JPS6071957A - 超音波処理により免疫反応を促進する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 配位子とその受容体との結合、とくにハプテンおよび抗
原とそれらのそれぞれの抗体との結合が興味ある広範な
種類の場合が存在する。配位子−受容体の結合を含む多
くのアッセイにおいて、問題の濃度はきわめて低く、そ
して反応成分の熱不安定性から見て、高温は排除される
。多くの場合において、機械的攪拌、例えば、渦の発生
または急速攪拌は排除される。

配位子−受容体の対の構成員の一方を固体の支持体へ結
合するとき、この問題は悪化する。事実、このような構
成員の拡散速度はゼロであり、そして結合反応のために
前記対の他方の構成員の拡散に依存しなくてはならない
。さらに、構成員の一方が大きいタンパク質、例えば、
抗体であるとき、拡散速度はきわめて遅い。こうして、
拡散速度が遅ぐかつ結合対の構成員の一方または双方の
濃度が低い場合において、結合対の２つの構成員が反応
して複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する速度を増大す
るための技術を発見することは重要となってくる。

次の文献を参照：Ｂｅｒｅｚｉｎ、ｅｔ　ａＳｉ　ｎａ
ｌｓ、ｉｎ“ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅｓ　
ａｎｄ　ＰｒｏｐｔｅｉｎＳ、”ｅｄ、Ｔｈｏｍａｓ　
Ｍｉｎｇ　ＳｗｊＣｈａｎｇ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｖｏｌ、２，１９７９．ｐｐｓ、
２３７−２５１およびＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎａ、Ｖｏｌ、３．Ｐｔ、２；　”Ｕｌｔｒａ
　５ｏｕｎｄ；Ｉｔｓ　ＡｐｐｌｉｃａＬｉｏｎｓ　ｉ
ｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄＢｉ　ｏ　ｌ　ｏｇｙ、
”　Ｆｒｙ、Ｆｒａｎｃｉ　ｓＪ、、Ｅｌｓｅｖｔｅｒ
、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９７８．２’ｌＯ，超酸化
物のジスムターゼ（ｄｉ　ｓｍｕｔ　ａｓｅ）ｃｙ）活
性およびイソ酵素の分析への試料調製物の効果は、次の
文献に記載されており、そして超音波処理の効果が記載
されている：５ｔｅｉｎ、ａｔａ１．．Ｊ、Ｉｎｏｒ　
、Ｂｆｏｃｈｅｍ、。

（１９８２）１６：７１−７．不動化されたα−キモト
リプシン活性の超音波照射による加速は、次の文献に記
載されている：Ｉｓｈｉｍｏｒｉ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｃａｔａｌ、、（１９８１
）、１２　：　２５３−９．カタラーゼおよび５− マレートデヒドロゲナーゼへの超音波の効果は、次の文
献に記載されている：Ｋａｓｈｋｏｏｌｉ、ｅｔ　ａｌ
、、Ｊ、Ａｃｏｕｓｔ、Ｓｏｃ。

Ａｍ、、（１９８０）６７　：１７９８−１８０１、ド
イツ国出願第１４４，５５８号には、有機担体の超音波
処理による不動化された酵素の活性を増加することが記
載されている。Ｓｃｈｍｉｄｔ、ｐ、（ドイツ国出願第
１５０，６２８号）には、超音波処理による不動化され
た酵素の再活性化が記載されている。また、次の文献を
参照：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　８９：
２７９４Ｙ；９６：１７９３９０ｊ；９６：１３８５６
３２；９５：１４ｆｉ１５４ｍ；９３：６４７６０ＡＨ
９２：１４２４００ｄ；９６：１１８１５７ｓ、また、
Ｈｉｇｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｃｈ、１９８
３中の“Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ”と題する論文を参
照。

特異的に結合する対の構成員の間の複合体の形成の速度
は、特異的に結合する対の構成員を含有６− する媒質の超音波処理により増大される。この方法は、
とくに構成員の一方が固体の支持体へ結合されている場
合に、臨床的アッセイにとくに応用される。

特異的に結合する対の構成員の間の結合の速度は、とく
に特異的に結合する対の構成員の一方が固体の支持体へ
結合されている場合に、改良される。多くの場合におい
て、このような速度の測定は有用な情報を提供し、そし
て媒質中のある成分の存在および量に関係ずけられる。

