于多种肿瘤细胞，效果良好。
【实施例4】：比较不同有机溶剂储存Ery-MPs(MTX)、H22-MPs(MTX)之间的稳定性差异及对肿瘤细胞杀伤的效果
1.实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞，小鼠红细胞，甲氨蝶呤，1％TrtionX-100，1％SDS，0.1％SDS，0.01％SDS，PBS。
紫外线装置为常规细胞超净工作台所有。
2、实验步骤
1)用1640细胞培养液培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量总数达到4×109；按照实施例1的方法采集小鼠血液，分离红细胞，计算红细胞浓度。从中取出总数为4×109的小鼠红细胞。
2)按照实施例1的方法分别制备、分离提取H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，分别用2ml PBS重悬H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)。然后，按照实施例1的方法进行计数，分别算出H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液浓度。
3)分别配制15份H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)溶液，确保每份溶液中细胞囊泡总数为1×107，然后将每份溶液稀释至1ml。再以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀积压液。配制24ml1％TrtionX-100、1％SDS、0.1％SDS、0.01％SDS溶液，每种溶液均为六等份，装入相应的EP管中。
4)将3等份1％TrtionX-100、1％SDS、0.1％SDS、0.01％SDS溶液分别加入12等份H22-MPs(MTX)溶液、Ery-MPs(MTX)的沉淀积压液中，将剩余3等份H22-MPs(MTX)溶液、Ery-MPs(MTX)的沉淀积压液中分别加入1ml PBS。所有溶液混合均匀后，在4℃条件下存储24小时。然后，以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀积压液，分别用1ml PBS重悬。
5)再用流式细胞仪检测相应EP管中H22细胞来源的囊泡、小鼠红细胞来源的囊泡的浓度，并换算出相应EP管中H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)的数量。
6)分别配制15份H22-MPs(MTX)溶液、Ery-MPs(MTX)溶液，确保每份H22-MPs(MTX)总数为1×107、每份Ery-MPs(MTX)总数为3×107(根据实施例2检测结果，确保红细胞来源囊泡的含药量与H22细胞来源囊泡含药量相等)，然后将每份溶液稀释至1ml。再以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀积压液。再按照4)的步骤进行处理，最后分别用100μL1640培养基重悬各沉淀积压液，混合均匀。
7)将1％TrtionX-100组、1％SDS组、0.1％SDS组、0.01％SDS、PBS组，每组取三等份的10μLH22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)培养基重悬液分别与5×104H22肿瘤细胞在48-孔板中共培养(保证最终培养液体积为1mL)，而与实验组相对应的对照组只在相应的孔中添加5×104H22肿瘤细胞(保证最终培养液体积为1mL)，培养36小时，将每孔中液体转移至EP管中，500g离心6分钟，收集细胞沉淀。弃上清，PBS重悬清洗1次。之后，弃上清，加入100μl BindBuffer重悬细胞沉淀。避光条件下，加入1.5μl Annexin V和1μl PI染料，混匀。室温孵育15分钟之后，加入200μl Bind Buffer。然后，用流式细胞仪检测实验组、对照组肿瘤细胞的死亡状况。
3、实验结果
图4-1结果显示，1％SDS、1％TrtionX-100、0.1％SDS、0.05％SDS对细胞囊泡的影响依次减小，相同条件处理下，小鼠红细胞来源囊泡数量明显多于H22细胞来源囊泡。
