CN113325179B - 一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法,包括以下步骤：S1：制备Au@Pt标记单克隆抗体的溶液，Au@Pt标记单克隆抗体为Au@Pt‑mAb；S2:在硝酸纤维素膜上制备检测线T线和控制线C线；S3:将S2中的硝酸纤维素膜与样品垫玻、结合垫和吸水垫组装成整条试纸，然后将组装好的试纸切成试纸条。简便、灵敏、快速、实时的免疫层析法检测谷物中的呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，利用Au@Pt酶本身黑色的特性，实现了对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮(ZEN)的可视化检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域。更具体地，涉及一种基于Au@Pt酶的免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)广泛存在于谷物粮食及环境水体中，具有很强的毒性，对人体构成极大的威胁以及对农作物产量、水体环境均有不同程度的影响。因此建立简便、快速、灵敏的检测方法同时检测这两种毒素具有重要意义。
传统的胶体金免疫层析试纸条主要利用了金颗粒独有的颜色特性实现定性或半定量的检测。此方法具备方便快速，成本低，应用范围广等特点。然而金纳米颗粒在检测的过程中容易受到环境因素的影响，如在强酸、强碱和盐浓度高的环境中容易聚集沉淀，影响检测结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，开发一种简便、灵敏、快速、实时的免疫层析法检测谷物中的呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，利用Au@Pt酶本身黑色的特性，实现了对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮(ZEN)的可视化检测。
本发明的目的是提供一种基于Au@Pt的侧流免疫层析试纸条制备方法,包括以下步骤：
S1：制备Au@Pt标记单克隆抗体的溶液，Au@Pt标记单克隆抗体为Au@Pt-mAb；
S2:在硝酸纤维素膜上制备检测线T线和控制线C线；
S3:将S2中的硝酸纤维素膜与样品垫玻、结合垫和吸水垫组装成整条试纸，然后将组装好的试纸切成试纸条。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤S1包括：
S11先制备Au@Pt纳米酶溶液；
S12取两个离心管，分别加入1mLS101中制备的Au@Pt纳米酶溶液，然后0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH 8.5左右；
S13在两个离心管中分别加入1.3μL 1mg/mL的DON单克隆抗体、2.3μL 0.5mg/mL的ZEN单克隆抗体，室温下反应30min，使抗体标记在胶体金颗粒上；
S14向离心管中各加入牛血清白蛋白溶液，封闭30min，离心去除上清液；
S15将S104中获得的沉淀液重溶于Tris缓冲液，分别得到稳定的Au@Pt标记的DON单克隆抗体和Au@Pt标记的ZEN单克隆抗体。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤S11制备Au@Pt纳米酶溶液的步骤包括：
S111取3mL的K2PtCl6和3mL的HAuCl4·4H2O于酸化后的玻璃瓶中,称取0.06g的Pluronic F127加入混合溶液中，并超声溶解；
S112在超声状态下加入6mL的抗坏血酸，继续超声反应15min,超声完成后置于磁力搅拌器上，室温搅拌20-24h；
S113将获得的产物10000rpm下离心20min，除去多余的Pluronic F127，并加入丙酮和水进行反复洗涤，洗涤4次，最后加入双蒸水并超声分散，获得Au@Pt纳米酶溶液。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S201用PBS稀释的分析物包被原和羊抗鼠二抗分别作为检测线T线和控制线C线，喷在硝酸纤维素膜上，两条线的间距为5mm；
S202将硝酸纤维素膜在60℃下干燥5小时。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种基于Au@Pt的侧流免疫层析试纸条制备方法获得的试纸条。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述试纸条包括底板，所述底板上设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线和控制线C线；
