JPH01245157A - 免疫分折用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液状試料中、例えば、全血、血清、血漿、及
び尿等の体液中の物質の検出又は測定のだめの、免疫分
析方法に関する。

広範囲の種類の物質が、生物学的試料中の免疫分析方法
により、通常、検出又は測定されており、物質の例には
ホルモン、抗体、トキシン、及び薬物がある。常にでは
ないけれど、普通、検出される物質、又はその検出に使
用される物質は、抗体であり、それ故、「免疫分析」で
ある。抗体は、特異結合対の一構成員であり、この対の
他の構成員は抗原又は分析対象物として呼ばれる。免疫
分析で測定され使用される、抗体−抗原対のほかに、そ
の他の特異結合対には、お互いに対して特異結合親和性
を有する分子の対、等があり、例えば、ホルモン−ホル
モン受容体、及びビオチン−アビジンである。

免疫分析は、通常、少なくとも一部は、固体支持体、例
えば、ガラス繊維膜上で実施される。固体支持体を使用
する免疫分析のための二種類の最も共通的な形式は、競
合形式及びサンドイッチ形式である。典型的な競合分析
においては、測定される物質（分析対象物）は、約ＩＱ
Ｑ乃至約２Ｈｆｌの分子量を有する残留薬物又は小ホル
モン等の低分子量物質であり、かかる低分子量物質は、
以下に述べるサンドイッチ分析に容易には適合しない。

典型的な競合分析においては、分析対象物に対する抗体
は固体支持体上に固定化されており、そして分析対象物
を含有すると推測される試料はその固体支持体と接触状
態になる。同時に又は後に、標識された分析対象物を含
有する溶液を支持体と接触させ、その結果、標識された
分析対象物と試料中の分析対象物は、固定化されている
抗体に結合するために競合する。（もし測定される物質
が抗体自身であるならば、固定化される分析対象物は、
その抗体に対する抗体又はその抗体が特異的な抗原であ
る可能性がある。）次いで、固体支持体を洗い、試料中
の分析対象物の反対指標（ｉｎｖｅｒｓｅ　ｍｅａｓｕ
ｒｅ）として、標識の量を測定又は検出する。典を的に
は、標識は、化学ルミネセンス物質、ラジオアイソトー
プ、又は、最も好ましくは、最終工程で色原性基質と反
応し試料中に存在する分析対象物の量に逆に関連づけら
れている強度の呈色をする酵素である。典型的な競合形
式は、例えば、リドマン（Ｌｉｔｍλｎ）氏等の米国特
許第４，５４０，６５９号明細書に記載されている（該
明細書を本明細書中に含める。）。リドマン氏等の競合
分析においては、試験スポットに加えて、固体支持体も
又、リドマン氏等が「校正表面（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏ
ｎ　５ｕｒｌａｃｅ）と呼ぶものを有し、該表面は、必
要ではないが、好ましくは、測定される物質に対する抗
体を含有し、「測定表面の信号レベルのための評価のた
めの標準」として働く（第３欄第１４〜１７行）。

サンドイッチ免疫分析（例えば、デビット氏等の米国特
許第４，３７６．１１０号明細書（本明細書中に含める
）に記載されているような分析）は、一般に、２，００
０を超える分子量の検出若しくは測定物質（分析対象物
）、例えば、抗体及びその他のタンパク質、に使用され
る。典型的なサンドイッチ分析においては、分析対象物
に対する第一抗体を固体支持体上に固定化し、次いで、
それを液状試料と接触させ、その結果、試料中の分析対
象物かその抗体に結合する。次いで、分析対象物に対す
る標識された第二抗体を添加し、支持体を洗い、結合さ
れた標識の量を測定する。結合された標識は試料中の分
析対象物の量に比例する。

幾つかの免疫分析の目標点は、単に正若しくは負の結果
ではなくて、半定量結果、即ち、試料中に存在する分析
対象物の量の正確で完全な見積もりではない粗い見積も
りを与えることである。例えば、チャンドラ−（Ｃｈａ
ｎｄｌｅｒ）氏等のインターナショナル・アチーブス・
オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー
（ＩｌｅｒｎａＬｉｏｎａｌＡｒｃｈｉｖｅｓ　ｏ［Ａ
ｌ！ｅｒＨｙ　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉＣｄ　Ｉｉｍｎｎｏ
ｌｏｇｙ）第７２巻、第２６７頁、１９８３年は、各々
がＩｇＨに対して特異的な、固定化された抗体を有する
、３本のガラス製キャピラリー管を使用する、血漿中の
ＩｇＥの半定量免疫分析を記載する。スワルジユング（
Ｓｗａｎｌｊｕ＋ｇ）氏のヨーロッパ特許出願番号ＷＯ
３５１０２４６６号明細書は、試験色を標準色と比較し
、半定量結果を与える比色免疫分析を記載する。リドマ
ン（Ｌｉｔｍｘｎ）氏等は、玉揚の文献で、［観察され
た結果を既知量の分析対象物で得られた比に関連させ、
濃度の変化に伴う信号レベルの比の変化をグラフ化して
定量できる」と述べている。