图4-2结果显示，在0.05％SDS、0.1％SDS、1％TrtionX-100、1％SDS组包药囊泡对肿瘤细胞的杀伤效果依次增强，且Ery-MPs(MTX)对肿瘤细胞的杀伤效果明显强于H22-MPs(MTX)。上述实实验说明，小鼠红细胞来源囊泡明显比H22细胞来源囊泡更稳定。
【实施例5】：比较不同环境条件、不同储存时间对包裹药物的红细胞囊泡稳定性的影响。
1、实验材料和试剂
小鼠红细胞，甲氨蝶呤，1mM NaOH、1mM HCl。
紫外线装置为常规细胞超净工作台所有。
2、实验步骤
1)按照实施例1的方法采集小鼠血液，分离红细胞，计算红细胞浓度。从中取出总数为1.5×109的小鼠红细胞。
2)按照实施例1的方法分别制备、分离提取Ery-MPs(MTX)。将上述所得的Ery-MPs(MTX)以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀积压液。然后，将其均分成两份。
3)将其中一份Ery-MPs(MTX)积压液均分别成12等份。每份用1ml PBS重悬装入EP管中，分别设置37℃保藏、4℃保藏、强光照处理、轻度震荡处理这四种条件组，每组三个重复。至设置37℃保藏、4℃保藏、强光照处理、轻度震荡处理这四种条件组，每组三个重复。
4)将另一份小鼠Ery-MPs(MTX)积压液均分别成15等份，每份用500μL PBS重悬并装入EP管中。将其中12份500μL的Ery-MPs(MTX)重悬液分别配制成pH值为5.5、7、8.5、10的溶液(定容至3ml)，每组三个重复。另3份500μL的Ery-MPs(MTX)重悬液加PBS定容3ml。
5)设置存储时间梯度，分别是存储1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天。用流式细胞仪分别检测每份样品在每个时间梯度下存储的相应Ery-MPs(MTX)浓度，并换算成相应EP管中Ery-MPs(MTX)的总量。
3、实验结果
图5-1的结果显示，4℃储存和轻度震荡对Ery-MPs(MTX)的数量变化的影响较小，且前3天，Ery-MPs(MTX)总量下降缓慢。第4天开始，Ery-MPs(MTX)数量急剧减少。
图5-2的结果显示了五组不同环境条件对Ery-MPs(MTX)数量影响的变化趋势基本相同。其中前3天，PBS、pH7、pH8.5组的Ery-MPs(MTX)总量下降缓慢，3天后3组的Ery-MPs(MTX)数量急剧减少，且3组之间的Ery-MPs(MTX)数量无明显差异。pH10、pH5.5组，前2天Ery-MPs(MTX)总量下降缓慢且与PBS、pH7、pH8.5组的Ery-MPs(MTX)总量无显著差别。第3天起，pH10、pH5.5组的Ery-MPs(MTX)数量急剧减少，且减少趋势比PBS、pH7、pH8.5组明显。其中，pH5.5组的Ery-MPs(MTX)数量比pH10组减少更明显。
【实施例6】：不同环境条件、不同储存时间Ery-MPs(MTX)对肿瘤细胞杀伤效果。
1、实验材料和试剂
小鼠红细胞，甲氨蝶呤，1mM NaOH、1mM HCl。
紫外线装置为常规细胞超净工作台所有。
2、实验步骤
1)按照实施例1的方法采集小鼠血液，分离红细胞，计算红细胞浓度。从中取出总数为1.5×109的小鼠红细胞。
2)按照实施例1方法分别制备、分离提取Ery-MPs(MTX)。将上述所得的Ery-MPs(MTX)以14000g的离心力离心1h，去上清，留沉淀积压液。然后，将其均分成两份。
3)将其中一份Ery-MPs(MTX)积压液均分别成12等份。每份用1ml PBS重悬装入EP管中，分别设置37℃保藏、4℃保藏、强光照处理、轻度震荡处理这四种条件组，每组三个重复。至设置37℃保藏、4℃保藏、强光照处理、轻度震荡处理这四种条件组，每组三个重复。
将另一份Ery-MPs(MTX)积压液均分别成15等份，每份用500μL PBS重悬并装入EP管中。将其中12份500μL的Ery-MPs(MTX)重悬液分别配制成pH值为5.5、7、8.5、10的溶液(定容至3ml)，每组三个重复。另3份500μL的Ery-MPs(MTX)重悬液加PBS定容3ml。
4)按照上述实验步骤，制备4份上述条件处理的Ery-MPs(MTX)。
