JPS628055A - 酵素免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛〔産業上の利用分野〕 本発明はシリカゲル薄層プレートを用 いた酵素免疫測定方法に関するもので、主として臨床的
診断の場面において特異抗体の検出、血液型の判定、レ
アギンの検出等に役立てるものである。

〔従来技術とその問題点〕

従来より、臨床的診断のための検査法として、生体内の
抗原又は抗体を測定する方法は、各種の免疫学的な方法
が開発されている。そのうち、特に酵素免疫測定法はあ
る程度感度が高く、また特殊な機器も必要としないため
、次第に普及しつつある。

酵素免疫測定法には、大きく分けて、二つの方法がある
。それは、均一系反応と不均一系反応とである。しかし
、両者には一長一短がある。均一系は、結合−不結合型
分離を行なわずにすむため、操作が簡単で自動分析に適
用しやすいが、非特異的反応を伴いがちである。不均一
系では、結合−不結合型分離を要するが、特異性は高い
。

不均一系反応で近年、繁用されている固相法には抗原又
は抗体を担体に固定させる手段として、主として次のよ
うな方法が用いられている。

■　化学的固定法 セルロース、硝子等の担体に抗原又は抗体を化学結合に
よって、固定する方法。

■　物理的固定法 疎水性ノマイクロプレート、もしくはビーズ、セルロー
ス誘導体等に抗原又は抗体を疎水結合等の吸着によって
、固定する方法。

■の方法は化学反応により固定させるため、好適に結合
すれば変性せずに安定するが、そのように変性しない被
測定物質が限られているという欠点がある。一方、■の
方法は化学的反応を用いないため、容易に抗原又は抗体
を担体に結合できる等の利点を有す。

例エバニトロセルロース膜に抗原をスポットし、これに
被検溶液の希釈液を反応させた後、ペルオキシダーゼ標
識二次抗体を用いて抗原のスポット位置を染色すること
により、被検用液の抗体を検出する方法である。〔ＲＨ
ａｗｋｅｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１９，１４２．１９８２．）。

しかし、この■の方法で常用されているＥＬＩＳＡ法で
は、多量の抗原又は抗体を測定のために要するほか、被
測定物質によっては盲検査が高く、必要な検出限界を得
られないことが起こる。

このような欠点を考慮して、担体として強い吸着性をも
ち、親水性であるシリカゲルのプレートを用いる吸着法
が近年、開発されでいる。

その方法は、シリカゲルは塩・糖・脂質・蛋白質等を良
く吸着するが、塩・糖は水溶性が大きいので水溶液中で
、溶解力が吸着力より大きくなり、溶解するという性質
を利用するものである。シリカゲルの吸着部位（シラノ
ール基の−ＯＨの部分）に抗原又は抗体を吸着させ、そ
ンツ の後、余ったーＯＨをフルブミツ）ゲラチン等応を防ぎ
、特異的に抗原−抗体反応をさせることがＲＩＡ法やイ
ムノステイニングで行なわれている。

シリカゲルを担体として用いる利点は、シリカゲルの強
い吸着力により■架橋剤を必要としないＯ反応に関与し
ないものは水で洗い流すことができるθ反応生成物が吸
着され、脱離しないことにある。現在のところ、シリカ
ゲルを用いる方法で最も進歩したものは、Ｊｏｈｎ、Ｌ
、Ｍａｇｎａｎｉ　ノ報告［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　５ｔｒｙ、１０９．３９９．１９８
０１にみられるシリカゲル薄層プレートを用いて展開し
たＧにガングリオシドを１２５Ｉ標識コレラトキシンと
反応させ、オートグラフィーにより検出する方法及び、
東・加藤らの報告〔生化学、５７，１３５．１９８５及
びＪｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＹ
、９５，１５１７．１９８４）にみられるシリカゲル薄
層プレートを用いてＨ−Ｄ抗原ガングリオシドをクロマ
トグラフィーにより展開谷離した後、酵素抗体法により
染色し、抗原の展開位置の確認、検出する方法である。

しかしながら、１２５Ｉを標識物質に用いるＲＩＡ法は
安全性・取り扱いの面で問題があり、クロマトグラフィ
ーを用いて展開分離する方法は、展開時間とその後の有
機溶媒を除くための乾燥時間とが長くかかり、迅速な方
法ではない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、上記従来の欠点を解消すべく鋭意研究を重ね
た結果、クロマトグラフィーによる展開分離を必要とし
ない迅速で簡便かつ正確なシリカゲル薄層プレートを用
いた酵素免疫測定方を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、生体内の測定物質に対する抗原又は抗体を予
め吸着させたシリカゲル薄層プレートに測定物質を反応
させ、次いで測定物質に対する抗原又は抗体に対しての
酵素で標識した第２次の抗原又は抗体を反応させること
により、測定物質を染色することを特徴とする酵素免疫
測定方法である。染色による結果の判定は、定性的には
肉眼で行ない、定量的にはデンシトメータ１画像処理機
等によって行なう。