従来の種々の分析方法と比較して優れた免疫分析方法を
与える本発明の多くの態様がある。

第一の態様では、本発明は、特異結合対の第一構成員の
競合免疫分析による、液状試料における半定量測定のた
めのキットを特徴とする。キットは、免疫分析で検出可
能な信号を与える標準領域、並びに第一及び第二試験領
域を有する固体支持体を含有し、試験領域の各々は異な
った量の、特異結合対の第−又は第二構成員含み、そし
てそれにより、標準領域から検出可能な信号の強度を、
試料中の未知量の第一結合対構成員の存在における前記
二種類の試験領域からのいずれかの検出可能な信号の強
度と比較できる。各試験領域の結合対構成員の二種類の
量は、試料が特異結合対の第一構成員の第一量を含有す
るとき、好ましくは、第二領域ではなくて、第一領域が
標準領域の検出可能な信号よりも相当に低い強度の検出
可能な信号（即ち、器具の必要性がなく、肉眼で標準領
域と区別できる）を発生すると同時に、試料が特異結合
対の第一構成員の、より多い第二量を含有するとき、両
方の領域が標準領域の検出可能な信号よりも相当に低い
強度の検出可能な信号を発生するように選択する。好ま
しくは、第一試料領域より発生した信号の強度は、試料
が第一範囲内の量で特異結合対の第一構成員を含有する
とき、実質的に直線的に変動し、そして、第二試験領域
より発生した信号の強度は、試料がより大きい第二範囲
内の量で特異結合対の第一構成員を含有するとき、実質
的に直線的に変動する。二種類の試験領域は、試験領域
の結合対構成員の量が、試料が第一量の特異結合対の第
一構成員を含有するとき、第一試験領域が飽和されかつ
第二試験領域がその第一量で飽和されないが、第二の大
量で飽和されるように選択されるとき、異なった範囲に
対してこの所望の直線反応を最も示す。もし、広い範囲
の量の特異結合対の第一構成員に興味があるならば、固
体支持体は、勿論、二種類の試験領域よりも多く有する
ことができ、これらの試験領域の各々は、異なる量の結
合対構成員を有するため、第一構成員に対″して、異な
る可及的に最大限の容量を有し、従って、異なる直線範
囲を有しうる。

競合試験は、二種類の配置を有する可能性がある。一つ
は、支持体試験領域は、第二結合対構成員（例えば、抗
体若しくは受容体タンパク質）を有し、標識されたもの
と試料第一構成員とが、試験領域への結合に対して競合
する。第二の配置では、試験領域は、標識された第二結
合構成員への結合に対して、試料中の第一結合構成員と
競合する第一結合構成員を有し、試料中の第一結合構成
員は標識された第二構成員を保持し、試験領域に対する
その信号生成結合を減少する。

本発明の統合免疫分析は、標準品を試験し、該標準品に
対する試験結果を比較する必要性なしで、半定量結果を
与える。更に、該分析は、試験装置にたった一回の試料
の添加で半定量結果が得られることを可能にし、笥便な
試験手順を提供する。

加えて、好ましくは、使用される標識が、色原性基質と
反応する酵素である場合、半定量結果は、ラジオアイソ
トープカウンター又はその他の装置の必要性がなく、肉
眼で読むことができる。

別の関連した態様においては、本発明は、特異結合対の
第一構成員の、予め決められた、生理学的に意味のある
量よりも多量か等しい量の、液状試料中の存在の競合免
疫分析による測定のためのキットを提供する。該キット
は、上記で、本発明の第一態様に関連させて論じｔ；支
持体のような固形支持体を包含する。即ち、該支持体は
、免疫分析中に検出可能な信号を与える標準領域、並び
に試料中の第一結合対の構成員のより高い濃度を持つよ
り低い強度の検出可能な信号を発生するようになってい
る試験領域、を有し、そして、特異結合対の第一構成員
が、予め決められた、生理学的に意味のある量と等しい
量か又は多量に試料中に存在するとき、免疫分析中に、
標準領域の強度よりも相当に低い強度の検出可能な信号
を試験領域に発生させ、かつ第一特異結合構成員が、そ
の予め決められた、生理学的に意味のある量未満の量で
試料中に存在するとき、免疫分析中に、標準領域の強度
より相当に低い強度の信号を試験領域に発生させない量
の特異結合対の第−又は第二構成員を含有する。標準信
号の強度よりも「相当に低い強度」を有する信号とは、
測定器具を使用しないで、試験の使用者により肉眼的に
検出できる信号である。本発明のこの態様は、少量で無
害かもしれなくそして予め決められた最小量よりも大量
存在した場合のみ興味のある、トキンンや薬物のような
物質の生理学的に重要な閾値の検出に最も大きな利用性
を有する。前述した多点競合試験におけるように、試験
領域は第−又は第二結合対構成員を有することができる
。

