JPH032662A - 免疫測定システム、免疫測定方法、洗浄溶液試薬および酵素基質有機化学コンパウンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、慨して、分析物の検出のための測定（アッセ
イ）システムおよび方法に関し、特に免疫測定に適用で
きる。

〔従来の技術〕

抗原−抗体検出を行うある種の免疫測定法の実施におい
ては、血清中に存在する基質が誤った解釈を生じさせる
ことがしばしばある。特に、試料段階および（または）
接合体段階が例えば１段階当り１５分未満というような
短時間のうちに行われなければならない場合、背景干渉
および（または）低感度が問題であることが分った。こ
のようなことは、本出願人の特開昭６４−６１６６４号
［固相酵素免疫測定法システムおよび処理方法」および
特開平１−２２３３５２号「固相酵素免疫測定システム
および方法」において気づかれている。これらの抗体検
出方法のそれぞれは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）と類似しており、それぞれ約５分内に行われる反
応物インキュベーション段階を有している。

前記両出願は、該出願において引用された文献等と同様
にインキュベーション段階間において蒸溜水または０．
ＩＭ　　ＮａＣ１の薄い埋沈浄液による洗浄を予定して
いる。本発明より前は、広範囲に及ぶ調査の結果、抗原
−抗体反応に対する理想的な結合親和性は約０．１５Ｍ
の等張性濃度にあると考えられていたので、高イオン強
度溶液は免疫化学的測定では使用できないと思われてい
た。

さらに、免疫化学的染色システムにおけるように、やや
高いイオン強度の溶液が抗体試薬において使用されてい
たが、その場合、測定法の感度が減少していた。また、
試料段階および接合体段階の後、浄化のために高塩濃度
を使用すると、膜を使用するとき、許容できない背景干
渉を生じさせることが観察された。また、免疫蛍光検査
（ＩＦＡ）技術において、高塩洗浄液が背景干渉を招く
ことなしに使用できることが観察された。本方法まで、
試料段階および接合体段階の後、同一の洗浄試薬を使用
することは、免疫化学測定法における技術の常態であり
、したがって測定システム内で２つの異なった浄化溶液
を使用することは以前は研究されなかった。

高イオン強度溶液が以前の免疫測定システムの洗浄段階
において採用されていなかったことは、インキュベーシ
ョン間におけるタップ水ゆすぎを教示しているマークス
の米国特許節４，７７４゜１７７号、ＴＢＳ溶液による
洗浄を教示しているゴートンの英国特許出願第２，０９
９，５７８Ａ号、および洗浄段階に蒸溜水を使用する前
記特開昭６４−６１６６４号に示されている。前記特開
平１−２２３３５２号に示されているように、低イオン
溶液が洗浄溶液としてこれまで使用されて来ているが、
この低イオン溶液は好ましくは０゜１Ｍ以下のＮａＣ１
溶液であった。したがって、本発明以前は、高イオン濃
度を有する溶液は洗浄溶液として使用されておらず、し
たがって本発明が予期しない結果を得たことは明らかで
ある。本発明は、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の洗
浄段階、伝統的な間接蛍光測定実施の洗浄段階、および
抗エプスタインーバーウィルス・ウィルスキャブジッド
抗原、エプスタイン−バーウィルス核抗原、ＩｇＧ抗Ｃ
ＭＶおよびＩｇＭ抗サイトメガロウィルスを含む幾つか
の抗原に対する抗体の存在を検出する抗補体免疫蛍光測
定（ＡＣＩＦ）の洗浄段階において実施するに適するこ
とが分った。

また、後述するように、ウェスタンプロットの測定とＥ
ＬＩＳＡタイプの測定との間の類似性から、ウェスタン
プロット・タイプの測定の洗浄段階に対しても、高イオ
ン強度溶液の使用が望ましいと信じられる。

洗浄溶液に対する高イオン濃度を使用するのに加えて、
本発明はさらに、錠剤化された形に配合されており、酵
素基質反応物として使用する際、再構成される反応性物
質を使用する。前記特開平１−２２３３５２号は、適当
に乾燥され、混合され、かつ混合、モールデイグおよび
スタンピングを含む標準的な錠剤化手順により錠剤化さ
れる吸収物質の錠剤化を教示している。各タブレットは
適当な希釈液で使用の際に再構成される。本システムは
、その改良であり、貯蔵寿命が長く、容易に再構成でき
る酵素基質反応物を用意することに向けられている。

〔発明の要約〕 改良された免疫測定システムにおける本発明の主な目的
は、背景干渉を減少するシステムを提供することである
。

本発明の他の目的は、改良された測定システムの感度を
増大することである。

本発明の他の目的は、試料中の抗体の存在を迅速に検出
する免疫測定システムを提供することである。

本発明の他の目的は、免疫測定システムにおいて使用す
るためのものであって、試料段階の後、試験ストリップ
を洗浄し、背景干渉を制限し、かつ（または）抗原−抗
体反応の感度を改善する高イオン強度溶液を提供するこ
とである。

本発明のさらに他の目的は、測定手順において使用する
ための、錠剤化または乾燥パッケージされた形の安定な
酵素基質反応物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、免疫測定システムを実施す
る際に使用するための、背景干渉を減少する洗浄溶液と
して、高イオン強度溶液を提供することである。

本発明は免疫測定システムにおいて使用するためのもの
で、その使用が酵素結合免疫測定法において説明される
。この方法は、単一の試料中の単一または複数の異なっ
た抗体の存在を検出するために実施することができる。