本発明は、例えば測定物質が抗体の場合には、シリカゲ
ル薄層板に抗原をスポットし、これを適当に希釈したヒ
ト血清と反応させ、次に酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反
応させた後、酵素反応により薄層板上で抗原染色するこ
とになる。

以下、本発明の構成要素をそれぞれ説明する。

本発明に用いる担体は、薄層クロマトグラフィー用のシ
リカゲルプレートを適当な大きさに切断したもの、或い
は薄層用シリカゲルに適当な固着剤を混合し、適当な大
きさのガラス板又はプラスチック板などにコートし、乾
燥したものが好適である。また、一般の親水性のシリカ
ゲルの代わりに疎水性にしたシリカゲル、例えばオクチ
ルクオクタドデシル等のアルキル鎖をシリカゲルに化学
結合したものを用いて、測定物質の親水・疎水の両性を
も、つものを検出することも可能である。

本発明に用いる標識酵素は、ベルオキシダーセラβ−ガ
ラクトシダーゼ２アルカリフオスフアターゼ２グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ等
、従来より標識酵素として常用されているものを適用で
きるが、特にペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、４−ｊマロー１−ナフトールン
３・３′−ジアミノペンチジンシ３・３′・ノ　　　ｊ
−−％　　０ ５・５−？）フメチルペンチジンーーートリジｂ・・。

７　Ｌ　３−　メチル−２−ペンゾチアゾリノンセトラ
ゾン等従来、公知のものを用いる。また、βク ーガラクトシダーゼでは５−ブロモ−４−＃ロー−３−
インドリルーβ−Ｄ−ガラクトシド−アルカリフォスフ
ァターゼではＰ−ニトロ−ブルーテトロゾリウム、グル
コースオキシダーゼではファーストレッドＴＲ又はファ
ーストブルーＢＢ等を基質に用いる。測定物質としては
、ＮＧＮＡ−ＧＭ、（ＮｅｕＧｃ＝ｔ２−３Ｇａｌβ１
−４Ｇｌｃβ１−＋ＩＣｅｒ）、ＮＧＮＡ−ＧＭ２（Ｇ
ａｌＮＡｃβ１−＋４（ＮｅｕＧｃ　ａ２−＋３　）　
Ｇａ　ｌβ１→４Ｇｌｃβｌ−＋Ｉ　Ｃｅ　ｒ　）、４
−Ｏ−７−ｔ＝＋ｚ＋ＮＧＮＡ−ＧＭ３　（４−０−Ａ
ｃ　ｅ　ｔ　Ｙ　１−Ｎｅ　ｕＧｃ　α２−＋３Ｇａ　
ｌ　Ｉ　１→４Ｇ　ｌ　ｃ　Ｉ　１−＋ＩＣｅ　ｒ　）
等のＨ−り抗原ガングリオシド等の酸性糖脂質、ＧＡｌ
（Ｇａ　ｌ　β１−＋３Ｇａ　１ＮＡｃβ１−４Ｇａｌ
β１→４Ｇ１ｃβ１→ＩＣｅｒ）、Ｇａ主（ＧａｌＮＡ
ｃβ１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｌＣβ１−＋ＩＣｅｒ）
、パラグロボシド（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ１１−
＋３Ｇａ１β１−＋４Ｇｌｃβ１−＋ＩＣｅｒＹｙｔル
中性糖脂質及びイムノグロブリンのＩｇＣ，＝−ＩｇＭ
等の蛋白質等、シリカゲルに吸着して抗原性を失わない
物質なら、どのようなものでも測定可能である。

するために、アルブミン宥ゲラチン等の常用される蛋白
質で保護する。

抗体の酵素標識法は、Ａｙ　ｒ　ａｍｅ　ａ　ｓにより
開発されたグルタルアルデヒド架橋法Ｎａｋａｎｅらに
よって開発された過ヨーソ酸架橋法、加藤らにより開発
されたマレイミド架橋法等、その他インシアネート架橋
法、ベンゾキノン架橋法等、従来の技術により調製でき
る。

〔作用〕

本発明により、シリカゲルに吸着して抗原性を失わない
抗原ならば、どのようなものでも複数の被測定物質を同
一条件下で迅速、かつ正確な特異的反応により、同時測
定することが可能になる。

また、従来法と比べて少量の抗原を用いて、被測定物質
を測定することが可能となる。例えば、本発明法による
糖脂質の測定では、抗原が２０　ｐｍｏ　ｌあれば十分
なのに対し、ＥＬＩＳＡ法ではｌｎｍｏ１以上を必要と
する。そして、ＥＬＩＳＡ法で問題となるバックグラウ
ンドも、本法は目視により確認でき、スポットの確認可
能な程度であれば、測定可能である。

もちろん、本法ではＲＩＡ法のように放射性物質を使用
しないため、安全性も高く、糖脂質などの安定な抗原又
は抗体はシリカゲルプレートに吸着させたまま保存でき
るので、迅速な測定法として実用的である。