この速度は均質系におけるように直接測定することがで
き、あるいは不均質系におけるように間接的に測定する
ことができる。

大部分について１本発明がとくに有用な方法は、特異的
に結合する対の構成員の間の拮抗的または非拮抗的結合
が起こるアッセイを包含する。

このアッセイ法において、特異的に結合する対の構成員
の一方一一配位子または受容体−一は標識へ結合される
。この結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、検出可能な信
号を提供する信号生成系の成分の１つである。観測され
た信号のレベルを、標識の特異的に結合する対の構成員
とその受容体の結合構成員との間の複合体の形成の量に
関係ずける。

本発明の目的に対して、配位子は相互的な結合、構成員
を有する有機化合物である。したがって、配位子は、ハ
プテンおよび抗原であり、小さい有機化合物、例えば、
薬物、例えば、ステロイド、合成薬物、脂質、例えば、
プロスタグランジン、ロイコトリエン、アヘン剤、ベー
ターアドレナリン作用薬物など；サツカリドまたは多糖
類、例えば、細胞壁；オリゴペプチドまたはタンパク質
、例えば、酵素、表面膜タンパク質、構造タンパク質、
ホルモンなど；ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの
ような種々の物質を包含する。

受容体は、配位子の特定の空間的および極性の構成を認
識する化合物であろう、受容体は、通常高分子であり、
分子量が一般に３０．０００より大きいか、あるいは通
常ｔｏｏ、０００より大きく、表面膜、または抗体、ま
たはそれらの断片中にしばしば見出される自然受容体を
包含することができる。

配位子または受容体のいずれかはアッセイ媒質中の分析
物（ａｎａｌｙｔｅ）であることができる。

広範な種類の標識、例えば、ラジオヌクレオチド、酵素
、蛍光物質、酵素コファクター、酵素基質などを包含す
ることができる。

本発明の利益を享受できるアッセイを実施する種々の方
法が知られている。これらの方法は、分離工程を存在さ
せないことを意図する「均質」であるか、あるいは分離
工程を存在させることを意図するｒ不均質」であること
ができる、均質なアッセイを実施する例示的方法は１次
の特許に記載されている：米国特許第３，８１７，８３
７号、ならびに米国特許第３，８６２，１５７号、同第
４，１９０，４９６号、同第４，１９１．６９− １３号、および同第４，２０３，８０２号、これらの特
許の開示をここに引用によって加える。不均質なアッセ
イの例示的方法は、次の特許に記載されている：米国特
許第４，０６７．９５９号。

同第４，１６８，１４６号、および同第４，２２９．９
１６号、これらの特許の開示をここに引用によって加え
る。

均質な方法は、通常、水性媒質中において標識分析物ま
たは分析物類似体を試料および分析物の受容体と一緒に
することからなり、ここで受容体の標識分析物への結合
は信号の変化を生ずる０例えば、標識が酵素であるとき
、受容体を分析物−酵素結合体へ結合すると、通常、実
質的に減少した酵素活性を生ずる。

前述のように、特異的に結合する対の構成員の一方が固
体の支持体へ結合されている１通常非拡散性の固体の支
持体へ非拡散的に結合している場合において、本発明は
とくに興味がある。この支持体は、容器の表面１例えば
、微小力価（ｍｉｃ−１〇− ｒｏｔｉｔｅｒ）ｃ７）ウェル（ｗｅ　ｌ　ｌ）容器、
プラスチックのストリップ、吸湿性（ｂｉｂｕｌ。

ＵＳ）部材、ミクロ−クロマトグラフィーのカラム、薄
層クロマトグラフィーのストリップ、固体粒子などを包
含することができる。特異的に結合する構成員は、支持
体へ共有結合または非共有結合で、通常特異的構成員、
ならびに支持体の性質に依存して結合する。