5)设置存储时间梯度，分别是存储0天、1天、2天、3天。将每组的三份Ery-MPs(MTX)分别与H22肿瘤细胞共培养(2×106的Ery-MPs(MTX)加入到1×105H22肿瘤细胞中，保证最终培养液体积为1mL)，对照组培养相应数量的H22肿瘤细胞(保证最终培养液体积为1mL)，培养36小时，将每孔中液体转移至EP管中，500g离心6分钟，收集细胞沉淀。弃上清，PBS重悬清洗1次。之后，弃上清，加入100μl Bind Buffer重悬细胞沉淀。避光条件下，加入1.5μlAnnexin V和1μl PI染料，混匀。室温孵育15分钟之后，加入200μl Bind Buffer。然后，用流式细胞仪检测实验组、对照组肿瘤细胞的死亡状况。
3、实验结果
图6-1的结果显示，4℃储存更有利于Ery-MPs(MTX)的保存，虽然Ery-MPs(MTX)储存3天杀伤肿瘤细胞的活性有所降低，但无显著减小。
图6-2的结果显示，Ery-MPs(MTX)在中性或弱碱性(pH7-pH8.5)环境中存储更加稳定，且Ery-MPs(MTX)储存3天杀伤肿瘤细胞的活性有所降低，但无显著减小。
上述实验说明，包裹药物的红细胞囊泡可在4℃条件下可存贮3天左右，且在中性或弱碱性(pH7-pH8.5)环境中存储更加稳定。
【实施例7】：比较Ery-MPs(MTX)、H22-MPs(MTX)抑制肿瘤生长，延长肝癌腹水模型小鼠的存活时间
1、实验材料和试剂
使用的H22小鼠肝癌细胞，小鼠红细胞，化疗药甲氨蝶呤，BALB/c小鼠40只。
2、实验步骤
1)培养H22细胞使细胞总量分别达到2×108个，培养方法同实施例1。采集小鼠的血液，按照实施例1的红细胞分离方法分离出红细胞，计算细胞量，使其细胞量总数达到3×108个。
2)从上述细胞中分别取2×107H22肝癌细胞和3×107小鼠红细胞，按照实施例1的包药细胞囊泡的制备分离提取方法，制备分离提取得到相应的H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，分别用100μL生理盐水重悬。然后，用实施例1的细胞囊泡计数方法计算H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)的数量。分别取2×106H22-MPs(MTX)、6×106Ery-MPs(MTX)(根据实施例2检测结果，确保Ery-MPs(MTX)的含药量与H22-MPs(MTX)含药量相等)，用生理盐水重悬至200μL，其量定为1只小鼠的每天的药物用量。
3)第1天，取5×104H22细胞经腹腔接种到BALB/c小鼠，共注射BALB/c小鼠40只，即得到患H22细胞肝癌腹水模型的BALB/c小鼠，随机分为等数量的四组，即：实验1组、实验2组、实验3组、对照组。，实验1组的BALB/c小鼠腹腔注射H22-MPs(MTX)；实验2组的BALB/c小鼠腹腔注射Ery-MPs(MTX)；实验3组的BALB/c小鼠腹腔注射甲氨蝶呤的剂量为1μg/g；对照组的BALB/c小鼠腹腔注射200μL 0.9％(g/ml)的生理盐水。
4)第4天开始，按照相同的注射操作，实验组每天分别注射H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)、化疗药(甲氨蝶呤)一次，连续7天，对照组每天注射200μL 0.9％(g/ml)的生理盐水一次，连续7天。第11天起，所有BALB/c小鼠均正常饲养，并观察各组BALB/c小鼠的生存状况。
3、实验结果
图7结果显示，对照组从第13天开始死亡，第16天全部死亡；实验1组腹腔注射H22-MPs(MTX)的BALB/c小鼠从第25天开始死亡至第34天共死亡8只，存活率为20％；实验2组腹腔注射Ery-MPs(MTX)的BALB/c小鼠从第27天开始死亡至第33天共死亡6只，存活率为40％；实验3组腹腔注射甲氨蝶呤的BALB/c小鼠从第24天开始死亡至第31天共死亡9只，剩余1只存活至50天时死亡。
上述实验结果表明，包裹甲氨蝶呤的红细胞囊泡治疗效果好于包裹甲氨蝶呤的肿瘤细胞囊泡，更优于单纯甲氨蝶呤治疗组。
【实施例8】：比较Ery-MPs(MTX)、包裹甲氨蝶呤的Lewis肺癌细胞囊泡(LLC-MPs(MTX))抑制小鼠肺癌实体瘤生长，延长肺癌模型小鼠的存活时间
1、实验材料和试剂
小鼠Lewis肺癌细胞，正常小鼠红细胞，甲氨蝶呤，32只C57BL/6小鼠。
2、实验步骤
1)培养Lewis细胞使细胞总量分别达到2×108个，培养方法同实施例1。采集小鼠的血液，按照实施例1的红细胞分离方法分离出红细胞，计算细胞量，使其细胞量总数达到3×108个。