更に本発明により、一般のクロマトグラフィーでは容易
に展開できないような、抗原又は抗体も簡便に検出でき
るようになる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
によって何ら限定されるものではない。

実施例■ 抗精脂質抗体の測定 １、試薬 ■　抗原液の調整 糖脂質抗原１０ｎｍｏｌｅを元素分析用試験管に取り、
これにコレステロール１０ｍｇ／ｍｌレシチン２ｍｇ／
ｍｌのエタノール溶液１０μｌを加え溶解し、た後、水
４０μｌを加えて超音波水浴でリポゾームを作り、水５
０μｌを加えて抗原液とする。

■　薄層板の調製 ポリグラムシリカゲル２０　ｃｍｘ　２０　ｃｍ　（Ｍ
ａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ　　Ａ＃ｔ−Ｎｒ、８０５
０１３）をクロロホルム−メタノール−２，５Ｎアンモ
ニア水溶液（６０：３５：８）で展開し風乾後、上３ｃ
ｍ、下１ｃｍ、左右１ｃｍは切り捨でて、残りの部分で
１ｃｍ角の薄層板を調製する。スポットは１μＩのマイ
クロシリンジを用いて、０．２μｍずっ抗原液をスポッ
トする。

■　Ａ−溶液 １％ニワトリ卵白アルブミン１％ポリビニルピロリドン
０．０２％、アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液。

■　Ｂ−溶液 ３％ポリビニルピロリドンを含むＰＢＳｉ液。

■　洗浄液 ０．１％ツイーンを含むＰＢＳ溶液。

■　基質溶液 ０．２ｍｏｌｅ／＠化ナトリウム全ナトリウムｍｏ　ｌ
ｅ／ｌ）　！Ｊ　スー塩酸緩衝液５ｍｌ＜ｐＨ７，４）
に４−クロロ−１−ナフトール３ｍｇ／ｍｌメタノール
溶液１ｍｌ及び３０％過酸化水素１５μＩを加えて調製
し、基質溶液とする。

■　ペルオキシダーゼ抗−ヒ）ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅ１社
製） ■　操作法 抗原をスポットした薄層板を、Ａ−溶液に３７°Ｃで数
時間、液が充分浸透するまで浸す。　次いで、この薄層
板を２４穴プレート中Ａ−溶液で２１倍から倍々希釈し
た試料血清２００μｌに浸し、２８℃で２時間振とうす
る。その後、洗浄液で２゛回、ＰＢＳで３回洗浄した後
、Ａ−溶液を各穴に入れ、２８℃で１５分間振とうする
。続いて、ペルオキシダーゼ抗ヒトＩｇＧをＢ−溶液で
１０００倍希釈したものを各穴に入れ、２８℃で２時間
振とうする。その後、ＰＢＳで５回洗浄して。

これに基質溶液２００μｌを各穴に入れて、３７℃で１
５分間反応させた後、水で洗浄して、乾燥させる。

■結果 上記の操作に基づいて得られた薄層板上のスポットを観
察し、目で確認できる最高希釈倍数を力価とし、これを
第１〜４表に示す。

なお、表中健常者１は２０才前後の女性、健常者２は一
般成人、癌患者１は手術後、癌患者２は手術前の試料血
清である。

二ＸＴ−う石（へ 第１表 第汰表 第含表 第４表 実施例２ 蛋白抗体の測定 ■　試薬 ヒトＩｇＧ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリ血清（いずれも
Ｃａｐｐｅｌ　　社製）及びヒト血清を抗原とし、ペル
オキシダーゼ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅ１社カタログＮ
ｏ、３２０１−００８１１ｏｔＮｏ、２０６５０）を測
定試料とし、その他の試薬は実施例１と同様。

■　操作法 ２４穴プレート中、各抗原（蛋白量として５　ｍｇ／ｍ
　１をスポットしたプレートを、Ａ−溶液に３７℃で数
時間、液が充分浸透するまで浸す。次いで、試料として
のペルオキシダーゼ抗ヒト１ｇＧをＢ−溶液、で１００
倍希釈から倍々希釈した溶液に浸す。その後、ＰＢＳで
５回洗浄して、これに基質溶液２００μｌを各穴に入れ
て、３７℃で１５分間反応させた後、水で洗浄して乾燥
させる。

■結果 上記の操作に基づいて得られた薄層板上のスポットを観
察し、目で確認できる希釈倍数を力価として第５表に示
す。なお、表中のスポット立置１はヒトＩｇＧ１２はヒ
ト血清、３はニワトリＩｇＧ、４はニワトリ血清である
。

；χＴ令色 明　　　　　細　　　　　書 手続補正ｆ（自発） 昭和６１年Ｑ月！２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 生体内の測定物質に対する抗原を予め、 吸着させたシリカゲル薄層プレートに測定 物質を反応させ、次いで測定物質に対する 抗体に対しての酵素で標識した第２次の抗 原又は抗体を反応させることにより、測定 物質を染色することを特徴とする酵素免疫 測定方法。