CN106153951A - 一种乳制品中玉米赤霉醇类的可视化单分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳制品中玉米赤霉醇类的可视化单分子检测方法，包括：分别配制聚苯乙烯供体微球溶液和聚苯乙烯受体微球溶液；玉米赤霉醇类抗原溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液；充分混合聚苯乙烯供体微球溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液，得到混合溶液a；充分混合受体微球溶液和玉米赤霉醇类抗原溶液，得到混合溶液b；混合溶液a和混合溶液b分别避光反应后与乳制品悬浮液充分混合，得到混合溶液e；避光反应；聚焦超声辐射场处理后进入微流控芯片；激光照射微流控芯片，用单光子检测器记录微流控芯片小孔位置发出的光信号，得到可视化图像检测结果；本发明可实现对乳制品中单分子浓度级别的玉米赤霉醇类物质的快速检测。

Description

一种乳制品中玉米赤霉醇类的可视化单分子检测方法

技术领域

本发明涉及一种乳制品中玉米赤霉醇类及其它不得检出违禁物的可视化单分子检测技术

背景技术

玉米赤霉醇及其类似物属于雷索酸内酯类非甾体同化激素，具有促进畜禽增重的作用，曾以皮埋的方式用于禽畜养殖。然而，残留在动物组织中的玉米赤霉醇由于具有雌性激素的生物活性，经食物进入人体后，轻则引起人体性激素机能紊乱，重则影响第二性征的正常发育，且在外因刺激下可能引发癌症，严重危害人类健康，甚至危及婴幼儿生命安全。欧盟已于1998年明令禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖；2002年，我国农业部第193号公告也明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品动物，所有可食动物不得检出；2010年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第四批)》中再次将玉米赤霉醇列入非食用物质，在动物性食品中不得检出。但在经济利益的驱使下，部分违法者仍在畜禽养殖过程中使用玉米赤霉醇，导致玉米赤霉醇可能会残留在各种食用组织及代谢物中。乳制品作为一种重要的动物源食品，同样存在被残留的玉米赤霉醇污染的风险，由于乳制品受众的特殊性，其食用安全更是备受关注。

目前，乳制品中玉米赤霉醇类物质的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等。国家标准GB/T 21982-2008《动物源食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》中的颁布方法也适用于乳制品基质。但在现有的检测方法中，大多数方法都具有前处理复杂、耗时长、检测成本高、仪器昂贵等缺点，在我国当前国情下由于受到人力、物力的双重制约，许多部门难以普遍推广高档分析仪器法；同时其检测灵敏度往往只能达到ppb级别，大都不能满足不得检出的终极目标。酶联免疫法虽属于相对较快的检测方法，但检测灵敏度较差，且易出现假阳性误报情况，为后续工作带来诸多不便。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效、低成本的乳制品中玉米赤霉醇类的检测方法。本发明结合发光氧通道免疫分析技术、超声辐射场非特异性免疫结合消除技术及微流控技术的可视化检测方法，可实现对乳制品中单分子浓度级别的玉米赤霉醇类物质的快速检测。本发明的技术方案如下：

一种乳制品中玉米赤霉醇类的可视化单分子检测方法，包括下列步骤：

1)分别配制3-6μg/mL质量浓度的经表面改性的聚苯乙烯供体微球溶液和经表面改性的聚苯乙烯受体微球溶液；分别配制物质的量浓度为1-3nM的玉米赤霉醇类抗原溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液；将待检测的乳制品制成悬浮液；

2)按照1:1-1:3的体积比取由步骤1)得到的经表面改性的聚苯乙烯供体微球溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液并充分混合，得到混合溶液a；

3)按照1:1-1:3的体积比取由步骤1)得到的经表面改性的受体微球溶液和玉米赤霉醇类抗原溶液并充分混合，得到混合溶液b；

4)将由步骤2)和步骤3)得到的混合溶液a和混合溶液b于恒温孵化器中避光反应；

5)按照体积比为1:1的配比将经过步骤4)后得到的混合溶液a和混合溶液b与乳制品悬浮液充分混合，得到混合溶液c；

6)将由步骤5)得到的混合溶液c于恒温孵化器中避光反应；

7)选择频率不大于30kHz、功率不大于600W的聚焦超声辐射场，对经步骤6)后得到的混合溶液c和进行非接触式处理n，得到消除了非特异性结合的特异性夹心结合体溶液e；

