CN110898035A - 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，该制剂包括通过Fenton反应诱导细胞凋亡制备细胞囊泡，并将化疗药物包裹在所述细胞囊泡中形成的载药囊泡。本发明制剂的载药囊泡具有小于200nm的平均粒径且均一性好；适用于包裹各种肿瘤化疗药物形成制剂，工艺操作简单可控。

Description

一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，尤其涉及一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法。

背景技术

细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，细胞膜为磷脂双分子层，具有通透性，其球状结构则通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到刺激(如药物、紫外线、高温)发生凋亡的时候，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝断裂或失去附着，向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中，其大小基本界于100-1000nm。

中国专利CN102302784A公开了一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，该制剂是以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡为载体，用其包裹肿瘤化疗药制备而成。该制剂直接到达肿瘤部位，提高了化疗药的药效，同时克服了因外源载体给药而对机体产生的毒副作用。CN102302784A还公开了所述肿瘤化疗药物制剂的制备方法：其中一种方法为对肿瘤细胞施用作为有效成分的化疗药物使其凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药物后形成的所述药物制剂；或另一种方法使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药物进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，然后收集微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药物后形成的所述药物制剂。

对于方法一，即使用化疗药物诱导细胞凋亡，存在的不足之处为：

不同的化疗药物诱导细胞凋亡的机理不同，例如蒽环类、铂类化疗药物直接破坏DNA双螺旋架构，使其无法复制；而抗代谢类化疗药物的作用机理为：与合成正常代谢物所必需的酶相结合，从而干扰核酸的合成。因此，并不是所有的化疗药物都能够诱导细胞凋亡或者释放囊泡，例如紫衫类、长春碱类化疗药物等，从而限制了该方法的运用。

对于方法二，即紫外线诱导细胞凋亡,具有以下的局限：

1、紫外线的穿透性有限，离光源近的细胞凋亡程度过高，而离光源远的细胞凋亡程度又不够，导致得到的囊泡产率低、均一性差；

2、紫外线照射装置成本高；

3、紫外线照射无法同时处理大批量的细胞；

4、该方法首先利用紫外线诱导细胞凋亡，提取空囊泡即不负载药物的囊泡后，再将空囊泡与化疗药物孵育，之后14000g离心1h得到载药囊泡。操作较为繁琐，囊泡损失量大。

细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，包含了超氧阴离子(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(OH·)、臭氧(O₃)和单线态氧(¹O₂)等，由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。

前期实验表明，过氧化氢与二价铁离子的混合溶液，其氧化性要强于过氧化氢，即Fenton反应。该反应广泛用于污水处理中，用于降解各类有机污染物，其反应方程式为：

Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH^-+OH·

H₂O₂+Fe³⁺→Fe²⁺+O₂+2H⁺

Fe²⁺+O₂→Fe³⁺+O₂·

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的肿瘤化疗药物制剂，以Fenton反应诱导的细胞凋亡产生的细胞囊泡作为肿瘤化疗药物制剂的载体，包裹化疗药物形成制剂。经Fenton反应产生的细胞囊泡粒径均一，且粒径不大于200nm。

该药物制剂组成中的具体化疗药可以是临床使用的治疗各种肿瘤的化疗药，例如：卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或胶质瘤等的化疗药，可以是一种化疗药，也可以是多种化疗药的组合，用于包裹化疗药的细胞囊泡优选来自与所要治疗的肿瘤细胞同种类型的肿瘤细胞。

本发明的又一目的是提供一种肿瘤化疗药物制剂的制备方法，通过Fenton反应诱导细胞凋亡产生细胞囊泡，再将该囊泡与化疗药物孵育，获得载药囊泡，从而实现将作为治疗有效成分的化疗药包裹到源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡中形成制剂。

本发明详细研究了Fenton反应诱导的细胞凋亡产生的细胞囊泡的反应条件，发现当H₂O₂水溶液的浓度为400～800μmol/L,FeSO₄水溶液的浓度为25～100μmol/L，作用时间为40～80min时，诱导细胞凋亡及产生细胞囊泡的效率较高。其中，优选的诱导反应条件为H₂O₂水溶液的浓度为400μmol/L,FeSO₄水溶液的浓度为50μmol/L，作用时间为60min。

