CN112426437B - Dna功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Dna功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种DNA功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用，DNA功能化氧化铜纳米酶包括di‑DNA和CuO纳米酶，di‑DNA的一端为TC碱基组成的DNA序列，另一端为核苷组成的DNA序列，di‑DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。本发明的DNA功能化氧化铜纳米酶基于DNA在氧化铜纳米酶表面的吸附机理设计而成，可极化吸附在纳米酶表面，并赋予肿瘤靶向功能。其制备方法为：将di‑DNA分散至缓冲液中得到分散液；将分散液与CuO纳米酶混合后进行吸附。本发明制备方法操作简单、成本低且反应条件温和，可用于纳米酶的肿瘤靶向修饰，在疾病治疗等领域具有广泛的应用前景。

Description

DNA功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及材料、纳米载体和纳米生物技术领域，特别涉及一种DNA功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)是一种非正常的微环境，具有低氧、微酸和高水平H2O2的特点。利用TME与正常组织之间的显著差异性，可定制各种抗肿瘤治疗策略。例如，厌氧沙门氏菌可在低氧区的TME里繁殖，利用这一特点可构建具有沙门氏菌的肿瘤靶向递药系统；酸敏型聚合物组装成的纳米酶，可响应酸性的TME，实现肿瘤靶向；或利用TME高水平的过氧化氢，产生单线态氧，增强联合抗肿瘤效率。
纳米酶是一种具有高效催化活性的人工模拟酶。与天然酶相比，纳米酶具有成本低，易于修饰，稳定性好等优点，而在生物医学领域具有广泛的应用价值。近年来，在各类纳米酶中，能够催化底物产生自由基用于化学动力学治疗的过氧化物纳米酶在肿瘤治疗上受到广泛关注。为了实现肿瘤的高效治疗，且低毒副作用，赋予纳米酶足够的生物学稳定性和肿瘤靶向性是非常必要的。常见的方法是进行纳米酶表界面修饰，如修饰生物大分子增加稳定性；修饰靶向配体赋予靶向性。相比于化学修饰法，物理吸附法具有操作简单、反应条件温和等优点。但是，物理吸附通常会遭到体循环中生物大分子的解吸附。因此，研究合适的靶向配体简单的修饰在纳米酶上的方法，且不影响酶的催化活性，对其生物学应用非常关键。
DNA是一种高使用率的功能性聚合物，可作为纳米酶的连接部件。DNA可赋予纳米材料多种功能，如靶向、诊断和治疗等。避开繁琐的化学修饰，用物理吸附法修饰DNA到纳米材料上时，需考虑DNA与纳米材料的表界面相互作用机制。不同的纳米材料具有不同的DNA吸附机制，导致DNA吸附的稳定性也存在差异。基于DNA吸附机制，设计DNA修饰的纳米酶可调节酶催化活性和吸附稳定性，实现生物传感、细胞成像和药物递送等方面的应用。但基于DNA吸附规律，设计的DNA功能化纳米酶在肿瘤靶向治疗上还未见报道。
因此，探索DNA与纳米材料的吸附机制，构建基于DNA吸附的功能化纳米材料，在疾病治疗领域具有重要的应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种极化控制DNA功能化氧化铜(Cupric oxide，CuO)纳米酶及其制备方法与应用，所述DNA功能CuO纳米酶可实现CuO纳米酶的靶向修饰，赋予肿瘤靶向能力，可应用于肿瘤的靶向治疗或为其它纳米材料的修饰提供参考方案。
为了达到上述目的，本发明首先探索了CuO纳米酶吸附DNA的机制。基于DNA吸附机制设计两嵌段DNA(di-DNA)，一端可稳定吸附在纳米酶上，另一端作为功能修饰基团。将di-DNA吸附在纳米酶表面，用于肿瘤靶向。
作为优选，本发明提供了一种DNA功能化氧化铜纳米酶，包括di-DNA和CuO纳米酶，所述di-DNA的一端为TC碱基组成的DNA序列，另一端为核苷组成的DNA序列，所述di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
上述的DNA功能化氧化铜纳米酶，进一步的，所述TC碱基组成的DNA序列如SEQ IDNO.1所示；所述核苷组成的DNA序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示。