8)通过微流控系统使由步骤7)得到的溶液e进入所选用的微流控芯片，并由其中的不小于500nm的小孔捕获样品中的特异性夹心结合体；

9)用波长不超过680nm的激光照射微流控芯片，用单光子检测器记录微流控芯片小孔位置发出的光信号，得到可视化图像检测结果；

10)根据检测结果图像中有无发光信号判断样品中是否含有玉米赤霉醇类。

本发明针对牛奶中玉米赤霉醇类物质的检测，与现有技术相比具有以下优点：

(1)检测速度快：本方法基于发光氧通道均相免疫识别技术，可迅速标记目标分子并实现后续检测，其单样检测周期控制在20分钟以内。若借助96孔板或384孔板，则最高可以实现1152样品/小时的检测通量。与现有技术相比，检测效率提升数千倍。

(2)假阳性概率极低：本方法采用低强度聚焦超声辐射场对免疫标记体系进行非接触式干预，通过精准控制超声辐射场的强度，既能破坏体系中的非特异性吸附又不对特异性结合造成影响，最大限度地降低了检测结果出现假阳性的概率。

(3)检测灵敏度高：在破坏非特异性结合的基础上，本方法通过微流控芯片对特异性夹心结合体进行单个捕捉，再经激发点亮过程，单个桥连结构的纳米微球对即可产生10⁴～10⁵光子，进而可以方便地采用单光子检测器或高灵敏CCD进行单分子级浓度的计数检测，具备极限灵敏度。

附图说明

图1是本发明提供的免疫发光单分子可视化检测流程示意图。

图2是本发明提供的发光氧通道免疫分析原理示意图。

图3的A和B分别是实施例1中含α-玉米赤霉醇为1ppt的牛奶样品和空白对照牛奶样品的检测结果对比图是实施例1中含α-玉米赤霉醇为1ppt的牛奶样品和空白对照牛奶样品的检测结果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

图1示出了本发明提供的免疫发光单分子可视化检测流程示意图。详述如下：

(1)标记目标分析物：采用发光氧通道免疫分析技术，通过基于均相免疫原理的双抗夹心特异性结合对目标分析物进行标记。当体系中存在目标分析物时，分别填充有光敏剂与化学发光剂的供体微球和受体微球因与目标分析物发生特异性结合而相互靠近，形成桥连结构的特异性夹心结合体，其桥连结构距离不超过200nm。当供体微球和受体微球通过桥连而距离小于200nm时，后续的激发发光过程才能正常进行。具体操作过程需取一定量的适合浓度的抗体和供体微球、抗原和受体微球分别混和后，在恒温孵化器中经过一段时间的反应，再与一定量的待测样品混合并再次于恒温孵化器中反应一段时间，完成对目标分子的标记，促使供体微球及受体微球完成桥连结构的形成。

(2)消除非特异性结合干扰：在发光氧通道免疫分析中，非特异性结合影响其检测灵敏度及假阳性率，本方法在精确测量特异性结合与非特异性吸附两种结合方式作用力差别的基础上，发现特异性结合作用力一般为150pN，而非特异性吸附作用力往往小于50pN，因此可以通过精确力学调控的方式消除非特异性结合的干扰，不仅显著提升本方法的检测灵敏度并有效降低检测结果的假阳性率。本方法采用超声波作为动力源，通过低强度聚焦超声辐射场对免疫标记体系进行非接触式干预，通过选择合适的超声辐射力的强度和作用时间，破坏体系中的非特异性吸附而不影响特异性结合，以有效避免非特异性吸附对最终检测过程的干扰。

在实际操作过程中，为了获取低强度聚焦超声辐射场的最佳实施参数，对体系进行如下规范：设微粒为各向同性材料，其受力产生的形变各向均匀；所处环境为连续的、没有粘性的理想介质；并且整个受力过程绝热。超声波场为平面驻波场，纳米颗粒为刚性颗粒，则所受的声辐射力F可通过公式(1)计算：

$F=-\frac{3}{2}{\mathrm{kV}}_{p}sin2kx\·G({\mathrm{\ρ}}_f/{\mathrm{\ρ}}_p)\·E---\left(1\right)$

其中k为渗透系数，x为微粒到声场驻点的距离，V和ρ为体积和密度，下标f和p分别表示液体和微粒，G为颗粒和液体的声对比因数，E为时均声能密度，A为超声波压振幅。

(3)捕捉特异性夹心结合体：通过微流控系统，使经超声辐射场作用后的免疫反应体系以连续流动状态进入微流控芯片的微米级通道，并由上百万个具有纳米尺寸级小孔捕获其中的特异性夹心结合体。