本发明提供的肿瘤化疗药物制剂，是基于以Fenton反应诱导的源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药物制成。Fenton反应通过羟基自由基诱导肿瘤细胞凋亡，该凋亡程度可根据双氧水的浓度进行调整，操作过程简单可控。同时双氧水和硫酸亚铁均为药典收录的药物，且双氧水分解生成氧气和水，不会在制备过程中引入其他细胞毒性物质。经该方法处理的细胞可释放囊泡，与对比文件相比囊泡的产量和粒径均一性均有明显提升，且囊泡的功能没有明显变化。与化疗药物诱导制备载药囊泡的方法相比，该方法适用于市面上各类化疗药物，不再受药物本身性质的约束。本发明的载药囊泡产率稳定、粒径均一；适宜于工业批量生产；并且可包载的化疗药物范围很广，可与多种化疗药物制成稳定的药物制剂；由于载药囊泡来源于肿瘤细胞，其更易与治疗目标肿瘤细胞的细胞膜融合，有利于降低机体的抗药性。

附图说明

图1Fenton反应诱导细胞凋亡的凋亡率。

图2Fenton反应中不同浓度FeSO4水溶液诱导细胞凋亡的凋亡率。

图3Fenton反应中不同浓度H₂O₂水溶液诱导细胞凋亡的凋亡率。

图4Fenton反应诱导细胞凋亡制备细胞囊泡的平均粒径图。

图5紫外线照射诱导细胞凋亡制备细胞囊泡的平均粒径图。

图6Fenton反应和紫外线照射诱导细胞凋亡制备细胞囊泡多次重复试验的平均粒径。

图7Fenton反应制备得到的囊泡TEM图。

图8不同Fenton反应时间制备的细胞囊泡数目。

图9Fenton反应诱导细胞凋亡方法制备载药囊泡的数量。

图10Fenton反应诱导细胞凋亡方法制备载药囊泡的单位囊含药量。

图11Fenton反应、化疗药物诱导和紫外线照射方法制备的载药囊泡对不同肿瘤细胞的体外摄取对比。

图12Fenton反应、化疗药物诱导和紫外线照射方法制备的载药囊泡对不同肿瘤细胞的杀伤率。

具体实施方式

以下实施例仅具体举例说明本发明的实施方式，不对本发明的范围做任何的限定。其中所采用的细胞、试剂与原料来源如下：

1、实施例中所使用的细胞系，即K562人髓性白血病细胞系，A549人肺腺癌细胞系、OVCAR-3人卵巢癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系，MCF-7人乳腺癌细胞系以及HCT-8人结肠癌细胞系，均购自于中国典型培养物保藏中心。

2、实施例中所使用的化疗药物，即甲氨蝶呤(MTX)，盐酸阿霉素(DOX)，顺铂(CDDP)，10-羟基喜树碱(10-HCPT)，均购自于大连美仑生物技术有限公司。

3、实施例中所使用的双氧水(34.5-36.5％)、PKH26试剂盒购自于Sigma；七水合硫酸亚铁购自于国药集团化学试剂有限公司；1640培养基购自于Biological Industries；胎牛血清(四季青)购自于浙江天杭生物科技股份有限公司；凋亡检测试剂Annexin V-FITC和PI购自于Biolegend Inc.；其余试剂均为市售产品。

实施例1：Fenton反应可诱导细胞凋亡，且效果优于双氧水

1.1人髓性白血病细胞K562培养在1640培养基中，培养基含有体积分数10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素。细胞在37℃、体积分数5％CO₂的条件下进行培养。定期观察、传代。当细胞生长到对数期时进行消化，种24孔板孵育过夜后进行后续实验

1.2培养的细胞处于对数生长期时，将一定浓度H₂O₂水溶液和FeSO₄水溶液加进孔板，细胞处理的参考浓度如下表，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下孵育1h。

1.3孵育1h后，换新鲜培养基，过夜后进行凋亡检测，方法为取处理后的K562细胞重悬于Annexin V binding buffer中，加入凋亡检测试剂Annexin V-FITC和PI，孵育30min后使用BD FACSCanto II流式细胞仪进行细胞凋亡检测，Annexin V阳性分群为凋亡细胞。

