CN114924084A - 一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用 - Google Patents

一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用；测定试剂盒，包括免疫层析试纸条和样本稀释液；免疫层析试纸条包括底板和设于底板上的样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；样本垫上包被有标记Hb抗体的荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有HbA1c抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被有不同抗原结合位点的Hb抗体。采用本发明试剂盒T线和C线的结合都会同样地受温度影响，T线反应和C线反应同步上升和同步下降，达到不受环境温度影响的目的。

Description

一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫应用技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用。
背景技术
免疫层析技术是建立在层析膜上以抗原抗体特异性反应为基础的免疫检测技术，以其快捷简便、间隔低廉、灵敏度高等优势而广泛运用于并于病原体检测、食品安全测量、环境监测等方面。
成人红细胞内的血红蛋白主要是HbA1，糖化血红蛋白是血红蛋白在高血糖的作用下发生缓慢连续的非酶促糖化反应的产物，通常占总Hb的5-8％，主要组分为HbA1c。在正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度呈正比。由于蛋白质浓度相对稳定，糖化水平主要取决于葡萄糖的浓度。血红蛋白的半衰期为60天，故HbA1c的测定可反映测定前6-8周的平均血糖水平。临床上测定糖化血红蛋白(HbA1c)的含量，主要用于评价糖尿病患者血糖控制的程度。
现有市面上采用免疫层析法的糖化血红蛋白测定试剂盒的做法，是在荧光微球上标记HbA1c抗体作为检测微球，标记兔IGG抗体作为质控微球；硝酸纤维素膜上包被Hb抗体作为检测线T，包被羊抗兔IGG抗体作为质控线检测，反应值就是T线的荧光信号比上C线的荧光信号。这种试剂盒在测试糖化时会受到温度的影响：一是温度会影响红细胞的裂解速度；二是温度会影响抗体的结合速率；这就导致随着温度的升高，T线的反应必然升高，而C线反应因为是微球和质控线直接结合，不会涉及到红细胞的裂解，所以升高并不明显，进而就导致了T/C的升高，最终测试结果偏高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的免疫层析法法糖化血红蛋白测定试剂盒受温度影响大，测试结果不准确。目的在于提供一种糖化血红蛋白测定试剂盒、制备方法及其应用，以解决以上问题。
本发明的第一个目的在于提供一种糖化血红蛋白测定试剂盒，包括免疫层析试纸条和样本稀释液；
所述免疫层析试纸条包括底板和设于底板上的样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；
所述样本垫上包被有标记Hb抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有HbA1c抗体，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有不同抗原结合位点的Hb抗体。
可选地，所述结合垫上包被的荧光微球的浓度为0.5～1.5％，硝酸纤维素膜检测线上HbA1c抗体的包被浓度为1～2mg/mL，质控线上不同抗原结合位点的Hb抗体的包被浓度为1～2mg/mL。
可选地，硝酸纤维素膜的检测线上HbA1c抗体的划膜量为1uL/cm，质控线上不同抗原结合位点的Hb抗体的划膜量为1uL/cm。
可选地，所述样本稀释液为浓度为50mM的PBS溶液，PBS溶液的pH为7.2。
可选地，所述试剂盒还包括卡壳，所述免疫层析试纸条位于所述卡壳内，卡壳上设有与样品垫、硝酸纤维素膜分别对应的加样位和检测位。
本发明的第二个目的在于提供上述测定试剂盒的制备方法，包括：
标记Hb抗体的荧光微球的制备；
样本垫制备；将标记Hb抗体的荧光微球喷涂于玻纤上；
硝酸纤维素膜的制备：将HbA1c抗体划线于硝酸纤维素膜上作为检测线，将不同抗原结合位点的Hb抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线；
将样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫固定贴于底板上，斩切为试纸条，装入卡壳。
可选地，所述标记Hb抗体的荧光微球的制备过程为：取荧光微球进行离心；去除上清液；加入偶联缓冲液；加入EDC溶液、sulfo-NHS溶液，混匀，孵育；加入偶联缓冲液，抗Hb单克隆抗体，混匀，孵育；加入封闭液，混匀，孵育；加入保存液，混匀；
可选地，所述硝酸纤维素膜的制备过程中，将HbA1c抗体与不同抗原结合位点的Hb抗体经稀释后进行划线，使用的稀释液为浓度为5％的蔗糖溶液和浓度为50mM的PBS溶液，其中PBS溶液的pH值为7.5。
可选地，所述样本垫制备过程中，将标记Hb抗体的荧光微球与处理液一起喷涂于玻纤上，处理剂包括：质量分数为10％的阻断剂、质量分数为0.5％的吐温20、浓度为50mM的PBS溶液，其中PBS溶液的pH值为7.2。