本発明を取り入れた前記免疫測定方法は、本質的に酵素
結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）と類似している。この
方法は、好ましくは、精製された抗原の列がその上にド
ツト・プロットされ、乾かされる膜を保持する剛な支持
体を使用する。ここに述べられる方法は、錠剤化または
乾燥パッケージされた試料希釈剤を容器で再構成するこ
とを含み、この容器で、凝固剤を含むかまたは含まない
血漿、血清または全血のいずれかの一滴または数滴が混
合され、前記膜な支持体に保持された膜がその中で約４
分間インキュベートされる。このインキュベーションに
おいて、試料中に存在する特異抗体は膜上の特異抗原の
ドツトに結合する。この試料段階の後、スティック支持
体は希釈剤と試料との混合物を除去するためにゆすがれ
、膜は洗浄される。この洗浄は、０．２５Ｍから飽和度
までの高イオン強度溶液を収容した容器内で行われ、前
記膜は約４分間その中に漬けられる。この高イオン強度
溶液は、干渉を除去するために、試料中および周囲の干
渉物質を除去する。前記洗浄段階に続いて、スティック
支持体上の膜は、好ましくはアルカリホスファターゼ接
合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンのような非干渉蛋白質から
なる接合体溶液を収容した容器内でインキュベートされ
る。前記接合体溶液は、好ましくは錠剤化状態から再構
成されるが、防水容器に乾燥状態でパッケージされても
よく、前記インキュベーションは約４分間行われる。前
記スティック支持体は再び洗浄されるが、好ましくは、
低イオン強度溶液または水で洗浄され、その中に約４分
間漬けられる。

前記試料段階と接合体段階との間の洗浄に続いて、前記
堅固な支持体および膜は本発明の酵素基質反応物を収容
した容器内で約４分間インキュベートされる。前記酵素
基質反応物は、アルカリホスファターゼを採用するどん
な測定システムにも好適である。前記方法は、ウェスタ
ン・プロット・システムまたは一般的な化学方法にもま
た有用である。

前記酵素段階に続いて、膜付きのスティック支持体はゆ
すがれ、乾燥され、読み取られる。この読み取りにおい
て、抗原のドツトの青みを帯びたスミレ色の発色は、試
料中に前記抗原に結合する抗体が存在することを示す。

前記読み取りは、高イオン溶液による洗浄が背景干渉を
除去すること、および（または）感度を改善することに
よって容易にされ、それによって各ドツトに対する発色
が強められる。好ましくは、この方法は、約４５℃の一
定の温度で行われる。

改良された免疫測定システムにおける本発明のこれらの
目的および特徴並びに他の目的および特徴は、添付の図
面に関連して本発明が詳細に述べられる次の説明からよ
り充分に明らかになろう。

〔詳細説明〕

方法 本発明は、試料希釈液中の抗原および（または）抗体の
存在を検出する免疫測定システムにおいて実施するため
のものである。本発明を説明するためにここで説明され
る方法は、抗体の存在を検出するために使用される酵素
結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）として知られている
方法に似ている。本発明は、以下に、ヒト血清試料中の
特異抗体の検出に対するＥＬ　Ｉ　ＳＡタイプの測定の
応用に関し説明され、少なくとも１つの抗原のドツトを
膜に結合する段階を含む。前記膜は、好ましくはニトロ
セルロースであり、順次行われるインキュベーションの
ために構成された剛な支持体に装着される。この装置を
、以後、測定ストリップと呼ぶ。抗原の点を付けた後、
膜の残りの部分を無反応にする材料からなる遮断溶液に
測定ストリップが漬けられる。この場合、前記遮断試薬
は、好ましくは水に１０％の脱脂粉乳のものである。乾
燥の後、測定は前記測定ストリップで行われる。

この場合、測定は、最初に血清またはヘパリン化全血の
いずれかを試料希釈液に加え、測定ストリップをその中
でインキュベートし、次に、測定ストリップを高イオン
強度反応物で洗浄し、次に、測定ストリップを酵素接合
抗免疫グロブリン反応物の中でインキュベートし、次に
、測定ストリップを低イオン強度洗浄溶液で洗浄し、最
後に酵素基質反応物の中で測定ストリップをインキュベ
ートすることにより行われる。幾つかの測定は室温で行
うことができるが、この測定は４５℃で行われた。間に
低イオン強度洗浄溶液でのゆすぎを行われる各インキュ
ベーションは、４分間行われた。

試料段階と接合段階との間で高イオン強度溶液を使用す
ると、干渉が減少し、酵素基質インキュベーション段階
の後の抗原の点上の色の現出が、結合された抗体の量に
関係することが保証される。

洗浄段階理論 高イオン強度洗浄剤使用の基本的な概念は、溶液のイオ
ン強度が増加するとき、物質（この場合、血清中の物質
）は解離され得るということである。

抗原−抗体相互作用は高親和性結合であるため、免疫ｎ
］定法において、高イオン強度洗浄剤は、より小さい親
和性で結合している物質を除去するために使用できよう
。これらの干渉物質は２つの一般的な形で生じる。

第一に、物質は測定されるべき抗体に結合し得る。もし
この物質が大きくて、複合していれば、その後の接合体
による検出は立体的に妨げられる。

大きな複合蛋白質である補体蛋白質（ＣＩ　Ｑ）は、血
清中の抗体に低親和性にて結合することは知られている
。約０．５Ｍイオン強度の溶液は、この蛋白質のほとん
どを検出すべき抗体から除去する。

この除去によって、より多くの、接合体に対する結合部
が露出され、感度が著しく高められる。感度増大の原因
は推測できるだけであるが、高イオン強度溶液が感度を
高めることは決定的に実証された。また、前記感度増大
は、高イオン強度洗浄剤の使用のみによって得られる背
景干渉の減少から予想される増加より著しく大きいこと
が実証された。