上記の、本発明の両前様では、キットは、好ましくは、
更に、特異結合対の標識された第−又は第二構成員を含
み、それに依存して結合対構成員は試験領域に固定化さ
れている。最も好ましくは、標識化は、色原性基質上で
作用し、色の変化を生じさせる酵素によるものであり、
そして、標準領域は、酵素に対する抗体を含有するが、
しかし、特異結合対の第−又は第二構成員のいずれも含
有しない。故に、標準領域は、どの試験においても、標
準領域中の抗酵素抗体に対する酵素標識されｔ；第−又
は第二結合対構成員の結合のために、着色される。標準
領域が特異結合対の第−又は第二構成員を含有しないか
ら、その色の変化は、試料中に存在する第一特異結合構
成員の量と無関係である。更に、標準領域は、酵素及び
色原性基質のバッチからバッチの変動に対してコントロ
ールを与える。その色の変化（試験領域の色変化等）が
前記試薬の作用の産物であるからである。

別の態様では、本発明は、分析対象物、例えば、抗体又
はその他のタンパク質、のサンドイッチ免疫分析による
、液状試料中の半定量測定用のキットを提供する。該キ
ットは、分析対象物に対して特異的な第一抗体を含有す
る試験領域並びに第一及び第二校正領域を持つ固体支持
体を含み、該校正領域の各々は、異なった量の被試験分
析対象物を含有し、それにより、試験領域からの検出可
能な信号の強度を、試料中の未知量の分析対象物の存在
下の第一及び第二校正領域からの検出可能な信号の強度
と比較できる。好ましくは、キットは、更に、分析対象
物に特異的な標識された第二の抗体を含有し、その結果
、分析対象物が試料中に存在するとき、試験領域上に、
通常の標識されたサンドイッチが形成される。各標準領
域は、試料中の分析対象物の存在又は存在程度に無関係
に、標識された抗体を結合する。更に、標準領域の各々
は、その異なる量の分析対象物のために、他と異なる標
識された抗体のだめの結合容量を有し、従って、各々は
異なるレベルで飽和されている。従って、半定量結果を
得ることができ、試験領域を標準領域と比較し、その各
々が分析対象物の範囲番表し、従って、試料が、試験領
域に匹敵する最大限の標準領域の結合容量の範囲で分析
対象物の量を含有することを決定できる。従って、本発
明のサンドイッチ分析は、分析対象物が単に試料中に存
在するかどうかを知ることのみならず、そのおよその量
を知ることが重要な場合に有用である。

この分析は、上記した競合分析のように、この半定量結
果を、一種の試験キット装置中の一種の試料の使用によ
って得るようにできる。

別の態様では、本発明は、分析対象物のサンドイッチ免
疫分析による、液状試料中の半定量測定用の別のキット
を特徴とする。該キットは、第一及び第二試験領域を有
する固体支持体を含存し、各試験領域は、異なる量の分
析対象物に特異的な第一抗体を含有し、それにより、第
一量の分析対象物の試料中の存在が、第二試験領域では
なくて第−試験領域中に（試験領域が制限されない量の
分析対象物の存在下で呈することができるであろう信号
の５０％を超える信号の呈する）信号強度の実質的な変
化をもたらし、そして、より多い第二愈の分析対象物の
試料中の存在が、第一及び第二試験領域の双方の信号強
度の実質的な変化をもたらす。好ましくは、該キットは
、更に、分析対象物に対する、酵素標識された第二抗体
を含む。

本発明の他の特徴及び利点は、次の好ましい実施態様の
記載並びに特許請求の範囲より明らかになるであろう。

競合免疫分析装置 第１図を参照すると、試験装置ｌＯは大体米国特許第４
，３７６．１１０号明細書に記載されている配置を有す
る。該特許明細書を本明細書に含める。装置ｌＯは、酸
ウマのプロゲステロンを測定するようになっているが、
多孔性ポリエチレン製ディスク１６を支持するプラスチ
ック製カップを含み、その中にアメリカン・フイルトロ
ナ・コーポレーション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆｉｌｔｒ
ｏｎａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から供給される吸収
剤材料からなる栓口、及びガラス繊維膜！８ＨＬ寸法１
ミクロン、ケルマン・サイエンス（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ）より得られる）が入れられる。

プレフィルタ−２６（膜目と同じもの）を、試験膜１８
とプラスチック製蓋３Ｇとの間に配置する。フィルター
２６は、試験結果を試験膜ＩＩｌ上で読めるように取り
除くことができる。装置１０に対する補助手段がスポン
ジ手段３２であり、これは、スポンジ栓３４及びハンド
ル３６からなる。スポンジ手段３２は、分析の開始時に
、予め湿らせた膜１８を据える機能を果を二す。