固体の支持体を含む不均質アッセイは、普通のディツプ
スティック（固体のストリップ）の使用により例示され
る。ディツプスティックは、それへ結合された特異的に
結合する対の構成員の一方を有するであろう。例えば、
分析物または受容体のいずれかをディツプスティックへ
結合することができる。好ましいモードにおいて、酵素
もディツプスティックへ結合され、ここでこの酵素は酵
素の対の一方であり、一方の酵素の基質（Ｓｕｂｓｔｒ
ａｔｅ）は他方の酵素の生成物である。ディツプスティ
ックへ結合された種々の活性構成員を含有するディツプ
スティックを、試料および信号を生成するために必要な
追加の構成員を含有するアッセイ媒質中に導入する０例
えば、分析物がハプテンであるとき、酵素で標識された
受容体を含めることもできる。アッセイ媒質中でハプテ
ンへ結合しない受容体は、ディツプスティックへ結合さ
れたハプテンへ結合するであろう。十分な時間後、ディ
ツプスティックをアッセイ媒質から取り出し、そして検
出可能な信号の生成を可能とする現像溶液へディツプス
ティックを挿入することができる。通常、ディツプステ
ィックはアッセイ媒質中に部分的に挿入し、こうして活
性成員が試料と接触するようにする。

前述のようなアッセイにおいて、配位子と受容体とが反
応して複合体を形成する速度を増大するために、アッセ
イ媒質を、例えば超音波装置内の浴中に導入することに
より、超音波にさらすことができる。。一般に、媒質を
超音波に十分な時間さらして、特異的に結合する対の構
成員の間の結合の少なくとも２５％が起こるようにする
。超音波処理の周波数は、浴の大きさ、超音波処理の時
間、および利用する装置に依存して、約５〜１０”ｋＨ
ｚ、好ましくは約１５〜５００ｋＨｚである。電力は一
般に約１０−１００ワツト、より通常約２５〜７５ワツ
ト、好ましくは約４５〜６０ワツトである。温度は一般
に約１５〜４０℃の範囲に維持する。アッセイ媒質は一
般に約０゜１−１０　ｍ　ｌ　、より通常的０．１〜５
ｍｌの範囲の体積である。時間は、周波数および電力に
依存して、約３０秒〜２時間、より通常約１分〜３０分
である。電力、周波数および時間は、結合する構成員へ
悪影響を及ぼさずかつアッセイの精度を確保するように
選択する。

試料中の洗浄剤の存在は、超音波への応答に影響を及ぼ
しうることか発見された。望ましくは、少量の非イオン
性またはイオン性の洗浄剤を使用することができる。洗
浄剤は、一般に０．００１〜１重量％、より通常０．０
０５〜０．１重量％１３− の量で存在する。

超音波処理後、アッセイのプロトコール（ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌ）の残りの工程を実施することができる。

超音波処理を用いる抗原−抗体の免疫反応を、攪拌混合
を用いる免疫反応と比較した。

超音波処理に使用した装置は、メツトラ−・ウルトラソ
ニック・クリーナー（ＭｅｔｔｌｅｒＵｌｔｒａｓｏｎ
ｉｃ　Ｃ１ｅａｎｅｒ）ＭＥ１１型（Ｍｅｔｔｌｅｒ　
ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＣｏｒｐ、、Ａｎａｈｅｉｍ、Ｃ
ａ１ｉｆｏｎｉａ　９２８０５）であった。試料を５０
ワツトの電力の設定でｔ、ｔＵ容の容器内に入れ、そし
て超音波処理を種々な時間維持した。周波数は６０ｋＨ
ｚであった。攪拌は機械的振盪器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
、ＧＣＧ　Ｍｏｄｅｌ　５０．Ｐｒｅｃｉｓｔｏｎ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｇｒ。

ｕｐ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｉｓ　６０６４７）
により６０サイクル／分において実施し１４− た。

尖施携」 モルフインに対する抗体（抗モルフイン）ヲ濾紙上に不
動化した。抗体の紙の０．７９ｃｍ（５／１６インチ）
のディスクを、１．Ｏｎｇ／ｍｌの３Ｈ−モルフインを
含有する緩衝化１０ｎｇ／ｍｌのモルフイン溶液中で、
超音波処理または攪拌混合を用いて１０〜１２５分間イ
ンキュベーションした。次いで、ディスクをリン酸塩緩
衝液、ｐ）（７，ｏで洗称し、１ｍｌのＯ，１モルのグ
リシン−）（ＣＩ緩衝液、ｐＨ２，２中でインキュベー
ションして、結合したモルフインを解放した。次いで、
この溶液をにシンチレーション液体で１０ｍ１に希釈し
、３Ｈ−モルフインについて計数した。超音波処理で０
．５の平衡点に到達する免疫反応の速度は、攪拌混合を
用いたときのそれより、５〜１０分の間の抗体−抗体の
インキュベーションにおて、５倍速かった。