第二に、物質は測定されるべき抗体以外のものに結合し
得る。この結合は、点付けされたドツト領域外またはド
ツト領域内においてニトロセルロース膜になされたり、
特異的または非特異的なメカニズムを介して抗原になさ
れたりし得る。これらの望ましくない物質を除去するた
めに、高イオン強度の洗浄剤が使用された。試料段階と
酵素インキュベーション段階との間のこのような洗浄の
後では、背景干渉は低下しており、望ましくない背景物
質は所望の抗原−抗体相互作用の結合親和性より著しく
低い結合親和性を示すことが分った。

この場合、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）抗原が両方
の効果を示す。１つまたはそれ以上のＣＭＶ抗原がそれ
ぞれ抗体に結合することはよく知られている。ＣＭＶに
対し特異的に向けられた抗体の高親和性の結合と異なり
、抗体に対する該ウィルスの蛋白質の性向はより小さい
結合親和性を示す。したがって、高イオン強度の洗浄溶
液を選択的に使用することにより、非特異的結合をした
抗体を除去することが可能である。加うるに、血清が個
体から除去されるとき、補体の第一の成分が血清中の抗
体に付着する。この補体蛋白質は複合体で、立体的干渉
をはっきりと示す。それ故、ＣＭＶの場合、試料段階の
後、約０．５Ｍの洗浄溶液か使用されたとき、著しい感
度の上昇および特異性の減少が観察された。観察された
変化の程度は、一つの効果だけのせいにすることはでき
ず、したがって、高イオン強度洗浄は背景干渉を減少す
るとともに感度を高めることを実証する。

実地 前記好ましいＥＬＩＳＡに似た方法を実施するため、第
１図に示されるように、本発明は、次々と行われる反応
物内におけるインキュベーションのためにスティック支
持体１０を使用する。このスティック支持体１０は、支
持体１１を含み、この支持体１１は膜１２をしっかりと
支持するプラスチックまたは同様の不活性の材料とする
ことができる。前記膜１２は好ましくはニトロセルロー
スであって、支持体１１に固定される。前記支持体１１
および結合された膜１２は、薄く狭い長方形の片であり
、第２図に示されるように反応物容器１，２，３．４お
よび５に順次漬けるために、その一端部１１ａにおいて
オペレータに把持されるようになっている。膜１２をあ
られすために、窓ないしは穴１３が支持体１１に間隔を
置いて形成されている。約１マイクロリツトルの少量の
抗原標本１４の各々が、窓ないしは穴１３内の大略中心
に位置するように膜１２に点付け（イムノドツト）され
る。好ましくは、各抗原のドツト１４の周囲の膜の表面
は、第１図において中心に穴を明けられた円板１５とし
て示されるように、遮断される。膜の遮断は、非干渉蛋
白質または同様の化合物で抗原ドツトの周囲ニトロセル
ロースの表面を覆うように行われる。この遮断は、抗原
のドツト１４が次々と試薬インキュベーションを受ける
ときに、各抗原のドツト１４の周囲の膜の表面に免疫化
学化合物が非特異的に結合するのを制限または阻止する
ためになされる。前記膜の遮断は、抗原ドツト１４に対
する影響を最小限とするようなものでなければならず、
ニトロセルロースのような大抵の膜が広範囲の材料の非
特異的吸収に対し示す高親和性を制限するように実施さ
れる。本発明においては、この膜の遮断を行うために、
スティック支持体１０の下端部１１ｂは、好ましくは水
に１０％の脱脂乳を含む溶液に周囲温度にて約４５分間
浸される。しかしながら、アルブミン、カゼイン、ゼラ
チン、洗剤、富アミノ化合物等の溶液を含む他の膜遮断
溶液も使用できる。また、膜が遮断剤にさらされる時間
および温度は、使用される膜および許容できる感度ない
しは干渉の所望レベルによって変わる。さらに、低レベ
ルの感度が許容できる場合は、遮断は完全に省略できる
。

また、選択された高イオン強度洗浄溶液を使用すると、
ＥＬ　Ｉ　ＳＡタイプの方法を含む多くの免疫測定方法
に対し背景干渉を制限できるので、このような方法のあ
るものに対しては遮断は必要でない。

膜の遮断の後、スティック支持体１０は、好ましくは蒸
溜水でさっとゆすがれ、周囲温度で空気乾燥される。特
定の試験構成に対してより高レベルの感度が必要とされ
る場合、緩衝溶液または洗剤を含有する溶液のような他
のゆすぎ液を使用することもでき、プロセスを速めたり
、遅くしたりするために、周囲温度以外の温度を採用す
ることもできる。遮断されたスティック支持体１０は、
次に包装され、使用されるときまで貯蔵されることがで
きる。前記遮断されたスティック支持体１０は、それら
の予想される使用態様に応じて任意の適当な容器に包装
されるか、または全く包装されないで、氷点下で冷蔵さ
れるか、または周囲温度で貯蔵されることができる。

好ましくは、幾つかの窓ないしは穴１３が支持体１１に
形成され、その中の膜１２の領域を露出する。露出され
た膜は精製された種々の抗原を点付けされるようになっ
ており、前記窓ないしは穴は第２図においてｗ、ｘ、ｙ
およびＺと識別されている。また、文字ＰおよびＮで識
別された窓ないしは穴１３は対照（コントロール）をド
ツトされることができる。

前記支持体の上端部１１ａから２番目の窓は、Ｎと符号
を付けられている。この窓ないしは穴は、好ましくは陰
性対照を点付けされる。このような陰性対照は、好まし
くは、文字を付された窓に点付けされる他のすべての標
本の可溶化／希釈のために使用される緩衝溶液からなる
か、または抗原産生に使用される感染してない細胞の細
胞抽出物のような陰性対照抗原であり得る。最後に、Ｐ
と識別された一番上の窓ないしは穴は、陽性対照を収容
することができる。