上述的DNA功能化氧化铜纳米酶，进一步的，在所述di-DNA上修饰荧光探针。
上述的DNA功能化氧化铜纳米酶，进一步的，所述di-DNA浓度为10nM～10μM，CuO浓度为20～500μg/mL。进一步优选的，所述di-DNA浓度为1μM～10μM，CuO浓度为50～500μg/mL。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种DNA功能化氧化铜纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将di-DNA分散至缓冲液中得到分散液；
S2、将所述分散液与CuO纳米酶混合后进行孵育得到DNA功能化氧化铜纳米酶。
上述的制备方法，进一步的，所述制备方法还包括：
S3、加入FBS，超声混匀，继续孵育1h；
S4、离心，收集沉淀，分散于HEPES缓冲液中。
上述的制备方法，进一步的，所述S1中所述缓冲液为含150mM的NaCl的HEPES缓冲液。
上述的制备方法，进一步的，所述S2中所述孵育的温度为0～30℃。进一步的，所述孵育的孵育的温度为4℃。
上述的制备方法，进一步的，所述S2中所述孵育的时间大于等于2h。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了所述的DNA功能化氧化铜纳米酶在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述DNA功能化氧化铜纳米酶的剂量为2.5mg/kg～5mg/kg。
本发明上述方案有如下有益效果：
1、本发明提供了一种DNA功能CuO纳米酶(di-DNA/CuO)，用荧光标记DNA的吸附与解吸附来探索了CuO纳米酶对DNA的吸附机制。发现CuO纳米酶对TC碱基组成的DNA片段具有高吸附稳定性，对polyADNA具有较低的吸附稳定性。一端为(TC)12DNA，另一端为polyA DNA的di-DNA可以吸附在CuO纳米酶表面对其进行功能化。所吸附DNA的CuO纳米酶仍然具有高过氧化物酶活性，可以增加细胞内的ROS水平，引起肿瘤细胞凋亡，且对肿瘤细胞具有高毒性。
2、本发明提供了一种DNA功能CuO纳米酶的制备方法，操作简单、成本低且反应条件温和。
3、本发明提供的一种DNA功能CuO纳米酶在肿瘤靶向中的应用，所构建的di-DNA/CuO可有效富集于肿瘤部位，实现肿瘤靶向。
附图说明
图1为本发明实验1中CuO纳米酶的TEM表征、过氧化物酶活性表征和羟基自由基测定结果。
图2为本发明实验2中CuO纳米酶吸附DNA的示意图，不同浓度的CuO纳米酶吸附FAM-A15的动力学曲线和CuO纳米酶吸附四种序列DNA的动力学曲线。
图3为本发明实验3中DNA从CuO纳米酶表面解吸附的示意图，四种不同序列的DNA、核苷、磷酸盐和血清对CuO纳米酶上DNA的解吸附。
图4为本发明实验4中di-DNA功能化CuO纳米酶的示意图，CuO纳米酶对DNA吸附稳定性的比较和CuO纳米酶吸附DNA后的过氧化物酶活性评价。
图5为本发明实验5中胞内ROS水平评价，纳米酶对MDA-MB-231细胞和HEK293细胞的毒性评价。
图6为本发明实施例7中纳米酶在荷瘤裸鼠的体内分布和体内抗肿瘤结果，包括肿瘤生长抑制曲线、治疗后的瘤重和治疗期间的体重变化情况。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位等。
本发明针对现有的问题，提供了一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶及其制备方法与应用，该极化控制DNA功能化CuO纳米酶是基于CuO纳米酶对DNA的吸附机制，构建了一端为高吸附稳定性的DNA片段和另一端为较低吸附稳定性的功能DNA片段所组成的di-DNA。该di-DNA吸附在CuO纳米酶上仍然具有很强的过氧化物酶活性，并能增加肿瘤细胞内的ROS水平，引起肿瘤细胞凋亡，并在体内富集于肿瘤部位，实现肿瘤靶向。该修饰方法可用于纳米材料的表面改性或靶向纳米递药系统的构建。
以下实施例中，所采用的仪器及生产厂家的详细信息参见表1：
表1：主要仪器名称及生产厂家
Figure BDA0002825824860000041
Figure BDA0002825824860000051