第２図を参照すると、膜１８は、標準スポットＣ１並び
に、半定量分析を実施するときは、多試験スポット１．
２及び３を持ち、その各々は、抗つマプロゲステピンモ
ノクロナール抗体（イムノサーチ（Ｉｍｍｕｎｏｓｅａ
ｃｈ）、トムズ噂リバー、Ｎ、Ｊ、１で被覆した、異な
る濃度のラテックス粒子を含む。

添加するために、ポリスチレンラテックス粒子を、抗体
を含有する燐酸塩緩衝液中に懸濁させ、洗浄し、次いで
、膜１８上にスポットするために燐酸塩緩衝液中に再懸
濁させる。スポットする前に、各抗体被覆旭理済粒子物
を、不活性タンパク質のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
で被覆されたラテックス粒子で希釈し、その結果、スポ
ット上の抗体粒子のパーセントは、スポット１で６０％
、スポット２で５０％そしてスポット３で４０％にする
。抗体の濃度は、血清試料が１　ｎｔ／ｍＱのプロゲス
テロン含有するとき、スポット１が飽和され、スポット
２が５Ｉｌ１７ｍｌで飽和され、そしてスポット３が１
０ｍｇ／ｍ４で飽和されるように選択する。分析は、む
しろ半定量的であるよりも（上述したように）、試料中
にプロゲステロンが、生理学的に意味のある量、例えば
、４　ｎｇ／ｍＬ　よりも多い量で存在するか否かを決
定することを目的とする場合に、膜１８は、−個の試験
スポットのみですみ、試料中にプロゲステロンが、生理
学的に意味のあるレベルよりも多い量で存在するときに
のみ、意味のある着色強度に変化する。標準スポットＣ
は、上記のように、酵素標識（セイヨウワサビ由来のペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アキュレートケミカルズ（
Ａｃｃｕｒａｔｅｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　）に対する抗
体で被覆したラテックス粒子を含む。位置決めマーク２
４が標準スポットＣの上に位置する。ラテックス粒子の
使用の代わりに、抗体を、膜上に、単に吸着させるか又
は化学的架橋することにより、直接スポットできる。

半定量的競合分析の操作 再び第１図を参照すると、［１８を、０．２５〜１モル
の塩化ナトリウム、２％の乾燥ミルク、５％のウシ血清
アルブミン及び防腐剤を含有する洗浄用溶液の数滴で予
め湿らす。次いで、血清の１Ｏ−１５滴を膜！８に適用
し、５分間反応させ、試料中に存在するプロゲステロン
を試験スポット１．２及び３中の抗体に結合させる。次
いで、カップ３０及びプレフィルタ−２６を取り去り、
洗浄溶液を加え、次いで、３〜４滴のＨＲＰ−標識プロ
ゲステロン（シグマ・ケミカル・コーポレーション（Ｓ
ｉ（ｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、セントルイス、
ＭＯ）を添加する。この標識された分析対象物は、試料
中のプロゲステロンに結合されていない試験スポット１
．２及び３上のいずれかの抗体に結合する。標識された
プロゲステロンを１分間反応させ、膜を再び洗浄溶液で
洗い、次いで、３〜４滴の色原性基質であるテトラメチ
ルベンジジンを加え、１分間、発色反応させる。次いで
、免疫分析を完了させる標準停止溶液を、１０〜１５滴
添加する。

第３図は、徐々に濃度を上げた、四種類の異なる、ウマ
プロゲステロンを含む溶液で実施した試験の結果を例示
する。７個の膜の各々に示されている、スポットＣは、
試料中のプロゲステロンの濃度に無関係に同程度の色の
変化を受けている。

膜Ａでは、１単位（１ｎｇ／ｍｕ未満のプロゲステロン
を含む試料で処理されたものであり、標準スポットＣは
、３個の試験スポット総てよりも明るい。膜Ｂでは、１
単位のプロゲステロンを含む試料で処理されたものであ
り、標準スポットＣは、試験スポット１と同程度の着色
を示すが、スポット２及び３よりも明るい。膜Ｃでは、
１乃至５単位の間のプロゲステロンを含有する試料で処
理され゛たものであり、スポットＣは、スポット１及び
・２よりも明るいが、スポット３よりも暗い。膜りでは
、５単位のプロゲステロンを含有する試料で処理された
ものであり、標準スポットＣは、スポット２と同程度の
着色強度を有し、スポット１よりも暗く、そしてスポッ
ト３よりも明るい。膜Ｅでは、５乃至１０単位のプロゲ
ステロンを含有する試料で処理されたものであり、スポ
ットＣは、スポット１及び２よりも暗く、スポット３よ
りも明るい。膜Ｆでは、１０単位のプロゲステロンを含
有する試料で処理でされたものであり、スポットＣは、
スポット３と等しい強度であるが、スポットｌ及び２よ
りも暗い。膜Ｇでは、１０単位を超えるプロゲステロン
を含有する試料で処理されたものであり、スポットＣは
、３個の試験スポット総てよりも暗い。