実差舊Ｊ グルコースオキシダーゼアミンおよびベニシロ酸に対す
る抗体（抗ベニシロ酸塩）を有する濾紙を、ディツプス
ティックに製作し、そしてゼロまたは３００ｎｇ／ｍｌ
のアンピシロ酸および２゜Ｏｎ　ｇ　／　ｍ　ｌのベル
オキシダーゼーアンビシロ酸結合体を含有する溶液とと
もにインキュベーション、そしてこの混合物を室温にお
いて１〜１５分間超音波処理し、攪拌混合し、あるいは
静止させて維持した。次いで、ディツプスティックを３
００　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの４−ＣＩ　−１−ナフトー
ル、５０ミリモルのグルコースおよび２　ｍ　ｇ　／　
ｍ　ｌのウシ直情アルブミンおよび０．１モルのリン酸
塩緩衝液、ｐＨ７，０を含有する現像溶液へ移した。現
像溶液中で１５分間インキュベーションした後、ディツ
プスティックを取り出し、吸いとり、そして色を反射計
で測定した０反射計の単位に基づいて、１分後、超音波
混合についての読み１００であり、そして１０分におい
て約１６０であったが、これに対して攪拌混合について
の読みは同一の時間および条件のもとで約３５および１
００であった。他の実験において、超音波混合について
の読みは１分後に６０でありかつ１０分後に１１５であ
り、これに対して攪拌混合についての読みは１分後に３
５でありかつ１０分後に６５であった。

上の結果から明らかなように、配位子および受容体の間
の結合の速度は、構成員の一方が固体の表面へ結合され
ている場合でさえ、比較的短い時間の間、超音波処理を
使用することにより実質的に増大することができる。こ
の方法において、より高い程度の複合体化（ｃｏｍｐｌ
ｅｘｉｎｇ）が比較的短い時間で起こるので、アッセイ
は非常に大きい反復性および大きい感度で実施すること
ができる。さらに、超音波処理はディツプスティックま
たは試薬にそれらの活性の減少に関して悪影響を及ぼさ
ず、また他の望ましくない作用を起こさない。

１７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ、水性媒質中で特異的に結合する対の構成員の結合を
   測定する方法において、特異的に結合する対の構成員を
   含有する水性媒質を、前記構Ｊ＆員の結合速度を増大す
   るために十分な時間、超音波処理することを特徴とする
   方法。 ２、試料を水性媒質中において特異的に結合する対の少
   なくとも他方の構成員および前記試料の構１８＃、負の
   量に関して検出可能な信号を生成することができる信号
   生成系の成分と一緒にすることからなる、試料中の特異
   的に結合する対の構成員の存在を決定する方法において
   、特異的に結合する対の構成員の結合速度を増大するた
   めに十分な時間の間かつ十分な強度において、混合物を
   超音波処理することを特徴とする方法。 ３、特異的に結合する対の構成員が配位子および受容体
   である特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ４、配位子がハプテンまたは抗原である特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 ５、受容体が抗体である特許請求の範囲第３または４項
   記載の方法。 ６、媒質を約５〜１０３ｋＨｚの周波数で超音波処理す
   る特許請求の範囲第１または２項記載の方法。 ７、媒質を約３０秒〜２昨間超音波処理する特許請求の
   範囲第１または２項記載の方法。 ８、信号生成系の成分の１つが特異的に結合する対の構
   成員の一方へ結合した酵素または蛍光物質である特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ９、特異的に結合する対の構成の一方が支持体へ結合さ
   れている特許請求の範囲第２項記載の方法。 １０、支持体が固体のストリップである特許請求の範囲
   第９項記載の方法。 １１、信号生成系の成分の少なくとも１つがディツプス
   ティックへ結合されている特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 １２、信号生成系の成分が前記ディツプスティックへ結
   合した酵素と第２の酵素とからなり、ここで一方の酵素
   の基質は他方の酵素の生成物である特許請求の範囲第１
   １項記載の方法。 １３、タンパク質のアッセイである特許請求の範囲第２
   項記載の方法。