以下实施例中，所采用的主要试剂名称及生产厂家参见表2：
表2：主要试剂名称及生产厂家
Figure BDA0002825824860000052
Figure BDA0002825824860000061
实施例1：
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶，包括di-DNA和CuO纳米酶，di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(SEQ ID NO.1：TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-A15(SEQID NO.2：AAAAAAAAAAAAAAA)，di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
一种本发明的极化控制DNA功能化CuO纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1μM di-DNA分散在10mM的HEPES缓冲液中(pH7.6，150mM NaCl)得到分散液；
(2)将100μg/mLCuO纳米酶和分散液在4℃下吸附2h得到极化控制DNA功能化CuO纳米酶；
(3)加入1％经高温灭活FBS，超声混匀，继续孵育1h。
(4)然后在4℃，16000rpm的条件下离心30min，去掉上清，洗涤沉淀，分散于HEPES缓冲液中(10mM，pH 7.6，150mM NaCl)，备用。
实施例2：
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶，包括di-DNA和CuO纳米酶，di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(SEQ ID NO.1：TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-T15(SEQID NO.3：TTTTTTTTTTTTTTT)，di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
其制备方法与实施例1一致。
实施例3：
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶，包括di-DNA和CuO纳米酶，di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(SEQ ID NO.1：TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-C15(SEQID NO.4：CCCCCCCCCCCCCCC)，di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
其制备方法与实施例1一致。
实施例4：
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶，包括di-DNA和CuO纳米酶，di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(SEQ ID NO.1：TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-G15(SEQID NO.5：GGGGGGGGGGGGGGG)，di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
其制备方法与实施例1一致。
实验一、CuO纳米酶的表征
TEM：将一滴CuO纳米酶乙醇分散液(含CuO纳米酶100μg/mL)滴到一个230钼碳膜支持的铜网上，50℃的恒温烘箱中烘干，即可。用Tecnai G2 F20场发射透射电镜测定CuO纳米酶的粒径与形貌。
图1A的TEM结果显示CuO纳米酶为不规则形态，粒径约50nm。
过氧化物酶活性评价：将500μM的TMB和25μg/mL的CuO纳米酶分散到10mM的醋酸钠缓冲液(pH＝4)中，然后向体系中加入10mM的过氧化氢溶液。在室温条件下孵育30min，用紫外分光光度计扫描波长范围为350nm-750nm处的紫外吸收，同时对反应液进行拍照，以无CuO纳米酶和同时无过氧化氢与CuO纳米酶为对照。