结果见图1所示，细胞凋亡率随H₂O₂水溶液的浓度升高，且加入FeSO₄水溶液后，H₂O₂水溶液的使用浓度可大幅降低。

实施例2：选择合适的FeSO₄浓度

2.1K562细胞培养在1640培养基中，培养基含有体积分数10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素。细胞在37℃、体积分数5％CO₂的条件下进行培养。定期观察、传代。当细胞生长到对数期时进行消化，种24孔板孵育过夜后进行后续实验。

2.2培养的细胞处于对数生长期时，选择400和600μmol/L两个浓度的H₂O₂水溶液以及梯度浓度的FeSO₄水溶液(0/25/50/100/150/200μmol/L)，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下孵育1h。

2.3孵育1h后，换新鲜培养基，过夜后进行凋亡检测，结果见图2所示。

实施例3：Fenton反应诱导凋亡的细胞可释放囊泡，且产率与H₂O₂浓度相关

3.1经过不同浓度H₂O₂水溶液(0/200/400/600/800/1000μmol/L)和50μmol/LFeSO₄水溶液处理1h的K562细胞，换新鲜1640培养基，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下进行培养16-24h，经过梯度离心后，能够得到不负载药物的细胞囊泡。

3.2使用Malvern NS300颗粒跟踪分析仪进行囊泡数量的表征，结果见图3，同等条件下，当H₂O₂的浓度为400μmol/L时，产生的囊泡数量最多。

3.3囊泡样品使用磷钨酸进行负染，使用Hitachi HT7800 120kV透射电镜进行囊泡形貌表征，结果见图4所示。

3.4Fenton反应制备得到的囊泡粒径分布图

采用中国专利CN102302784B的实施例2中所示的方法，用紫外线照射K562细胞诱导肿瘤细胞凋亡产生囊泡，和Fenton反应的方法诱导肿瘤细胞凋亡产生的囊泡进行对比，并使用Malvern NS300颗粒跟踪分析仪分别测试两种细胞囊泡的粒径分布。结果见图5和图6所示，图5是Fenton反应诱导得到的囊泡，图6是紫外照射得到的囊泡，可以发现Fenton反应诱导细胞凋亡产生的囊泡分布较为均一，而紫外照射得到的囊泡粒径分布较宽，出现了多个肩峰，均一性不如前者。

Fenton反应诱导和紫外照射产生的细胞囊泡进行多次重复实验测定平均粒径，结果如图7所示。根据多次重复试验验证，Fenton反应诱导细胞凋亡产生的细胞囊泡的平均粒径小于200nm。

实施例4：选择合适的作用时间

4.1根据实施例2、3的结果，将H₂O₂水溶液和FeSO₄水溶液的浓度分别定为400μmol/L、50μmol/L，使用上述浓度的H₂O₂和FeSO₄处理K562细胞，处理不同时间后换新鲜1640培养基，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下进行培养16-24h，经过梯度离心后，使用马尔文NS300颗粒跟踪分析仪进行囊泡数量的表征，结果如图8所示，当Fenton反应的作用时间为60min时，产生的细胞囊泡数量最多。

实施例5：Fenton法诱导凋亡的细胞可释放载药囊泡

5.1经过400μmol/L H₂O₂水溶液和50μmol/L FeSO₄水溶液处理的K562细胞，1h后离心，换新鲜1640培养基，并加入不同的化疗药物，甲氨蝶呤(MTX)2mg/mL，盐酸阿霉素(DOX)200μg/mL，顺铂(CDDP)200μg/mL，10-羟基喜树碱(10-HCPT)500μg/mL，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下进行培养16-24h，经过梯度离心后，能够得到载药囊泡；

同时采用中国专利CN102302784B的实施例1中所示的方法，使用化疗药物直接诱导凋亡的方法制备载药囊泡，使用的化疗药物及其浓度与上述方法相同，即使用甲氨蝶呤(MTX)2mg/mL，盐酸阿霉素(DOX)200μg/mL，顺铂(CDDP)200μg/mL，10-羟基喜树碱(10-HCPT)500μg/mL分别制备载药囊泡；