所述硝酸纤维素膜的一端设有结合垫，所述结合垫上设有样品垫玻；所述硝酸纤维素膜的另一端设有吸水垫。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，试纸条在检测谷物粮食及环境水体中毒素的应用。
在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述毒素包括呕吐毒素和玉米赤霉烯酮。
本发明具有以下有益效果：
本发明的纳米酶有着独特的物理化学特性，如比表面积大、生物相容性好、拟酶活性高等特点；而且纳米酶生产成本更低，结构稳定，同时具备多种功能和信号；合成的Au@Pt纳米复合材料具有过氧化物酶和过氧化氢活性且颗粒小，应用于免疫层析方法当中，能够简便、灵敏、快速、实时的免疫层析法检测谷物中的呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，利用Au@Pt酶本身黑色的特性，实现了对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮(ZEN)的可视化检测。
附图说明
图1是试纸条的结构示意图；
图2是Au@Pt酶试纸条滴加DON/ZEN标准品稀释系列浓度后显色情况图。
其中，1-底板，2-硝酸纤维素膜，201-检测线T线，202-控制线C线，3-结合垫，4-吸水垫，5-样品垫玻。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
制备Au@Pt标记单克隆抗体(Au@Pt-mAb)的溶液
(1)制备Au@Pt纳米酶溶液
1.1取3mL的K2PtCl6(20mM)和3mL的HAuCl4·4H2O(20mM)于酸化后的玻璃瓶中；称取0.06g的Pluronic F127加入混合溶液中，并超声溶解。
1.2随后在超声状态下加入6mL的抗坏血酸(100mM，AA)，继续超声反应15min。
1.3超声完成后置于磁力搅拌器上，室温搅拌20-24h。
1.4将获得的产物10000rpm下离心20min，除去多余的Pluronic F127，并加入丙酮和水进行反复洗涤，洗涤4次，最后加入双蒸水并超声分散，Au@Pt纳米酶溶液。
(2)制备Au@Pt标记单克隆抗体(Au@Pt-mAb)的溶液
1.1取两个离心管，分别加入1mL步骤1.4中制备的Au@Pt纳米酶溶液，用0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH 8.5左右。
1.2分别加入1.3μL 1mg/mL的DON单克隆抗体、2.3μL 0.5mg/mL的ZEN单克隆抗体到两个离心管，室温下反应30min，使抗体标记在胶体金颗粒上。
1.3然后向离心管中各加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液(0.01mol/L BB缓冲液，pH 9.0)，封闭30min；在4℃下以8000r/min离心30min后，去除上清液。
1.4将沉淀液重溶于600μL Tris缓冲液(50mmol/L，含3％蔗糖、3％牛血清白蛋白和0.05％磺胺嘧啶作为稳定剂)中，4℃下保存；分别得到稳定的Au@Pt标记的DON单克隆抗体(Au@Pt-DON-mAb)和Au@Pt标记的ZEN单克隆抗体(Au@Pt-ZEN-mAb)。
硝酸纤维素(NC)膜的处理
用PBS稀释的分析物包被原(DON：0.05mg/mL，ZEN：0.1mg/mL)和羊抗鼠二抗(0.22mg/mL)分别作为检测线T线和控制线C线，喷在硝酸纤维素膜上，两条线的间距为5mm，将硝酸纤维素膜在60℃下干燥5小时。
然后与样品垫玻、结合垫和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3mm宽装进试纸卡，在室温下储存备用。
实施例2
在本实施例中，利用实施例1中的方法制备的试纸如图1所示，试纸条的结构包括底板1，所述底板上设有硝酸纤维素膜2，所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线201和控制线C线202；检测线T线可以设置多条；硝酸纤维素膜2的一端设有结合垫3，所述结合垫3上设有样品垫玻5；所述硝酸纤维素膜2的另一端设有吸水垫4。
结合垫3的一端压在硝酸纤维素膜2的一端上面，结合垫3的另一端被样品垫玻5压着，即结合垫3的另一端在样品垫玻5底部；吸水垫4的一端压在硝酸纤维素膜2的另一端上面。
实施例3
在本实施例中，利用实施例1-2获得的试纸对DON和ZEN毒素标准品的检测。