前記陽性対照は、全ての試薬が適正に機能しており、か
つ試験手順が正しく行われたことを証明するためのもの
である。前記陽性対照はまた、第２図に示される５個の
反応容器が、試験手順を首尾よく遂行するために必要な
量まで充分に再構成されていることを証明する。実際に
は、この窓は、陽性対照として、精製されたヒト免疫グ
ロブリンＧ（ＩｇＧ）の溶液を点付けされている。この
開示の範囲内において、前述以外の溶液を陽性および陰
性対照として使用することもできるし、これらの対照を
全く省略し、ＰおよびＮで示される窓を除去するか、ま
たは他の目的のために使用することもできる。実際には
、ｗ、ｘ、ｙおよびＺと識別された窓ないしは穴１３は
、好ましくは、試験されるべき抗体に対する種々の精製
された抗原をそれぞれ点付けされる。勿論、試験される
べき抗体の総数が必要とされる窓ないしは穴１３の数を
決定する。実際には、下記の例に示されるように、６個
の窓（２個は陽性および陰性対照用、他の４個の窓は種
々の精製された抗原を点付けされる）を有するスティッ
ク支持体１０が具合よく使用されて来た。

窓ないしは穴１３を通してあられれている膜１２の表面
が一旦適切な溶液を点付けされると、これらの点１４は
周囲温度において空気乾燥される。

このような乾燥は通常数分を必要とするが、より長い乾
燥時間も顕著な影響を伴うことなく採用できる。また、
周囲温度以外の温度もまた顕著顕著な影響を伴うことな
く採用できる。

第２図は、本発明の改善点を利用した酵素結合免疫測定
法の好ましい実施例を示す。この例は、容器１．２．３
．４および５において順次行われる第１図のスティック
支持体１０のインキュベーションを含み、インキュベー
ション間にはゆすぎが行われる。臨床試料から特異抗体
を検出するために、前述のようにして用意されたスティ
ック支持体１０が容器１．　２．　３．４および５にそ
れぞれ収容された５つの別々の免疫化学溶液中で４５℃
で約４分間、順次インキュベートされる。第２図に示さ
れる段階は好ましくは前述のように４５℃で行われるが
、この開示の範囲内において、インキュベーションの速
度を速めたり、遅くしたりするために、室温を含む他の
インキュベーション温度および他のインキュベーション
時間を採用することもできる。さらに、実際には、幾つ
かの測定、例えば風疹およびトキソプラズマに対する測
定に対しては、容器４で示される２回目の洗浄はこの開
示の範囲内において行わないでよいことが分った。

本発明の方法は、好ましくは、それぞれ試薬を収容する
小さなプラスチック容器で行われる。各容器は、前記膜
をスティック支持体１０の端部１１ｂ側において挿入さ
れる。第３図は、容器５における本発明の選択された酵
素基質反応物の錠剤の混合を示している。好ましくは、
容器１，２゜３および５に対する各反応物錠剤は１１０
０ＩＩ１の錠剤であり、乾燥した空の容器に加えられ、
約２ｍｌの水で再構成される。容器４は好ましくは１０
〜５０ｍ１の水で満たされる。しかしながら、この開示
の範囲内において、試薬成分は乾燥状態で混合され、粉
末形状のままとされ、前述のように再構成されてもよい
ことが理解されなければならない。

スティック支持体の膜側端部１１ｂを挿入し、適当に動
かすことにより、各容器の内容は充分に混合され、前記
試薬を再懸濁させる。

本方法においては、試薬および洗浄錠剤は、好ましくは
、下記の材料から調製される。この調整において、適当
な材料が混合され、この混合物は好ましくは、錠剤化産
業においては一般的な、混合および圧縮モールディング
またはスタンピングを含む標準的な錠剤化方法に従って
錠剤化される。

前記錠剤は、好ましくは、下記のような混合量の化学試
薬から調製され、これらの処方箋はそれぞれおおよそ各
試薬の１個の１００ｍｇ錠剤を作る。

勿論、実際には、前記錠剤は好ましくは一回の調合量を
大きくして調合され、したがって材料の重量は製造すべ
き錠剤の数に比例して増加される。

加うるに、この開示の範囲内において、試薬の処方箋の
種々の変更が可能である。このような変更は、錠剤の分
解時間、安定性、コスト、および臨界免疫化学試薬の活
性を向上するため採用されよう。貯蔵寿命、包装容易性
、取り扱い容易性、および低生産コストのため、凍結乾
燥された試薬や液体試薬より錠剤化された試薬または乾
燥粉末試薬の方が望ましい。

本発明以前は、選択された酵素基質、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル・ホスフェート（Ｂ　ＣＩ　Ｐ
、　５−ｂｒｏａ＋ｏ−４−ｃｈｒｏｌｏ−３−ｉｎｄ
ｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＰ−ニトロブル
ー・テトラゾリウム・クロリド（Ｎ　Ｂ　Ｔ、　Ｐ−ｎ
ｉｔｒｏ　ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏ！ｊｕｍｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ　）は、組み合わされると不安定であり、さら
にＢＣＩＰは最適な効能のためには水に充分溶解せず、
したがって錠剤化されたとき適当な貯蔵寿命を持たない
と信じられていた。従来の製剤は、有機溶剤および水に
溶解したときに、ＢＣＩＰおよび（または）ＮＥＴの可
溶化を得ていたが、この混合物は、粉末形状に乾燥され
、混合されたとき、その乾燥状態で反応性を持ち続ける
ことが分った。この活性は、反応物の安定性を許容でき
ないほどに減少させる。観察の結果、ＢＣＩＰおよび（
または）ＮＢＴは、一般の有機溶剤（Ｎ。