本发明的第三个目的在于提供上述测定试剂盒的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明改变传统的测试模式，将标记的T线微球抗体换成Hb抗体，不标记C线的抗体，包被的T线抗体为HbA1c，包被的C线抗体为不同抗原结合位点的Hb抗体结合。采用这种模式，T线和C线的结合都会同样地受温度的影响，T线反应和C线反应同步上升和同步下降，达到不受环境温度影响的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
图1为传统试剂盒在测试时免疫层析试纸条上的反应原理图。
图2为本发明的试剂盒在测试时免疫层析试纸条上的反应原理图。
图3为采用传统、本发明的试剂盒测试样本浓度为6％时环境温度-T/C关系曲线图。
图4为采用传统、本发明的试剂盒测试样本浓度为4.5％时环境温度-T/C关系曲线图。
图5为采用传统、本发明的试剂盒测试样本浓度为10％时环境温度-T/C关系曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
材料及试剂：荧光微球(货号：XC030)，购自merck；吗啉乙磺酸(购自苏州亚科)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液(购自阿拉丁)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(购自阿拉丁)、BSA(购自sigma)、Tirs-HCl(购自sigma)、阻断剂(购自珠海启尼亚)、吐温209(购自阿拉丁)、Hb(购自菲鹏生物)、不同抗原结合位点的Hb抗体(购自菲鹏生物)、HbA1c抗体(购自菲鹏生物)、聚酯纤维膜(购自PALL)。
喷金仪：杭州峰航生产，型号为HGS510-1；荧光检测仪：四川新健康成生家生产，型号为Auto-HFIAS1000。
一、标记Hb抗体的荧光微球的制备
1.取出1支500ul荧光微球(1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nm)放入离心管中。
2.离心10min，转速12000rpm～20000rpm，使微球沉降，去除上清。
3.加入500uL偶联缓冲液：浓度50mM的吗啉乙磺酸(MES)，pH为6.0，混匀。
4.加入20uL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液(EDC)，浓度200mM，20ulN-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(sulfo-NHS)，浓度200mM，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。
5.离心10min，转速12000rpm～20000rpm，使微球沉降，去除上清。
6.加入500uL偶联缓冲液：浓度50mM的吗啉乙磺酸(MES)，pH为6.0，混匀后分别加入0.1mg抗Hb单克隆抗体，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
7.离心10min，转速12000rpm～20000rpm，使微球沉降，去除上清。
8.加入封闭液(质量分数为1％BSA水溶液)，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
9.离心10min，转速12000rpm～20000rpm，使微球沉降，去除上清。
10.加入500ul保存液(质量分数为1％BSA的水溶液，质量分数为1％的蔗糖溶液，Tirs-HCl pH 9.0)，混匀。
二、样本垫制备
将玻纤裁切为2*30cm的规格，使用喷金仪将处理液(包括质量分数为10％的阻断剂，质量分数为0.5％的吐温20，50mM PBS溶液，PBS溶液pH 7.2)喷涂于玻纤一侧，喷量4uL/cm。37℃烘干24h。
三、硝酸纤维素膜制备
将HbA1c抗体，使用稀释液(含质量分数为5％的蔗糖和浓度为50mM的PBS溶液，PBS溶液的pH 7.5)稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为检测线；将不同抗原结合位点的Hb抗体使用稀释液(含质量分数为5％的蔗糖和浓度为50mM的PBS溶液，PBS溶液的pH 7.5)稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为质控线；划膜量1ul/cm，37℃烘干24h。
四、组装
将PVC底板上贴好吸水纸、制备好的样品垫，硝酸纤维素膜，斩切为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装至铝箔袋。卡壳上设有与样品垫、硝酸纤维素膜分别对应的加样位和检测位。
得到的试纸条如图2所示。
现有的糖化血红蛋白测定试剂盒试纸条的反应原理见图1；采用本发明实施例得到的试剂盒在检测时测试卡的反应原理见图2。
现有的试纸条上样品垫上的反应是样品中的HbA1c与标记有HbA1c抗体的荧光微球结合；标记兔IGG的荧光微球不参与样本反应；免疫复合物与检测线上包被的Hb抗体结合产生信号；质控线上标记有兔IGG的荧光微球与包被的羊抗兔IGG结合，产生信号。
本发明的试纸条上样品垫上的反应是样品中的HbA1c与标记有Hb抗体的荧光微球结合；免疫复合物与检测线包被的HbA1c抗体结合，产生信号；质控线上免疫复合物与包被有不同抗原结合位点的Hb抗体结合，产生信号。