3.1 DON和ZEN标准溶液的配制
用甲醇配制DON和ZEN标准品母液(1mg/mL)，用含有20％甲醇的PBS将DON标准品母液稀释成20ng/mL至1ng/mL系列浓度，ZEN标准品母液稀释成3ng/mL至0.1ng/mL系列浓度用于侧流免疫层析检测。
3.2分析物包被原与分析物竞争Au@Pt-mAb的结合位点
将70μL的样品(DON标准品和ZEN标准品)加入到上样孔并流过膜10分钟；
3.3检测结果的分析及结果判定
用肉眼观察滴加了一系列梯度的标准品的试纸条，如图2所示，相对阴性对照的结果(0ng/mL)，DON/ZEN浓度为0.5/0.1，1/0.2，2/0.5ng/mL测结果显示T线区域黑色强度未减弱，为阴性，2.5/0.7ng/mL和15/2.5ng/mL的检测结果显示T线区域蓝色荧光强度明显减弱，为弱阳性，DON/ZEN浓度高于20/3ng/mL时，无黑色条带，为阳性。
本发明的纳米酶有着独特的物理化学特性，如比表面积大、生物相容性好、拟酶活性高等特点；而且纳米酶生产成本更低，结构稳定，同时具备多种功能和信号；合成的Au@Pt纳米复合材料具有过氧化物酶和过氧化氢活性且颗粒小，应用于免疫层析方法当中，能够简便、灵敏、快速、实时的免疫层析法检测谷物中的呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，利用Au@Pt酶本身黑色的特性，实现了对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮(ZEN)的可视化检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于Au@Pt的侧流免疫层析试纸条制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备Au@Pt标记单克隆抗体的溶液，Au@Pt标记单克隆抗体为Au@Pt-mAb；
S2：在硝酸纤维素膜上制备检测线T线和控制线C线；
S3：将S2中的硝酸纤维素膜与样品垫、结合垫和吸水垫组装成整条试纸，然后将组装好的试纸切成试纸条；
其中，步骤S1包括：
S11先制备Au@Pt纳米酶溶液；
S12取两个离心管，分别加入1mL S11中制备的Au@Pt纳米酶溶液，然后0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH 8.5；
S13在两个离心管中分别加入1.3μL 1mg/mL的DON单克隆抗体、2.3μL 0.5mg/mL的ZEN单克隆抗体，室温下反应30min，使抗体标记在胶体金颗粒上；
S14向离心管中各加入牛血清白蛋白溶液，封闭30min，离心去除上清液；
S15将S14中获得的沉淀液重溶于Tris缓冲液，分别得到稳定的Au@Pt标记的DON单克隆抗体和Au@Pt标记的ZEN单克隆抗体；
步骤S11制备Au@Pt纳米酶溶液的步骤包括：
S111取浓度为20mM的K2PtCl63 mL和浓度为20mM的HAuCl4·4H2O 3mL于酸化后的玻璃瓶中,称取0.06g的Pluronic F127加入混合溶液中，并超声溶解；
S112在超声状态下加入6mL浓度为100mM的抗坏血酸，继续超声反应15min,超声完成后置于磁力搅拌器上，室温搅拌20-24h；
S113将获得的产物10000rpm下离心20min，除去多余的Pluronic F127，并加入丙酮和水进行反复洗涤，洗涤4次，最后加入双蒸水并超声分散，获得Au@Pt纳米酶溶液。
2.根据权利要求1所述的基于Au@Pt的侧流免疫层析试纸条制备方法,其特征在于，步骤S2中硝酸纤维素膜的处理方法包括：
S201用PBS稀释的分析物包被原和羊抗鼠二抗分别作为检测线T线和控制线C线，喷在硝酸纤维素膜上，两条线的间距为5mm；
S202将硝酸纤维素膜在60℃下干燥5小时。
3.一种权利要求1-2任一项所述的基于Au@Pt的侧流免疫层析试纸条制备方法获得的试纸条。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，所述底板上设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线和控制线C线；
所述硝酸纤维素膜的一端设有结合垫，所述结合垫上设有样品垫；所述硝酸纤维素膜的另一端设有吸水垫。
5.权利要求3所述的试纸条在检测谷物粮食及环境水体中毒素的应用。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述毒素包括呕吐毒素和玉米赤霉烯酮。
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