Ｎ、ジメチルホルムアミドのようなもの）および水に対
してより、水に対してもっと溶けにくいが、それにもか
かわらず、測定において最適な反応性を得るに充分に可
溶であると本発明者により判定された。加うるに、１０
倍過剰まで、ＢＣＩＰまたはＮＢＴは測定に支障をもた
らさないことが観察された。したがって、２つの基質Ｂ
ＣＩＰおよびＮＢＴが、まず溶かされてから乾燥される
のではなく、乾燥化学状態で混合されたとき、それらは
乾燥包装または錠剤化に好適な安定した粉末配合に配合
されることができると決定された。この乾燥包装された
状態または錠剤化され、た状態は、上述のように調整さ
れ、包装されたとき、安定であることが分った。そして
、このコンパウンドは他の反応物に要求される貯蔵期間
の間安定であり続ける。前記貯蔵期間は、市販される測
定システムに対し１８箇月を超えるように決定された。

前記酵素基質反応物は、前記ＥＬＩ　ＳＡに似た免疫測
定法に対する酵素デベロッパーとして再構成されるよう
に首尾よく乾燥包装され、錠剤化されたが、この構成は
前述の免疫ｎ１定法のみに限られないことが理解されな
ければならない。この構成は、この開示の範囲内におい
て、アルカリホスファターゼに対する一般的な化学測定
およびアルカリホスファターゼ酵素を使用するウエスタ
ンブロット測定のようなどんな測定システムにおいても
、酵素基質反応物としてあまねく使用することができる
。

前記ＥＬ　Ｉ　ＳＡに似た免疫測定法を実施するための
、第２図の各反応物容器において再構成される試薬錠剤
の好ましい成分は、次の通りである。

錠剤化された試料希釈剤 容器１ 塩化ナトリウム リン酸ナトリウム、−塩基 リン酸ナトリウム、二基基 ウシ血清アルブミン ステアリン酸マグネシウム 微結晶セルロース １７．０００ ０．６９０ ４．１７０ ｔｏ、ｏｏ。

Ｏ，９４０ ８８，２００ 錠剤化された高イオン強度洗浄剤 容器２ ステアリン酸マグネシウム　　　　　　０．９９染料、
ＦＤ＆Ｃ＃３　　　　　　　　０．０１＋＋＋ｇ ｏ＋ｇ 微結晶セルロース 塩化ナトリウム 錠剤化された接合体 容器３ 塩化ナトリウム リン酸ナトリウム、−塩基 リン酸ナトリウム、二基基 ステアリン酸マグネシウム 硫酸マグネシウム 染料、ＦＤ＆Ｃ黄　＃６ ４０．５０ ５８．５０ １７．０００ ０．６９０ ４．１７０ ０．９５１ ０．２４１ ０．０５０ 洗浄剤 容器４ 防腐もしくは殺菌した水、または防腐もしくは殺菌しな
い水 錠剤化されたデベロッパー 容器５ 塩化ナトリウム　　　　　　　　　　Ｌｌ、８８０ｒ！
１ｇ 硫酸マグネシウム　　　　　　　　　１２．０４０　　
舊ｇ染料、ＦＤ＆Ｃ青　＃１　　　　　０．０１０　　
ｍｇ微結晶セルロース　　　　　　　　　４８．８２０
　　ｍｇ５−ブロモ−４−クロロ−３ 一インドリル・ホスフェート （ＢＣＩＰ）　　　　’　　　　　　　　　１Ｊ３０　
　ｍｇＰ−ニトロブルー・テトラゾリウム ・クロリド（ＮＥＴ）　　　　　　　　２．６４０　　
ｍｇトリズマ塩酸　　　　　　　　　　　　１．８８０
　　ｍｇトリズマ塩基（Ｔｒｉ；ｖａ　ｂａｓｅ　）　
　　　　２２．８００　　ｍｇステアリン酸マグネシウ
ム　　　　　　ｔ、ｏｏｏ　　■前述の免疫測定法を実
施するに際し、第２図に示される５個の容器の第１番目
の容器１は、好ましくは２ｍｌの水を使用して、錠剤形
状から再構成された試料希釈剤を収容するようになって
いる。

１マイクロリットル程度の血漿、血清、または全血から
なる少量の臨床試料を完全に混合するように、前記希釈
剤はスティック支持体を上下に振ることにより混合され
る。凝固阻止剤が、試薬の一部として含有されるか、ま
たは再構成された希釈剤に加えられることができる。容
器１に対し選択された再構成希釈剤は前述の通りである
。加つるに、この開示の範囲内において、例えばトリス
−食塩水、洗剤を含む溶液等のような他の溶液も、それ
らの溶液が免疫化学試薬の非特異的な相互作用を最小限
とするならば、希釈剤として使用することができる。

この試料段階において、第２図の矢印Ａで示されるよう
に、スティック支持体１０は希釈剤および臨床試料中に
おいて約４分間インキュベートされ、次に、数秒間ゆす
ぎ溶液中で素早く往復動される。

臨床試料および試料希釈剤の存在下でスティック支持体
１０がインキュベートされる試料段階およびゆすぎの後
、第２図の段階２に示されるように、スティック支持体
が容器２内に位置される。

容器２は高イオン強度溶液を収容している。実際には、
塩化ナトリウムおよび不活性材料を含む選択された錠剤
または乾燥粉末が約０．５Ｍ溶液を作るように水で再構
成される。矢印Ｂで示されるように、洗浄容器はスティ
ック支持体１０を受け入れて、該スティック支持体１０
を上げ下げされ、次に、約４分間溶液中に漬けられる。