第４図では、同じ濃度のプロゲステロンに対して異なっ
て反応する試験スポット１．２及び３の容量を例示する
。第４図は、各スポットに対して、着色強度の直線状の
減少を生ずるのに、試料中に異なる濃度のプロゲステロ
ンが必要であることを示す。第４図は、試験スポット１
が、５０単位から２０単位への着色強度の下降が１乃至
５　Ｎ／ｍｕのプロゲステロンの濃度に互って実質的に
直線状であるように充分な抗体を含有し、試験スポット
２の５０単位から２０単位への着色強度の下降が５乃至
１０ｎｇ＃ａｌｌのプロゲステロンの濃度に互って実質
的に直線状であり、そして試験スポット３の５０単位か
ら２０単位への着色強度の下降がｌＯ乃至＋ｓｎｘ／ｍ
Ａのプロゲステロンの濃度に互って実質的に直線状であ
ることを示す。

従って、各試験スポットの着色強度と標準スポットの着
色強度との比較が、試験試料中のプロゲステロンの量の
半定量的指標を与える。これはこのホルモンに対して非
常に重大なことである。何故なら、このホルモンのレベ
ルが、ウマの発情期の兆候として及び妊娠の維持の指標
としても役立つからである。妊娠した雌ウマの場合に、
約４ｑｇＺｍαを超える血清プロゲステロンレベルは、
妊娠が維持されていることを示すが、４ｎに／ｍ１未満
のレベルは、妊娠の維持に問題があるかもしれず、救済
処置を必要とするかもしれないことを示す。

妊娠していない雌ウマの場合には、約１　ｎｌ／ｍＱ未
満の血清プロゲステロンレベルは、発情期、即ち、雌ウ
マが受精する準備ができていることを示す。

これらの−設面な基準に加えて、どの雌ウマもそれ自身
特有の生理を持つので、受精する与えられた雌ウマに対
して、一定期間に互ってプロゲステロンのレベルを追跡
し、その雌ウマのホルモンサイクルの経時的像を得るこ
とが重要であり、その結果、受精と妊娠維持を最適化で
きる。

上述したように、各試験スポットは抗体よりむしろプロ
ゲステロンゼを含有でき、その場合、プロゲステロンに
対する、榎識された抗体が使用される。

単一スポット競合分析の操作 膜１８が、試料中のプロゲステロンレベルが生理学的に
意味のあるレベルであるときにのみ意味のある着色変化
を受けるような量のプロゲステロン又は抗プロゲステロ
ン抗体を含む単一の試験スポットのみを持つ場合、分析
は、膜１８が単一の試験スポットを持つ以外は、上述し
たように実施する。

サンドイッチ免疫分析装置 膜１８を第５図に示した膜３８に代えること以外は、第
１図に例示した装置を、サンドイッチ分析にも使用する
。膜３８は、子ウマ血清中のウマＩｇＧの半定量的測定
を与えるようになっている。膜３８を含む装置は、アグ
リテック・システム・インク（Ａ（ｒｉｔｓｃｂ　５ｙ
ｓｔｅ＋ａ、　Ｉｎｃ、）、１００フオア・ストリート
、ポートランド、メーン、から入手でき、商標ＣＩＴＥ
で市販されている。位置決めマーク４０の下に位置する
膜３８上のスポットＣは、ウマＩｇＧに対する抗体（ジ
ャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｂ）、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　　６８３
、工−ボンダール、ＰＡ）で被覆されたラテックス粒子
からなる。校正スポット１，２及び３は、抗ＩｇＧ抗体
を含有しないが、各々、ラテックス粒子上に被覆されて
いる、２００　ｍｇ／ｄｌｌ、　４００　ｍｇ／ｄｌｌ
及び８００　Ｂ／ｄｌｌ試料からのスポットＳより獲得
された量に等しいウマＩｇＧを含有する。ウマＩｇＧ４
゛二対する抗体は、又、多くの入手源から商業的に入手
できるが、ウマプロゲステロンに対して上述したように
、ラテックス粒子上に添加される。

半定量サンドイッチ分析の操作法 膜３ｓを含む、第１図の装置は、子ウマから採取した血
清、血漿又は抗凝血処理済全血試料と一緒に使用される
。°子つマ中のへマドクリットの変動性のため、血清又
は血漿を使用することが最も好ましく、それらは、新鮮
なものでも予め凍結されているものでもよい。全血を使
用する場合は、分析する前に、ヘパリン、ＥＤＴＡ又は
クエン酸塩で抗凝血処理をしなければならない。溶血化
させられた試料を、偽陽性の危険性なしで使用できる。