图1B显示：在CuO纳米酶、过氧化氢和TMB同时存在时，体系溶液变成蓝色，表明TMB被CuO催化氧化了。
TPA实验：3mM的TPA与0.5μg/mL的CuO纳米酶混合于磷酸缓冲液中(10mM，pH 7.4，200μM H2O2)，在45℃条件下孵育30min。测定在315nm波长的光激发下，体系的荧光光谱。
图1C TPA结果显示CuO在有H2O2存在的时候，可以产生羟基自由基。
以上表明本发明使用的CuO纳米酶具有很强的过氧化物酶活性，可分解过氧化氢产生羟基自由基。
实验二、DNA吸附动力学测定
1、考察不同浓度的CuO纳米酶吸附的效果：
按照实施例1的方法，将20nM FAM-A15分散到10mM HEPES缓冲液(pH7.6，150mMNaCl)中，然后加入不同浓度的CuO纳米酶(0-50μg/mL)，接下来用酶标仪测定激发波长470nm，发射波长518nm处的动态荧光，测定时间为30min。
2、按照实施例1至4的方法，分别将20nM FAM-A15、FAM-T15、FAM-C15和FAM-G15 DNA分散到10mM HEPES缓冲液(pH 7.6，150mM NaCl)中，然后加入50μg/mL的CuO纳米酶，考察吸附动力学曲线。
结果参见图2。图2A表示CuO纳米酶可淬灭荧光，因此荧光标记的DNA吸附在纳米酶表面后，荧光会发生淬灭，通过测定荧光变化情况可以判定DNA的吸附。
图2B显示：当向含有FAM-A15的体系中加入CuO纳米酶时，荧光发生淬灭，且荧光淬灭值随纳米酶浓度的增加而增加。
图2C显示CuO纳米酶可淬灭四种不同序列DNA的荧光。
以上表明本发明使用的CuO纳米酶可吸附四种不同序列的DNA。
实验三、考察不同的解析剂对DNA的解吸附：
1、2mM不同类型的DNAs对DNA的解析效果：将实施例1至4中极化控制DNA功能化CuO纳米酶分散在10mM HEPES缓冲液(pH 7.6)中得到分散液。分别将10μL 2mM不同序列类型的DNAs(包括A15、T15、C15和G15)迅速加入90μL分散液中，然后用酶标仪测定激发波长为470nm，发射波长518nm的动态荧光值。
2、1mM不同类型的核苷对DNA的解析效果：将实施例1至4中极化控制DNA功能化CuO纳米酶分散在10mM HEPES缓冲液(pH 7.6)中得到分散液。分别将10μL 1mM的核苷A、C、T、G迅速加入90μL分散液中，然后用酶标仪测定激发波长为470nm，发射波长518nm的动态荧光值。
3、2mM二水合磷酸二氢钠对DNA的解析效果：将实施例1至4中极化控制DNA功能化CuO纳米酶分散在10mM HEPES缓冲液(pH 7.6)中得到分散液。将10μL 2mM二水合磷酸二氢钠迅速加入90μL分散液中，然后用酶标仪测定激发波长为470nm，发射波长518nm的动态荧光值。
4、1％血清对DNA的解析效果：将将实施例1至4中极化控制DNA功能化CuO纳米酶分散在10mM HEPES缓冲液(pH 7.6)中得到分散液。将10μL1％血清迅速加入90μL分散液中，然后用酶标仪测定激发波长为470nm，发射波长518nm的动态荧光值。
结果参见图3。
图3A表示向吸附了荧光标记DNA的CuO纳米酶中加入解吸附试剂，若DNA发生解吸附，则荧光恢复。通过测定荧光值可判断DNA的解吸附情况。
图3B-3E显示：当加入2μM不同序列类型的DNAs后，四种序列类型的荧光标记DNA都没有发生荧光恢复。
图3F显示：当加入1mM不同类型的核苷后，四种序列类型的荧光标记DNA都没有发生荧光恢复。
图3G显示：当加入2mM二水合磷酸二氢钠后，四种序列类型的荧光标记DNA发生了不同程度的荧光恢复。加入二水合磷酸二氢钠后C15的荧光恢复值最低，A15恢复值最高。
图3H显示：当加入1％血清后，四种序列类型的荧光标记DNA发生了不同程度的荧光恢复。加入血清后T15的荧光恢复值最低，A15恢复值最高。
以上表明本发明使用的CuO纳米酶吸附的荧光标记DNA不能被其它序列类型的DNA或核苷解吸附。相比于其它序列类型的DNA，C15最耐磷酸盐引起的解吸附，T15最耐血清引起的解吸附。
实施例5：