０．２５Ｍから飽和度までの高イオン強度溶液の使用効
果および理論は、前記「洗浄段階理論」の項で述べた。

０．２５Ｍ程度のイオン強度溶液が、免疫ペルオキシダ
ーゼ組織学的染色法として知られている免疫化学染色シ
ステムにおいてこれまで使用されて来たが、前述のよう
な動物蛋白質を伴う測定に対して高イオン強度溶液を使
用することは、試料段階および（または）接合体段階中
にイオン強度が増加すると、測定感度が減少すると観察
されていたので、これまで非実用的であると信じられて
来た。また、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ段階における試料段階およ
び接合体段階の後、浄化のために高塩濃度を使用すると
、許容できない背景干渉を生じさせると観察されて来た
。これまで、試料段階と接合体段階との間の洗浄段階、
および接合体段階と基質段階との間の洗浄段階に対し同
一の洗浄溶液が一様に使用されて来たが、ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａタイプの方法に対して本発明によって実施されるよう
に、試料段階と接合体段階との間において高イオン強度
洗浄溶液を使用し、接合体段階と基質段階との間で水洗
することは思いつかれなかった。

したがって、前述のように、ニトロセルロースが膜とし
て使用される前記免疫測定の場合は、試料が反応した後
のみ、高イオン強度溶液が試料を洗浄するために使用さ
れなければならず、かつ接合体反応段階の後は、抗原−
抗体結合親和性の喪失を避けるために、０．２５Ｍより
低い低イオン強度溶液（好ましくは水のみ）が使用され
なければならないことが分った。このことは、ここに述
べられた方法に似たウェスタンプロット・タイプの測定
を実施する場合も同じである。

しかしながら、直接および間接免疫蛍光測定のような他
の測定に対しては、試料段階の後および接合体段階の後
において、高イオン強度溶液の洗浄が適当である。この
ことは、サイトメガロウィルスおよびエプスタイン−バ
ーウィルスに対するＩｇＧおよびｒｇＭ抗体の存在を測
定する間接蛍光測定（ＩＦＡ）と、エプスタイン−バー
ウィルス核抗原に対する抗体の存在を検出する抗補体蛍
光測定（ＡＣＩＦ）との両方に対して、実際に真実であ
ることが分った。両方の方法において、背景蛍光が著し
く減少し、美的改善は大幅であった。

、実際には、ＩＦＡ方法の幾つかにおいて、低レベルの
蛍光反応のために判定が困難な試料が陰性試料として明
瞭に判定できた。これらの試料は、他の代替測定法を使
用することによって真に陰性試料であると確認された。

すべての免疫化学測定において、試料段階の後かつ接合
体段階の前に高イオン強度溶液を使用すると、全般的な
反応の感度および（または）特異性の顕著な改善をもた
らすと信じられる。例えば塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、塩化リチウム、液酸ナトリウム、リン酸ナトリウム
、カオトロピック物質、尿素、チオシアン酸エステルと
いう他の塩類のような他の化学薬品が、測定の機能に同
様の改善をもたらすことが予想される。

固体支持体システムへの共有結合および非共有結合分析
物に対し試料の高イオン強度浄化を行うことができるが
、しな（でもよい。これらの固体支持体システムは、（
１）ニトロセルロース、（２）ポリスチレン、（３）ナ
イロン、および（４）紙を含むが、これらに限られない
。本方法に対し予想される一般的な使用方法は、ニトロ
セルロースを使用する分析物のウェスタンｅプロット分
析と、ポリスチレン・マイクロリットル・ストリップ、
板、またはビードのいずれかを用いる酵素免疫吸着測定
（Ｅ−ＬＩＳＡ）とである。

容器２における第一の洗浄に続いて、矢印Ｃで示される
ように容器３においてスティック支持体１０が約４分間
インキュベートされる。この容器は、好ましくは、前述
のように、約２ｍｌの水と錠剤化された化学接合体また
は乾燥化学接合体とを混合することによって作られた再
構成された接合体を収容している。しかしながら、他の
特異性の接合体および異なった酵素（例えば、ペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ等）もまたこの開示
の範囲内に入ることが理解されなければならない。イン
キュベーションの間、酵素標識抗体は、試料希釈液中に
存在し、特異抗原のドツトないしは点に結合した臨床試
料の抗体に結合する。加えるに、このインキュベーショ
ンの間、もし陽性対象点が使用されていれば、接合体は
この陽性対象にも結合する。

容器３におけるスティック支持体１０のインキュベーシ
ョンの次に、矢印りで示されるように、別のゆすぎが行
われる。前述の方法と同様の酵素結合免疫測定法に対す
るこのゆすぎは、容器２に収容された高イオン強度溶液
では行われず、好ましくは低イオン濃度を有する溶液（
この場合、好ましくは水）で行われる。しかしながら、
直接または間接蛍光測定に対しては、前記高イオン強度
溶液がこのゆすぎ段階においても使用できる。スティッ
ク支持体は約４分間容器４に入れられる。