以及采用中国专利CN102302784B的实施例2所示的方法紫外线照射诱导凋亡，提取囊泡后再加化疗药甲氨蝶呤(MTX)2mg/mL，盐酸阿霉素(DOX)200μg/mL，顺铂(CDDP)200μg/mL，10-羟基喜树碱(10-HCPT)500μg/mL分别制备载药囊泡。

5.2步骤5.1中得到的载药囊泡，使用马尔文NS300颗粒跟踪分析仪进行囊泡数量表征，结果如图9所示，在同等条件下，由Fenton反应产生的载药囊泡的数目明显高于化疗药物诱导凋亡及紫外线照射方法。

5.3步骤5.1中得到的载药囊泡，使用Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪进行单位囊泡(10^10)含药量表征。其中，甲氨蝶呤、盐酸阿霉素以及顺铂的液相检测方法参见中华人民共和国药典2015版。10-羟基喜树碱的HPLC检测条件为，流动相甲醇：水＝50:50(v/v)，色谱柱：Thermo Acclaim^TM 120，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长：266nm

结果如图10所示。

实施例6：氧化诱导凋亡得到的载药囊泡抗肿瘤功能验证

6.1根据实施例5.1的方法通过Fenton法，与化疗药(甲氨蝶呤)直接诱导凋亡以及紫外诱导凋亡的分别方法制备甲氨蝶呤(MTX)载药囊泡，使用PKH26进行染色。将囊泡重悬于Diluent C液中，加入2μL PKH26乙醇溶液，37℃孵育30min后加入等体积的胎牛血清终止染色，14000g离心30min除去游离的染料，使用生理盐水重悬PKH26标记的囊泡。

6.2选取A549人肺腺癌细胞系、OVCAR-3人卵巢癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系以及HCT-8人结肠癌细胞系，种24孔板，每孔1*10^5细胞。在37℃、体积分数5％CO₂的条件下孵育过夜后，每孔加入等量的上述三种PKH26标记的囊泡，孵育3h后将孔内的细胞消化下来转至流式管中，使用BD FACSCanto II流式细胞仪进行囊泡摄取检测。PKH26使用PE通道检测，结果表现为PE阳性细胞百分比。结果如图11所示。

6.3采用实施例5.1的方法分别通过Fenton法，与化疗药物直接诱导凋亡以及紫外诱导凋亡三种方法制备载MTX囊泡。使用实施例6.2中所示的五种细胞系种48孔板，每孔1.5*10^4细胞。在37℃、体积分数5％CO₂的条件下孵育过夜后，每孔加入等量的三种MTX载药囊泡，在37℃、体积分数5％CO₂的条件下孵育48h后进行凋亡检测，方法参考实施例1.3。进行体外肿瘤细胞杀伤对比，结果如图12所示。

Claims (7)

1.一种肿瘤化疗药物制剂，包括源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡和被包裹在所述细胞囊泡内作为有效成分的化疗药，其特征在于，所述细胞囊泡通过Fenton反应制备，具有不大于200nm的平均粒径。

2.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂，其中，该药物制剂中所包含的化疗药为含有治疗提供所述细胞囊泡的肿瘤的有效成分的化疗药，包括治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病或胶质瘤的化疗药中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂，其中，由所述细胞囊泡包裹所述化疗药所形成的肿瘤化疗药物制剂的粒度为不大于200nm。

4.权利要求1-3任一项所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，包括：将H₂O₂水溶液和FeSO₄水溶液加入肿瘤细胞，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，然后收集包裹有化疗药的微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药后形成的所述药物制剂。

5.根据权利要求4所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、白血病和/或胶质瘤的细胞。

6.根据权利要求4所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中诱导细胞凋亡产生囊泡的H₂O₂水溶液的浓度为400～800μmol/L,FeSO₄水溶液的浓度为25～100μmol/L，作用时间为40～80min。

7.根据权利要求4所述的肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中，诱导细胞凋亡产生囊泡的H₂O₂水溶液的浓度为400μmol/L,FeSO₄水溶液的浓度为50μmol/L，作用时间为60min。

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