本发明改变传统的测试模式，将标记的T线微球抗体换成Hb抗体，不标记C线的抗体，包被的T线抗体为HbA1c，包被的C线抗体为不同结合位点的Hb抗体(即图2中的Hb抗体2)，即抗原结合位点不同的Hb抗体。这种模式下，C线能跟标记的荧光微球与血红蛋白的复合物发生反应，受到红细胞裂解的影响，从而T线和C线的结合都会同样地受温度的影响，T线反应和C线反应同步上升和同步下降，达到不受环境温度影响的目的。
五、测试
将一定浓度的样本和制作好的HbA1c检测试剂恢复至室温，取5uL样本加入至400uL的样本稀释液(浓度为50mM的PBS，pH 7.2)中，混匀，形成样本溶液，取75uL加入至试纸条中，5min后使用荧光检测仪读取结果。其中，样本溶液中样本的质量分数为4％～14％。
如图3、表1，为采用传统试剂盒、本发明试剂盒测试浓度为6％的样本溶液的结果。
表1测试浓度为6％的样本溶液的测试结果
Figure BDA0003688502640000051
如图4、表2，为采用传统试剂盒、本发明试剂盒测试浓度为4.5％的样本溶液的结果。
表2测试浓度为4.5％的样本溶液的测试结果
Figure BDA0003688502640000052
如图5、表3，为采用传统试剂盒、本发明试剂盒测试浓度为10％的样本溶液的结果。
表3测试浓度为10％的样本溶液的测试结果
Figure BDA0003688502640000053
由以上结果可知，采用本发明的试剂盒测定不同浓度样本溶液，得到的T/C值在温度变化下改变不大，基本保持稳定，而用传统试剂盒测定，得到的T/C值在温度变化时变化较大，在温度升高时T/C值偏大，受温度影响大。可见本发明的试剂盒能消除温度对糖化反应的影响，提高检测稳定性和准确性。
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括免疫层析试纸条和样本稀释液；
所述免疫层析试纸条包括底板和设于底板上的样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；
所述样本垫上包被有标记Hb抗体的荧光微球，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有HbA1c抗体，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有不同抗原结合位点的Hb抗体。
2.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述结合垫上包被的荧光微球的浓度为0.5～1.5％，硝酸纤维素膜检测线上HbA1c抗体的包被浓度为1～2mg/mL，质控线上不同抗原结合位点的Hb抗体的包被浓度为1～2mg/mL。
3.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜的检测线上HbA1c抗体的划膜量为1uL/cm，质控线上不同抗原结合位点的Hb抗体的划膜量为1uL/cm。
4.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为浓度为50mM的PBS溶液，PBS溶液的pH为7.2。
5.如权利要求1所述的一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括卡壳，所述免疫层析试纸条位于所述卡壳内，卡壳上设有与样品垫、硝酸纤维素膜分别对应的加样位和检测位。
6.如权利要求1～5任一项所述的糖化血红蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
标记Hb抗体的荧光微球的制备；
样本垫制备；将标记Hb抗体的荧光微球喷涂于玻纤上；
硝酸纤维素膜的制备：将HbA1c抗体划线于硝酸纤维素膜上作为检测线，将不同抗原结合位点的Hb抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线；
将样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫固定贴于底板上，斩切为试纸条，装入卡壳。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述标记Hb抗体的荧光微球的制备过程为：取荧光微球进行离心；去除上清液；加入偶联缓冲液；加入EDC溶液、sulfo-NHS溶液，混匀，孵育；加入偶联缓冲液，抗Hb单克隆抗体，混匀，孵育；加入封闭液，混匀，孵育；加入保存液，混匀。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的制备过程中，将HbA1c抗体与不同抗原结合位点的Hb抗体经稀释后进行划线，使用的稀释液为浓度为5％的蔗糖溶液和浓度为50mM的PBS溶液，其中PBS溶液的pH值为7.5。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述样本垫制备过程中，将标记Hb抗体的荧光微球与处理液一起喷涂于玻纤上，处理剂包括：质量分数为10％的阻断剂、质量分数为0.5％的吐温20、浓度为50mM的PBS溶液，其中PBS溶液的pH值为7.2。
10.如权利要求1～5任一项所述的糖化血红蛋白测定试剂盒测定不同浓度样本溶液中糖化血红蛋白含量的应用，样本溶液中样本的质量分数为4％～14％。
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