前記容器４は、好ましくは、１０〜５０ｍ１の水を収容
する。

第二番目の洗浄に続いて、矢印Ｅで示されるように、ス
ティック支持体１０は、互いに結合した抗原−抗体に結
合した接合体の存在を視覚的に示すように該接合体に反
応する酵素基質反応物を収容している第５の容器の内で
インキュベートされる。前記選択された酵素基質は、乾
燥した、錠剤化されるかまたは粉末とされたＢＣＩＰお
よびＮＢＴを水中で混合することによって再構成された
前述のものである。このインキュベーションの間、選択
されたアルカリホスファターゼがＮ　Ｂ　Ｔ／ＢＣＩＰ
基質と相互作用する。この酵素的相互作用の産物は、酵
素接合体が結合したドツト１４の部位におけるニトロセ
ルロース膜上の不溶解性の色のついた沈降物の産生およ
び沈積である。この沈積物およびその膜への堅い結合は
、ドツト１４上にニトロセルロース膜１２の白い背景に
対して青味を帯びたスミレ色を生じさせる。このインキ
ュベーションに続いて、水溶液または蒸溜水による簡単
なゆすぎ行われることができる。

第５番目のインキュベーションの後、１つまたはそれ以
上の窓ないしは穴１３内にあられれた色点は、臨床試料
中の特異抗原に対する特異抗体の存在を示す。このよう
な色点が存在しなければ、そのような特異抗体が存在し
ないことを示す。さらに、試験結果の有効性の検証とし
て、陽性および陰性対照窓ＰおよびＮを調べたとき、陽
性対照窓には色点が存在しなければならず、かつ陰性対
照窓には検出できる色点が存在してはならない。

これは、すべての試験試薬が試験時に適正に作用したこ
と、および試験遂行のために適正な処置が行われたこと
を示す。２つの対象に対するこれ以外の結果は、試験を
無効にする。

実際に、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の試験におけ
る試料段階と酵素接合体段階との間において洗浄試薬と
して高イオン強度溶液使用の効果は、感度および特異性
の増加に加えて、１．０モルの塩化ナトリウムの洗浄溶
液を免疫蛍光測定に取り入れたとき、広く用いられてい
る他の２つの方法を使用して観察された結果とは異なる
結果を生じさせることを実証した。ラテックス測定、標
準的な免疫蛍光測定（ＩＦＡ）、および１．０Ｍ塩化ナ
トリウムを使用した免疫蛍光測定を用いて、２２５個の
ヒト血清試料が、ＣＭＶに向けられたヒト抗体の存在に
ついて試験された。第１表に示されるように、塩を取り
入れたＩＦＡでは、ラテックス測定の結果と比較すると
、２６．４％多い陽性が観察された。さらに、塩を取り
入れたＩＦＡでは、それ以外は同一の試薬を使用した標
準的なＩＦＡより、２１．７％少ない陽性が観察された
。

第１表 ラテックス　高塩ＩＦＡ　　標準的ＩＦＡ陽性　　　１
４０　　　１７７　　　　２２６陰性　　　１１５　　
　７８　　　　２９臨床試料中の抗体を検出するための
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）に似た方法の実施
に関し本発明の作業がこれまで説明されてきたが、この
開示はまた、洗浄溶液として高イオン強度溶液を使用す
ることによって背景干渉を減少することが適当な、血液
分析を広く含む、免疫蛍光測定および同様の測定にも関
連することは明らかであり、したがって本開示は、例示
のためにだけなされており、私が私の発明とみなす前記
特許請求の範囲内に入る主題から逸脱することなく本開
示の範囲内において変形が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、そこに装着された膜を含む固体支持体からな
るスティック支持体の分解斜視図であり、前記固体支持
体は膜の一部を露出する穴を間隔をおいて明けられてお
り、前記膜のうちの穴により露出された部分には精製さ
れた抗原のドツトが固定されており、膜のうちの前記ド
ツトの周囲の領域に付けられる遮断試薬が示されている
；第２図は、特異抗体の存在を決定するための第１図の
スティック支持体による酵素結合免疫吸着測定の実施の
概略流れ図； 第３図は、再構成のために、ＢＣＩＰおよびＮＢＴから
なる錠剤化された酵素基質反応物を受け入れようとして
いる第２図の第五の試験容器の図である。 １〜５・・・容器、１０・・・スティック支持体、１１
・・・支持体、１２・・・膜、１３・・・窓ないしは穴
、１４・・・抗原のドツト、１５・・・遮断剤。 特許出願人　ジェネラル・バイオメトリックス・インコ
ーホレイテッド 代　理　人　弁理士　　大森　泉