子ウマから２マイクロリツトルの血清又は血漿をマイク
ロリットル・キャピラリー・ピペット中に流させ、過剰
の試料をピペットの外側より拭き取る。次いで、試料を
、試料希釈剤として、５％ＢＳＡを含有する標準燐酸塩
緩衝液の入った容器に入れ、混合し、次いで、ピペット
で、希釈した試料の１０滴を第１図の分析装置の中心に
添加する。

試料を、３分間、膜３８と反応させ、その後、酵素アル
カリホスファターゼに複合させた、第二の抗つマＩｇＧ
抗体を含有する溶液４滴を添加する。

（アルカリホスファターゼに複合させた、抗つマＩｇＧ
抗体はジャクソン・イムノリサーチ、エーポンダール、
ＰＡ、から入手できる。）この第二の標識した抗体は、
標準スポットＳにより獲得されたウマＩｇＧに結合し、
そして、又、スポット１．２及び３上に予め被覆したウ
マＩｇＧにも結合する。反応を、２分間、進行させ、そ
の時後、洗浄溶液（前記した組成物）５〜１０滴を添加
する。次いで、洗浄溶液で容器１２を殆ど満たし、そし
て、洗浄溶液を吸収剤１４により、完全に吸収させＩ；
（この時点で、酵素複合溶液からの青色を完全に洗い落
とさなければならない）後、アルカリホスファターゼに
対する色厚性基質（インドキシル・ホスフェート、ＪＢ
Ｌサインティフィック、ＣＡ）を４滴添加する。着色が
完全に起こるように、基質溶液を３分間放置し、その時
後、膜３８を検査し、その結果、試料中のＩｇＧレベル
を決定できる。

２８６図は、６種類の異なる濃度のウマＩｇＧで得られ
た結果を例示する。Ａ乃至Ｆの６枚の膜の各々で、校正
スポット１．２及び３は同じように反応した。即ち、ス
ポット１　（２００ｍｇ／ｄＱＩ　ｇＧに相当）が最も
明るく、スポット２　（４００ｍｇ／ｉＩｇＧに相当）
がその次に明るく、そしてスポット３　（８００＋＋ｇ
／ｄｌｌＩ　ｇ　Ｇに相当）が３スポツトの中で最も暗
い。上述したように、各スポットはＩｇＧを含有するが
、しかしＩｇＧに対する抗体を含有しないので、各スポ
ットの強度は試料中のＩｇＧ濃度に無関係である。膜Ａ
では、試料スポットは白色のままか、校正スポット１よ
りも薄い着色である。これは、試料が２００　ｍｇ／ｄ
αウマＩｇＧよりも少なくしか含有しないことを示す。

膜Ｂでは、試料スポットは校正スポット１よりも暗いが
、校正スポット２よりも明るい。これは、２００と４０
０　ｍｇ／ｄｉの間のＩｇＧ濃度であることを示す。膜
Ｃでは、試料スポットは校正スポット２と等しい着色強
度であり、４００　ｎ＋ｇ／ｄｌｌのＩｇＧ濃度である
ことを示す。膜りでは、試料スポットは校正スポット２
よりも暗いが、校正スポット３よりも明るく、４００と
８００　ｍｇ／ｄＱの間のＩｇＧ濃度であることを示す
。膜Ｅでは、試料スポットはスポット３の強度と等しく
、１１００　ｍＫ／ｄＱのＩｇＧ濃度であることを示す
。そして、膜Ｆでは、試料スポットは校正スポット３よ
りも暗く、８０Ｇ　＋ｎｔ／ｄαよりも濃いＩｇＧ濃度
であることを示す。

例証しｔ；試験は、子ウマの免疫状態をモニターするの
に非常に重要である。子ウマは小さく生まれ、循環免疫
グロブリンがない。感染因子に対する新生児免疫は初乳
から母性の抗体を摂取・吸収する必要がある。未熟な授
乳、不充分な吸い込み、吸収不良、又は初乳中のＩｇＧ
の低レベルの結果として、受動的な伝達の不全が起こる
可能性がある。免疫伝達の部分的又は完全な不全は、総
ての子ウマのうち１０〜２５％に起こり、そして、これ
らの動物は重篤な病気又は死亡の高い危険性がある。１
００　ｎｉｌの血清当たり８０Ｇ　ＩＩ＋ｇのＩｇＧを
超える量は、免疫の適切なレベルと考えられる。４００
〜１００　ｍｇ／ｄｌのレベルが適切かもしれないが、
しかし、このレベルの子ウマには危険性のある可能性が
ある。２００〜４０Ｇ　＋ｎｇ／ｄａのＩｇＧレベルは
免疫伝達の部分的不全をもたらすが、２００　＋＋＋ｇ
／ｄＱ未満の濃度では完全不全が示唆される。低ＩｇＧ
レベルの迅速確認は、免疫不全子ウマの早期治療に欠く
ことができない。更に、治療後の試験は、ＩｇＧ補給の
成功度の適時の評価ができる。