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶(Cy5-di-DNA/CuO)，包括Cy5-di-DNA和CuO纳米酶，Cy5-di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-A15(AAAAAAAAAAAAAAA)，Cy5-di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
一种本发明的极化控制DNA功能化CuO纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将20nM的Cy5-di-DNA分散在10mM的HEPES缓冲液中(pH7.6，150mM NaCl)得到分散液；
(2)将50μg/mLCuO纳米酶和分散液在室温条件下孵育2h后得到极化控制DNA功能化CuO纳米酶(3)加入1％经高温灭活FBS，超声混匀，继续孵育1h。
(4)然后在4℃，16000rpm的条件下离心30min，去掉上清，洗涤沉淀，分散于HEPES缓冲液中(10mM，pH 7.6，150mM NaCl)，备用。
实验四：DNA吸附稳定性评价
向实施例5的体系中加入2mM的二水合磷酸二氢钠或10％血清，接下来在室温条件下继续孵育1h，在20000rpm的条件下离心30min，取上清测定激发波长639nm，发射波长669nm的荧光强度，用于计算DNA的吸附率。作为对照，FAM-A15、FAM-(TC)12DNA测定的激发波长为470nm，发射波长为518nm。
参见图4A：由于C15最耐磷酸盐引起的解吸附，T15最耐血清引起的解吸附，因此我们设计一端为(TC)12DNA，另一端为polyADNA所构成的di-DNA。将di-DNA吸附于CuO纳米酶表面进行功能化。
图4B的结果可以看出：用CuO纳米酶吸附DNA时，向体系中加入2mM二水合磷酸二氢钠后，A15的吸附量明显下降，而(TC)12DNA和di-DNA的吸附量变化不大。当向体系中加入10％血清时，A15的吸附量下降到了34％以下，而其它两种DNA大部分仍被CuO纳米酶吸附，
图4C为过氧化物酶活性评价结果：25μg/mL的CuO纳米酶与1μM DNA孵育制备DNA/CuO纳米复合物，将DNA/CuO纳米复合物与500μM的TMB分散到10mM的醋酸钠缓冲液(pH＝4)中，然后迅速加入10mM的过氧化氢溶液，立即用酶标仪测定体系在650nm处的紫外吸收，测定时间30min，然后拍照。TMB氧化产物的生成速率用紫外吸收变化速率根据Beer-Lambert定律计算得到。DNA为(TC)12DNA和di-DNA。
TMB催化实验，结果显示当CuO纳米酶吸附DNA后，相同条件下TMB的生成速率变化不大。
以上表明本发明设计的di-DNA可以高稳定的吸附于CuO纳米酶表面，可抵抗磷酸盐和血清的解吸附；吸附DNA对CuO纳米酶的过氧化物酶活性影响不大。
实施例6
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶(di-DNA/CuO)，包括di-DNA和CuO纳米酶，di-DNA为两嵌段DNA，一端为(TC)12DNA(TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC)，另一端为FAM-A15(AAAAAAAAAAAAAAA)，di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上。
一种本发明的极化控制DNA功能化CuO纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1μM的di-DNA分散在10mM的HEPES缓冲液中(pH7.6，150mM NaCl)得到分散液；
(2)将100μg/mLCuO纳米酶和分散液在4℃下孵育2h得到极化控制DNA功能化CuO纳米酶；
(3)加入1％经高温灭活FBS，超声混匀，继续孵育1h。
(4)然后在4℃，16000rpm的条件下离心30min，去掉上清，洗涤沉淀，分散于HEPES缓冲液中(10mM，pH 7.6，150mM NaCl)，备用。
一种极化控制DNA功能化CuO纳米酶在肿瘤靶向中的应用，其应用方法为：
(1)在极化控制DNA功能化CuO纳米酶体系中加入1％FBS(经高温灭活)，超声混匀，继续孵育1h。然后在4℃，16000rpm的条件下离心30min，去掉上清，洗涤沉淀，分散于HEPES缓冲液中(10mM，pH 7.6，150mM NaCl)，备用。