2)从上述细胞中取2×107Lewis肺癌细胞和3×107小鼠红细胞，按照实施例1的细胞囊泡制备分离提取方法，制备分离提取得到相应的LLC-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，分别用100μL生理盐水重悬。然后，用实施例1的细胞囊泡计数方法计算LLC-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)的数量。
分别取2×106LLC-MPs(MTX)、6×106Ery-MPs(MTX)(根据实施例2检测结果，确保Ery-MPs(MTX)的含药量与LLC-MPs(MTX)含药量相等)，用生理盐水重悬至200μL，其量定为1只小鼠的每天的药物用量。
3)第1天，取1×106Lewis细胞经尾静脉接种到C57BL/6小鼠，共注射C57BL/6小鼠32只，即得到Lewis细胞肺癌模型的C57BL/6小鼠，随机分为等数量的四组，即：实验1组、实验2组、实验3组、对照组。其中，实验1组的C57BL/6小鼠尾静脉注射LLC-MPs(MTX)；实验2组的C57BL/6小鼠尾静脉注射Ery-MPs(MTX)；实验3组的C57BL/6小鼠尾静脉注射甲氨蝶呤的剂量为0.5μg/g；对照组的C57BL/6小鼠尾静脉注射200μL 0.9％(g/ml)的生理盐水。
4)第5天开始，按照相同的注射操作，实验组每天分别注射LLC-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)、化疗药(甲氨蝶呤)一次，连续10天，对照组每天注射200μL 0.9％(g/ml)的生理盐水一次，连续10天。第15天起，所有C57BL/6小鼠均正常饲养，并观察各组C57BL/6小鼠的生存状况。
3、实验结果
图8结果显示，Ery-MPs(MTX)对小鼠肺癌的治疗效果明显好于LLC-MPs(MTX)，甲氨蝶呤对小鼠肺癌的治疗效果相比Ery-MPs(MTX)、LLC-MPs(MTX)相差甚远。
【实施例9】：包裹化疗药的红细胞囊泡对机体的毒副作用实验
1、实验材料和试剂
使用的H22小鼠肝癌细胞以及小鼠红细胞同实施例1，化疗药甲氨蝶呤，32只BALB/c小鼠。
2、实验步骤
1)培养H22细胞使细胞总量分别达到2×108个，培养方法同实施例1。采集小鼠的血液，按照实施例1的红细胞分离方法分离出红细胞，计算细胞量，使其细胞量总数达到3×108个。
2)从上述细胞中取2×107H22肝癌细胞和3×107小鼠红细胞，按照实施例1的细胞囊泡制备分离提取方法，制备分离提取得到相应的H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)，分别用100μL生理盐水重悬。然后，用实施例1的细胞囊泡计数方法计算H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)的数量。
分别取2×106H22-MPs(MTX)、6×106Ery-MPs(MTX)(根据实施例2检测结果，确保Ery-MPs(MTX)的含药量与H22-MPs(MTX)含药量相等)，用生理盐水重悬至200μL，其量定为1只小鼠的每天的药物用量。
3)将所制备的H22-MPs(MTX)分别经尾静脉注射8只BALB/c小鼠，作为实验组1，将所制备的Ery-MPs(MTX)分别经尾静脉注射8只BALB/c小鼠，作为实验组2；对8只小鼠BALB/c小鼠尾静脉注射甲氨蝶呤，按照1μg/g的化疗药(甲氨蝶呤)剂量对小鼠进行注射，作为实验组3；对8只小鼠BALB/c小鼠尾静脉注射0.9％(g/ml)的生理盐水作为对照组。相同的注射操作，实验组每天分别注射H22-MPs(MTX)、Ery-MPs(MTX)、甲氨蝶呤一次，连续7天，对照组每天注射200μL 0.9％(g/ml)的生理盐水一次，连续7天。
4)第8天，分别对实验组1、实验组2、实验组3及对照组小鼠取静脉血，检测血清中谷丙转氨酶、肌酐含量及血液中APTT、PT含量，并称量小鼠体重。
3、实验结果
图9-1和图9-2的结果显示，注射生理盐水的阴性对照、Ery-MPs(MTX)、H22-MPs(MTX)、甲氨蝶呤给药组的BABL/c小鼠谷丙转氨酶均值分别为13.63U/L、14.50U/L、14.32U/L、21.57U/L。这四组BABL/c小鼠的血清肌酐含量均值分别为17.29μmol/L、17.78μmol/L、17.34μmol/L、26.13μmol/L；这四组BABL/c小鼠的活化部分凝血酶原时间APPT均值分别14.13s、14.4s、14.33s、16.5s；这四组BABL/c小鼠的凝血酶原时间PT均值分别9.67s、10.13s、10.20s、13.13s。