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物血清蛋白質から抗原−抗体反応物を検出する免
   疫測定システムであって、 精製された抗原標本または抗体標本を保持する支持体手
   段を有し、 動物蛋白質試料を受け入れる臨床希釈剤を収容する第一
   の容器手段を有し、前記試料からの特異抗体または抗原
   が前記抗原標本または抗体標本に結合するように、前記
   第一の容器手段内において前記支持体手段が充分な時間
   の間インキュベートされ、 ０．２５Ｍから飽和度までの高イオン強度の洗浄溶液を
   収容する第二の容器手段を有し、前記試料インキュベー
   ションの後、前記洗浄溶液が選択的に抗原−抗体反応部
   位における非特異的相互作用を防止し、前記反応部位に
   おける干渉物質を除去し、それによって測定感度を増大
   するように、前記支持体手段が前記洗浄溶液で洗浄され
   、かつ該洗浄溶液中に充分な時間の間漬けられ、 酵素接合体を収容する第三の容器手段を有し、前記洗浄
   の後、前記酵素接合体が前記試料の抗原−抗体結合部位
   に結合するように、前記支持体手段が前記酵素接合体中
   で充分な時間の間インキュベートされ、 酵素基質を収容する最後の容器手段を有し、前記酵素基
   質が前記酵素接合体に反応し、前記酵素接合体が前記試
   料の抗原−抗体に結合している部位において前記支持体
   手段上に色のついた沈降物を生じさせるまでの充分な時
   間の間、前記支持体手段が前記酵素基質中でインキュベ
   ートされる、免疫測定システム。 ２、洗浄溶液を収容する第四の容器手段をさらに有し、
   前記第三の容器手段におけるインキュベーションと前記
   最後の容器手段におけるインキュベーションとの間で、
   前記支持体手段が該洗浄溶液で洗浄され、かつ該洗浄溶
   液中に漬けられる請求項１記載の免疫測定システム。 ３、各インキュベーションおよび洗浄の時間は４分であ
   る請求項２記載の免疫測定システム。 ４、各容器手段に収容された試薬はそれぞれ錠剤化され
   た形から再構成される請求項１記載の免疫測定システム
   。 ５、前記試薬は水溶液で別々に再構成される請求項４記
   載の免疫測定システム。 ６、前記酵素基質は、乾燥状態で錠剤の形にされており
   、水溶液で再構成される５−ブロモ−４−クロロ−３−
   インドリル・ホスフェート（ＢＣＩＰ）とＰ−ニトロブ
   ル−・テトラゾリウム・クロリド（ＮＢＴ）との組み合
   わせを有してなる請求項４記載の免疫測定システム。 ７、水溶液で再構成されたとき、酵素基質として働く反
   応性産物を充分に提供するように、過剰なＢＣＩＰおよ
   びＮＢＴが配合されている請求項６記載の免疫測定シス
   テム。 ８、前記容器の内容は一定の温度に維持される請求項１
   記載の免疫測定システム。 ９、前記容器の内容は約４５℃に維持される請求項８記
   載の免疫測定システム。 １０、前記容器手段の内容は室温に維持される請求項８
   記載の免疫測定システム。 １１、試験されるべき精製された特異抗原または抗体の
   標本を保持する支持体を使用する免疫測定方法であって
   、 臨床希釈剤試薬および動物蛋白質試料を収容する第一の
   容器において前記支持体および標本をインキュベートし
   、 ０．２５Ｍと飽和度との間の高イオン強度洗浄溶液試薬
   を収容した第二の容器において前記支持体および標本を
   洗浄し、 酵素接合体試薬を収容した第三の容器において前記支持
   体および標本をインキュベートし、前記酵素接合体と反
   応して前記支持体の前記標本の部位に、見える色の付い
   た沈降物を産生する酵素基質試薬を収容した最後の容器
   において前記支持体および標本をインキュベートする、 免疫測定方法。 １２、酵素接合体インキュベーションと酵素基質インキ
   ュベーションとの間において、第四の容器に収容された
   試薬で前記支持体および標本を洗浄する請求項１１記載
   の免疫測定方法。 １３、前記支持体および標本は、各容器において約４分
   間それぞれインキュベートおよび洗浄される請求項１２
   記載の免疫測定方法。 １４、前記第二の容器の前記高イオン強度洗浄溶液は約
   ０．５Ｍである請求項１１記載の免疫測定方法。 １５、同一の前記高イオン強度洗浄溶液が、前記第二の
   容器および前記第四の容器で行われる前記洗浄段階に使
   用される請求項１２記載の免疫測定方法。 １６、すべての前記容器に収容された前記試薬は、錠剤
   から水溶液で再構成される請求項１１記載の免疫測定方
   法。 １７、前記錠剤化された酵素基質は、水溶液で再構成さ
   れるように乾燥状態で配合された５−ブロモ−４−クロ
   ロ−３−インドリル・ホスフェート（ＢＣＩＰ）とＰ−
   ニトロブルー・テトラゾリウム・クロリド（ＮＢＴ）と
   のコンパウンドである請求項１６記載の免疫測定方法。 １８、ＢＣＩＰおよびＮＢＴは、有機可溶化剤なしでは
   水溶液に充分溶け難いことを認識して、充分な反応性産
   物を提供するように、ＢＣＩＰおよびＮＢＴの成分量の
   それぞれが選択され、配合されている請求項１７記載の
   免疫測定方法。 １９、前記容器の内容は４５℃に維持される請求項１２
   記載の免疫測定方法。 ２０、前記容器の内容は室温に維持される請求項１２記
   載の免疫測定方法。 ２１、動物蛋白質を含む材料に化学反応を生じさせる測
   定において、干渉物質を選択的に除去する洗浄溶液試薬
   であって、前記材料が試料インキュベーションと接合体
   インキュベーションとの間において洗浄される０．２５
   Ｍから飽和度までのイオン強度の溶液またはカオトロピ
   ック溶液を有してなる洗浄溶液試薬。 ２２、０．５Ｍイオン強度溶液が前記洗浄溶液として使
   用される請求項２１記載の洗浄溶液試薬。 ２３、前記洗浄溶液は、前記試料インキュベーションと
   接合体インキュベーションとの間と、前記接合体インキ
   ュベーションと前記酵素基質インキュベーションとの間
   との両方において使用される請求項２１記載の洗浄溶液
   試薬。 ２４、水溶液を使用して再構成されるように乾燥状態で
   配合された５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・
   ホスフェート（ＢＣＩＰ）とＰ−ニトロブル−・テトラ
   ゾリウム・クロリド（ＮＢＴ）とのコンパウンドを有し
   てなる酵素基質有機化学コンパウンド。 ２５、ＢＣＩＰおよびＮＢＴは乾燥状態で配合されて錠
   剤化された形とされた請求項２４記載の酵素基質有機化
   学コンパウンド。 ２６、前記コンパウンドのＢＣＩＰおよびＮＢＴの量の
   それぞれが、水溶液で再構成されたとき、抗原抗体反応
   の部位で適当な酵素接合体に反応し、前記部位に色の付
   いた沈降物を産生する反応性産物を充分提供するように
   選択されている請求項２４記載の酵素基質有機化学コン
   パウンド。