(2)细胞培养：选用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和人胚胎肾细胞293(HEK293)两种细胞进行培养与实验。首先，将两种细胞分别复苏后接种到细胞培养瓶中用RPMI 1640细胞培养基(含10％FBS和1％双抗)进行培养。两种细胞的培养条件均为37℃，5％CO2的潮湿环境。细胞培养过程中隔天进行培养基更换，以确保细胞生长状态良好，以备后续实验。
(3)胞内ROS评价：选用处于对数生长期的MDA-MB-231细胞进行ROS成像实验。去掉细胞培养基，用PBS洗涤细胞，胰酶消化使其游离，终止消化后接种到24孔无菌细胞培养板中(5×104个/孔)，在37℃，5％CO2的环境中培养过夜，待细胞完全贴壁且生长状态良好时去掉培养基，向每个孔中加入含有不同浓度实施例6的di-DNA/CuO(0.5-5μg/mL)的新鲜培养基。以没有经di-DNA/CuO处理的细胞为空白对照。将处理后的细胞继续在培养箱中培养6h，去掉孵育过细胞的上清培养基，无菌PBS洗涤两次，向每孔中加入37℃预热的DCFH-DA工作液(10μM)，37℃条件下孵育30min，去掉DCFH-DA工作液，用PBS洗涤细胞两次。最后用荧光显微镜观察细胞的绿色荧光，同时进行拍照记录。
(4)细胞毒性实验：用MTT实验评价(TC)12DNA/CuO和实施例6的di-DNA/CuO的细胞毒性。选用处于对数生长期的MDA-MB-231细胞进行实验，去掉细胞培养基，用PBS洗涤细胞，胰酶消化使其游离，终止消化后接种到96孔无菌细胞培养板中(5×103个细胞/孔)。37℃，5％CO2环境中培养过夜，待细胞完全贴壁且生长状态良好时去掉培养基，将含有不同浓度di-DNA/CuO(0-5μg/mL)的新鲜培养基加入培养孔中与细胞孵育，每孔加入的体积为100μL。以没有经di-DNA/CuO处理的细胞为空白对照。将处理的细胞继续在培养箱中培养24h，然后向每孔中加入20μL用PBS溶解的MTT溶液(5mg/mL)。将细胞置于培养箱中继续培养4h，然后弃去上清细胞培养基。每孔加入100μL的二甲基亚砜，避光震荡10min，待蓝紫色的甲瓒结晶完全溶解后，用酶标仪测定490nm波长处的紫外吸收，用于定量分析纳米酶对细胞的毒性。di-DNA/CuO对HEK293细胞的毒性评价方法与上述一致，仅将MDA-MB-231细胞换成HEK293细胞即可。同时，采用相同的方法测定(TC)12DNA/CuO对MDA-MB-231细胞和HEK293细胞的毒性。
图5为实验结果：
图5A显示：随着di-DNA/CuO浓度的增大，细胞的绿色荧光越强。
图5B显示：MDA-MB-231细胞的存活率随着di-DNA/CuO浓度的增加而逐渐降低，并且di-DNA/CuO处理细胞后的存活率比(TC)12DNA/CuO处理细胞后的存活率低。
图5C显示：对于HEK293细胞而言，di-DNA/CuO和(TC)12DNA/CuO处理细胞后的存活率相差不大。并且，这两种纳米酶处理后，HEK293细胞的存活率高于MDA-MB-231细胞。
以上表明本发明构建的di-DNA/CuO能够增加细胞内ROS的水平。相比于(TC)12DNA/CuO，di-DNA/CuO对肿瘤细胞的毒性更强，表明di-DNA/CuO能够通过固有的过氧化物酶活性和腺嘌呤核苷受体介导的细胞靶向递送来特异性引起肿瘤细胞凋亡，这将可能增加肿瘤治疗的效率。
实施例7
一种实施例5的极化控制DNA功能化CuO纳米酶在肿瘤靶向中的应用，其应用方法为：
(1)荷瘤裸鼠造模：裸鼠由中南大学实验动物学部统一在符合动物实验要求的条件下购买并饲养。所有的动物护理和处理均由当地伦理委员会批准，并按照中国相关动物保护法的指导方针实施。在裸鼠右前侧进行皮下接种事先准备好的含有MDA-MB-231细胞、PBS和基质胶的混悬液，每只裸鼠的接种量约为5x 106个细胞，然后正常饲养接种后的裸鼠，待肿瘤体积生长到合适大小后再用于后续的动物实验。
(2)活体成像：将实施例5的Cy5-di-DNA/CuO通过尾静脉注射进荷瘤裸鼠体内。Cy5-di-DNA/CuO的给药剂量为5mg/kg，同时设置对照组，对照组给与当量的Cy5-di-DNA尾静脉注射。在注射后1h和24h时间点，对各组裸鼠进行小动物活体成像。
(3)体内抗肿瘤实验：按照上述方法建立皮下荷MDA-MB-231异体移植的肿瘤裸鼠模型，待肿瘤长到约60mm3时，荷瘤裸鼠被随机分为五组(n＝5)：