由上述数据可知，与注射生理盐水的阴性对照相比，Ery-MPs(MTX)、H22-MPs(MTX)给药组的BABL/c小鼠谷丙转氨酶和血清肌酐含量以及凝血中APTT和PT值无明显差异，且均在正常范围值之内。相对于上述3组而言，甲氨蝶呤给药组的BABL/c小鼠谷丙转氨酶和血清肌酐含量急以及凝血中APTT和PT值均显著偏高。
综上所述，相比化疗药，包裹甲氨蝶呤的红细胞囊泡与包裹甲氨蝶呤的肿瘤细胞囊泡一样对机体的毒副作用大大减轻。
其他实验结果总结：
利用实施例1得到的正常小鼠红细胞凋亡产生的红细胞囊泡分别包裹其他化疗药,例如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂、顺铂得到了和上述实施例一致的结果。同时，本专利的发明人利用实施例3得到的普通人的红细胞凋亡产生红细胞囊泡分别包裹其他化疗药,例如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂、顺铂得到了和上述实施例一致的结果。
从患肝癌腹水小鼠的血液分离得到红细胞，按照实施例1制备方法得到的红细胞囊泡分别包裹化疗药如甲氨喋呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂、顺铂得到了和上述实施例一致的结果。同时，利用实施例3得到的相应肿瘤患者的红细胞凋亡产生红细胞囊泡分别包裹化疗药如甲氨喋呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂、顺铂得到了和上述实施例一致的结果。
Claims (10)
1.一种肿瘤治疗药物，包含红细胞囊泡和包裹于所述红细胞囊泡中的治疗药，其中所述红细胞囊泡为凋亡的红细胞释放的囊泡，所述治疗药为作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。
2.根据权利要求1所述的肿瘤治疗药物，其中所述红细胞囊泡是通过将来源于人的红细胞与选自化疗药剂、放射线和/或紫外线的任一种接触而致所述红细胞凋亡并释放出囊泡获得所述红细胞囊泡。
3.根据权利要求1所述的肿瘤治疗药物，其中由所述红细胞囊泡包裹肿瘤治疗药所形成的肿瘤治疗药物的粒径为50～500nm。
4.根据权利要求1所述的肿瘤治疗药物，其中所述的肿瘤治疗药为化疗药。
5.根据权利要求4所述的肿瘤治疗药物，其中所述化疗药为选自治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌、白血病、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤肿瘤的化疗药中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的肿瘤治疗药物，其中所述的化疗药选自甲氨蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂和顺铂。
7.根据权利要求/6所述的肿瘤治疗药物，其中所述的化疗药为甲氨蝶呤。
8.权利要求1所述的肿瘤治疗药物，其中所述药物通过下述方法制备：
向红细胞施用作为有效成分的化疗药使之凋亡，收集凋亡红细胞所释放的包药囊泡，获得所述肿瘤治疗药物；或者
使用紫外线照射红细胞，促进红细胞凋亡，收集凋亡红细胞所释放的红细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的肿瘤治疗药进行孵育，使所述肿瘤治疗药被红细胞囊泡包裹，获得所述肿瘤治疗药物；或者
使用紫外线照射红细胞后立即加入作为有效成分的化疗药物，促使红细胞凋亡，收集凋亡红细胞所释放的包药囊泡，获得所述肿瘤治疗药物。
9.一种药物组合物，含有权利要求1所述的肿瘤治疗药物和药学上或生理学上可接受的辅料和/或添加剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为液体制剂，含有PBS缓冲液或生理盐水。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180316 |