(4)点亮并记录目标分析物：用特定波长的激光照射微流控芯片，供体微球上的光敏剂将被激发产生单体氧，单体氧扩散至特异性结合体另一端的受体微球上，并与受体微球上的化学发光剂发生反应，从而产生另一种波长的光信号，如图2所示。用单光子检测器用单光子检测器记录受体微球发出的光信号，利用显微成像技术以图像形式读出目标分子，由此实现可视化单分子检测。

实施例1

以牛奶中α-玉米赤霉醇(α-ZAA)的检测为例，具体步骤如下：

1)配制质量浓度为3μg/mL的经表面改性的聚苯乙烯供体微球溶液和质量浓度为5μg/mL的经表面改性的聚苯乙烯受体微球溶液、物质的量浓度为2nM的α-ZAA抗原溶液和物质的量浓度为2nM的α-ZAA抗体溶液及含α-玉米赤霉醇为1ppt的牛奶样品和空白对照牛奶样品；

2)按照1:1的体积比取由步骤1)得到的供体微球溶液和α-ZAA抗体溶液各22μL并充分混合，得到混合溶液a；

3)按照1:1的体积比取由步骤1)得到的受体微球溶液和α-ZAA抗原溶液各22μL并充分混合，得到混合溶液b；

4)将由步骤2)和步骤3)得到的混合溶液a和混合溶液b于恒温孵化器中避光反应10min；

5)取体积比为1:1的经步骤4)后得到的混合溶液a和混合溶液b各20μL及浓度为1ppt的待测牛奶样品10μL，将三者充分混合，得到混合溶液c；

6)取体积比为1:1的经步骤4)后得到的混合溶液a和混合溶液b各20μL与10μL空白对照牛奶样品充分混合，得到混合溶液d；

7)将由步骤5)步骤6)得到的混合溶液c和混合溶液d于恒温孵化器中避光反应5min；

8)选择频率为30kHz、功率为600W的聚焦超声辐射场，对经步骤7)后得到的混合溶液c和混合溶液d分别进行非接触式处理，持续5min，得到消除了非特异性结合的特异性夹心结合体溶液e和空白对照溶液f；

9)通过微流控系统使由步骤8)得到的溶液e和空白对照溶液f分别进入所选用的微流控芯片，并由其中的孔径约为500nm的小孔捕获样品中的特异性夹心结合体；

10)用波长为650nm的激光照射步骤9)中描述的微流控芯片，用单光子检测器记录微流控芯片小孔位置发出的光信号，得到可视化图像检测结果，如图3所示。

11)根据检测结果图像中有无发光信号判断样品中是否含有α-玉米赤霉醇。

Claims (1)

1.一种乳制品中玉米赤霉醇类的可视化单分子检测方法，包括下列步骤：

1)分别配制3-6μg/mL质量浓度的经表面改性的聚苯乙烯供体微球溶液和经表面改性的聚苯乙烯受体微球溶液；分别配制物质的量浓度为1-3nM的玉米赤霉醇类抗原溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液；将待检测的乳制品制成悬浮液；

2)按照1:1-1:3的体积比取由步骤1)得到的经表面改性的聚苯乙烯供体微球溶液和玉米赤霉醇类抗体溶液并充分混合，得到混合溶液a；

3)按照1:1-1:3的体积比取由步骤1)得到的经表面改性的受体微球溶液和玉米赤霉醇类抗原溶液并充分混合，得到混合溶液b；

4)将由步骤2)和步骤3)得到的混合溶液a和混合溶液b于恒温孵化器中避光反应；

5)按照体积比为1:1的配比将经过步骤4)后得到的混合溶液a和混合溶液b与乳制品悬浮液充分混合，得到混合溶液c；

6)将由步骤5)得到的混合溶液c于恒温孵化器中避光反应；

7)选择频率不大于30kHz、功率不大于600W的聚焦超声辐射场，对经步骤6)后得到的混合溶液c和进行非接触式处理n，得到消除了非特异性结合的特异性夹心结合体溶液e；

8)通过微流控系统使由步骤7)得到的溶液e进入所选用的微流控芯片，并由其中的不小于500nm的小孔捕获样品中的特异性夹心结合体；

9)用波长不超过680nm的激光照射微流控芯片，用单光子检测器记录微流控芯片小孔位置发出的光信号，得到可视化图像检测结果；

10)根据检测结果图像中有无发光信号判断样品中是否含有玉米赤霉醇类。