A、PBS组；
B、(TC)12DNA/CuO 2.5mg/kg组；
C、di-DNA/CuO 2.5mg/kg组；
D、(TC)12DNA/CuO 5mg/kg组；
E、di-DNA/CuO 5mg/kg组。
接下来对每组荷瘤裸鼠进行标记、体重称量和瘤径测定，然后根据设置的组别，对每只荷瘤裸鼠进行尾静脉给药。给药剂量：B和C为2.5mg/kg，E和F为5mg/kg，给药方式：隔天给药，共8次，同时在治疗期间内隔天进行体重称量和瘤径测定。治疗第20天后，把荷瘤裸鼠安乐处死，取出肿瘤称重。
结果参见图6：荷瘤裸鼠给与尾静脉注射Cy5-di-DNA/CuO后1h，荧光分布于裸鼠全身。与Cy5-di-DNA相比，在注射24h后，Cy5-di-DNA/CuO组裸鼠荧光集中在肿瘤部位。在体内抗肿瘤实验中，di-DNA/CuO对肿瘤生长的抑制作用明显强于(TC)12DNA/CuO对肿瘤生长的抑制作用。治疗20天后，取出各组的肿瘤组织，称重，结果显示di-DNA/CuO组的肿瘤组织重量显著低于(TC)12DNA/CuO组的肿瘤组织重量。在治疗期间内，各组裸鼠的体重变化不大。
以上表明本发明构建的di-DNA/CuO能够富集于荷瘤裸鼠的肿瘤位点。与(TC)12DNA/CuO相比，di-DNA/CuO具有更强的抗肿瘤作用，且在治疗期间是安全的，表明di-DNA能够稳定吸附在CuO纳米酶表面，使得CuO纳米酶在di-DNA的介导下具有体内靶向抗肿瘤作用。其在生物医学领域具有重大的应用价值。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南修悟生物科技有限公司
<120> DNA功能化氧化铜纳米酶及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 1
tctctctctc tctctctctc tctc 24
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaa 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 3
tttttttttt ttttt 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 4
cccccccccc ccccc 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 5
gggggggggg ggggg 15

Claims (5)

1.一种DNA功能化氧化铜纳米酶，其特征在于，包括di-DNA和CuO纳米酶，所述di-DNA为两嵌段DNA，一端为TC碱基组成的DNA序列，另一端为核苷组成的DNA序列，所述TC碱基组成的DNA序列与所述核苷组成的DNA序列直接连接；所述di-DNA通过TC碱基组成的DNA序列吸附在CuO纳米酶上；所述TC碱基组成的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述核苷组成的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；在所述di-DNA上修饰荧光探针。
2.根据权利要求1所述的DNA功能化氧化铜纳米酶，其特征在于，所述di-DNA浓度为10nM～10μM，CuO浓度为20～500μg/mL。
3.一种权利要求1至2中任一项所述的DNA功能化氧化铜纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将di-DNA分散至缓冲液中得到分散液；
S2、将所述分散液与CuO纳米酶混合后进行吸附，得到DNA功能化氧化铜纳米酶；
S3、加入FBS，超声混匀，继续孵育1h；
S4、离心，收集沉淀，分散于HEPES缓冲液中；
所述S1中所述缓冲液为含150mM的NaCl的HEPES缓冲液；
所述S2中所述吸附的温度为4℃；吸附时间2h。
4.一种权利要求1至2中任一项所述的DNA功能化氧化铜纳米酶在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述DNA功能化氧化铜纳米酶的剂量为2.5mg/kg～5mg/kg。
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