半定量用サンドイッチ免疫分析装置 （別の配置） 第７図を参照すると、別の半定量免疫分析は、第１図の
装置、及び上述した膜３８（第５図）を膜４２に変えた
ものを使用する。膜４２は、位置決めマ−り４４、陽性
対照スポットＣ１並びに試験スポット１及び２を持ち、
子ウマ血清中のＩｇＧレベルを推定するために使用する
ようになっている。試験スポットｌは、抗つマＩｇＧ抗
体で被覆されたラテックス粒子約６０％（他の４０％は
ＢＳＡ被覆処理粒子）を含有するが、試験スポット２は
約５％の抗体被覆処理ラテックス粒子を含有する。スポ
ット１の高濃度の抗体のため、好ましい反応速度論があ
てはまり、実質的（５０％を超えるポテンシャル）な着
色反応は、４００　ｍｇ／ｄｌｌＩ　ｇＧ未満の存在で
さえ起こる。スポット２の低濃度の抗体からもたらされ
る好ましくない反応速度論のため、４００ｍｇ／ｄａ未
満のＩｇＧ濃度の試料は、実質的な着色を発せず、かか
る発色のために高濃度が必要である。

陽性対照スポットＣは、子ウマＩｇＧに対する抗体を含
有しないが、ＨＲＰに対する抗体をで被覆されたラテッ
クス粒子のみを含有し、スポット３４の唯一の機能は、
色原性システムが操作可能であることの指標として役立
つことである（スポット３イに着色しないことは分析に
欠陥があることを示す）。

別のサンドイッチ免疫分析の操作 膜３８の代わりに膜４２（第７図）を使用した以外は、
ウマＩｇＧのための上述のように別のサンドイッチ免疫
分析を実施する。

分析の典型的な結果を第８図に示す。３枚の膜ＡＳＢ及
びＣの総てで、陽性対照スポットＣは暗色を呈し、分析
試薬が操作可能であることを示す。

膜Ａでは、試験スポット１及び２のどちらも発色せず、
試料中に子ウマＩｇＧが存在しないことを示す。膜Ｂで
は、試験スポット１（これは重度に抗体が付加されてい
る）は暗色を発するが、試験スポット２（より少ない抗
体を有する）は僅かの着色のみを発し、幾らか低レベル
、例えば、４００ｍｇ／ｄα未満の程度のＩｇＧが試料
中に存在することを示す。膜Ｃでは、両試験スポット１
及び２が暗色を呈し、試料が高濃度、例えば、４００　
ｔａｇ／ｄ（ｔを超えるＩｇＧを含有することを示す。

特許請求の範囲に、その他の実施態様がある。

例えば、多様な標準スポット、試験スポット、又は校正
スポットがある上述の分析のいずれかにおいて、例で例
証されているよりも多くのスポットがあってもよい。更
に、−枚の支持体膜は、一種以上の分析対象物の測定に
適する抗原又は抗体を有することができ、その結果、例
えば、二種若しくはそれ以上の薬物、トキシン、タンパ
ク質又は抗体を同時に総てを検出できる。種々の標識の
いずれかを、ラジオアイソトープ等の機械読みできる信
号発生システムを含んで使用できるが、結果を読むため
の装置の使用を避けるので、酵素色原システムが最も好
ましい。膜を、その他の天然または合成繊維（例：ナイ
ロン）から作ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の使用のための装置の分解図である。 第２図は、標準領域及び３箇所の試験領域を有する、競
合免疫分析に使用するための、本発明の固体支持体（第
１図の１８）を示す線図である。 ｖｇ３図は、試料中の種々の濃度の物質に対する第２図
の固体支持体の反応を示す線図である。 第４図は、物質（ウマプロゲステロン）の濃度の変動に
対する第２図の支持体の３箇所の試験領域の反応を示す
グラフである。グラフ中、縦軸は着色強度であり、横軸
は濃度である。 第５図は、本発明のサンドイッチ免疫分析に使用するた
めの膜を示す線図である。 第６図は、第５図の膜を使用して得られた分析結果を示
す線図である。 第７図は、本発明のサンドイッチ免疫分析に使用するた
めの、膜を示す線図である。 第８図は、第７図の膜を使用して得られた分析結果を示
す線図である。 図中、ｌＯ・・試験装置、！２・・カップ、１８・・膜
、２６・・プレフィルタ−１３０・・蓋、及び３２・・
スポンジ手段である。 図面の、７）書（内容に変更なし） ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、６ ｆ・続補正書 平成　元年　３月２０１１ 特許庁長官　　　吉　（ｉ）文　毅　　殿１．１件の表
示 ２、発明の名称 免疫分析用キット ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　アイデックス・コーポレーション新大手町ビ
ル　２０６区 適正な図面 ム嵩−′

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、競合免疫分析で検出可能な信号を与える標準領域、
   及び 液状試料に接触して露出されている第一及び第二試験領
   域を有する固体支持体を含んでいる、特異結合対の第一
   構成員の競合免疫分析による、液状試料中の半定量測定
   のためのキットであつて、 前記各試験領域が、特異結合対の異なる量の第二又は第
   一構成員からなり、 それにより、試料中の未知量の第一構成員の存在下で、
   標準領域からの検出可能な信号の強度と第一及び第二試
   験領域からの検出可能な信号の強度とを比較できること
   を特徴とする前記キット。 ２、競合免疫分析で検出可能な信号を与える標準領域、
   及び 特異結合対の第二構成員を含む試験領域を有する固体支
   持体を含んでいる、特異結合対の第一構成員の予め決め
   られた、生理学的に意味のある量よりも多量か又は等し
   い量の液状試料中の存在の、競合免疫分析による測定用
   キットであって、 試験領域が試料中の第一構成員のより高い濃度でより低
   い強度の検出可能な信号を発生するようになっており、 第二構成員は、試験領域中に、 （ｉ）免疫分析で、特異結合対の前記第一構成員が、予
   め決められた、生理学的に意味のある量と等しいか又は
   それより多量で試料中に存在する場合、標準領域の信号
   強度よりも相当に低い強度の検出可能な信号を試験領域
   に発生させ、そして （ｉｉ）免疫分析で、特異結合対の前記第一構成員が、
   予め決められた、生理学的に意味のある量よりも少ない
   量で試料中に存在する場合、標準領域の信号強度よりも
   相当に低い強度の検出可能な信号を試験領域に発生させ
   ない 量で存在することを特徴とする前記キット。 ３、（ｉ）前記試験領域が結合対の第二構成員を含む場
   合、前記特異結合対の標識された第一構成員を更に含む
   か、又は （ｉｉ）前記試験領域が結合対第一構成員を含む場合、
   標識された第二構成員を更に含む、 請求項１又は２に記載のキット。 ４、前記競合免疫分析が酵素免疫分析であり、前記特異
   結合対の酵素標識第一構成員が前記試料中に存在する前
   記特異結合対の第一構成員と、前記固体支持体上で、前
   記特異結合対の第二構成員への結合に対して競合し、そ
   して前記標準領域が前記酵素に対する抗体を含みかつ前
   記特異結合対の第二構成員を含まない、請求項１又は２
   に記載のキット。 ５、前記競合免疫分析が酵素免疫分析であり、前記支持
   体に固定化された前記特異結合対の第一構成員が試料中
   の前記特異結合対の第一構成員と、前記特異結合対の酵
   素標識第二構成員への結合に対して競合し、そして前記
   標準領域が前記酵素に対する抗体を含みかつ前記特異結
   合対の第一構成員を含まない、請求項１又は２に記載の
   キット。 ６、（ｉ）試料が第一範囲の量で前記特異結合対の第一
   構成員を含有する場合、前記第一試験領域により発生し
   た信号の強度が実質的に直線状であり、そして （ｉｉ）試料が第二のより大きい範囲の量で前記特異結
   合対の第一構成員を含有する場合、前記第二試験領域に
   より発生した信号の強度が実質的に直線状である、 請求項１記載のキット。 ７、前記特異結合対の第一構成員がウマのプロゲステロ
   ンである請求項１記載のキット。８、分析対象物に対し
   て特異的な第一抗体を含む試験領域、並びに 各々が異なる量の分析対象物を含有する、第一及び第二
   校正領域わ有する固体支持体を含んでいる、分析対象物
   のサンドイッチ免疫分析による、液状試料中の半定量測
   定のためのキットであって、 前記試験領域からの検出可能な信号の強度を、試料中の
   未知量の存在下で第一及び第二校正領域からのいずれか
   の検出可能な信号の強度と比較できることを特徴とする
   前記キット。 ９、分析対象物に対して特異的な第一抗体を各々が異な
   って量で含有する第一及び第二試験領域を有する固体支
   持体を含む、分析対象物のサンドイッチ免疫分析による
   、液状試料中の半定量測定のためのキットであって、 第一量の分析対象物の試料中の存在が、第二試験領域で
   はなくて第一試験領域の信号強度に実質的な変化をもた
   らし、そしてより多量の第二量の分析対象物の試料中の
   存在が第一及び第二試験領域の双方の信号強度に実質的
   な変化をもたらすことを特徴とする前記キット。 １０、前記分析対象物に対して特異的な、第二の標識さ
   れた抗体を更に含む請求項８又は９に記載のキット。