JPH0346561A - 分析物検出のための方法、試薬及び試験ストリップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の対象は、分析物測定のための方法並びに、この
方法に使用することができる試薬である。

〔従来の技術〕

分析物の測定は、とシわけ臨床診断学の場合に普及して
いる関心事である。そのために、以前は、達成可能な高
い正確度及び幅広い利用可能性のために、免疫学的反応
工程を含む特別な方法が用いられた。容易に取り扱える
という利点から、固体担体に結合した、免疫学的反応成
分を用いてこのような方法が実施されることに（ろ） １す１す移行する。例えば、この方法は、完全な一連の
反応が専ら試料をストリッツ０と接触させることによっ
て進行する試験ストリップの使用を可能にする。

免疫学的測定方法は、関与した反応成分の種類に基づき
種々に分類することができる。これらのうちの１つは、
いわゆる競合的追出し試験（ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　
Ｖｅｒｄｒａｅｎｇｕｎｇｓｔｅｓｔｓ）の類である。

この場合、標識化された抗体が結合し、かつ固定化され
た抗原は、試料と接触させられる。

固定化された抗原は、平衡反応の際に分析物が存在する
場合には標識化された抗体を有する免疫複合体から追出
される。従って、以前に固定化され、標識化された抗体
は、測定すべき分析物を有する複合体として液相に移行
し、かり固相からの液相の分離後、自らの標識化によシ
測定されることができる。これによシ、試料中の分析物
の濃度を確認することができる。

このような免疫試験は、例えば欧州特許出願公開第０１
７３３７５号明細書に記載されてい（４） る。標識化された抗体として、標識化されたＦａｂフラ
グメントが使用され、この場合、抗体は試験開始時に複
合体中に固定化されている分析物と共に存在する。

米国特許第４４３６２３６号明細書には、類似した方法
が記載されているが、固定化された抗原が使用されて訃
り、この抗原は標識化された抗体に対して分析物よシ劣
る親和性を有する。

この方法の場合にも有利に標識化された抗体フラグメン
トが使用される。

欧州特許出願公開第［１１７３３７５号明細書及び米国
特許第４４３６２３６号明細書に記載の方法には、分析
物が試料中に存在しない場合であっても、これらの方法
は測定の高い盲検値（Ｌｅｅｒｗｅｒｔｅ）を示すが、
しかしながら、信号値は比較的僅かであるという欠点余
有する。

米国特許第４２７７５６０号明細書には、１つの免疫検
定法（工ｍｍｕｎｏａｓｅａｙ）が記載されておシ、こ
の場合、標識化された分析物は固定化された抗体によっ
て可逆的に固相に結合されている。標識化された分析物
は、試料中に含有された分析物によって固相から追出さ
れ、かつこの後に、測定すべき分析物の量の尺度として
使用されることができる。この方法には欠点があり、即
ち、結果の正確度が著しく固相の積載の均一性に依存し
ている。十分な正確度は著しく達成し難い。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の課題は、公知技術水準の方法の欠点、
とくに比較的高い盲検値及び製造の際の出費の多い手段
が回避される分析物測定のための方法を提供することで
あった。方法は、正確かつ容易に自動化可能であるべき
であった。

〔課題を解決するための手段〕

この課題は、試料液体を固定化された分析物もしくは分
析物類似物及び標識化された抗体と接触させることによ
る液体試料中での分析物測定方法によジ解決され、この
場合、抗体は、測定すべき分析物並びに固定化された分
析物もしくは固定化された分析物類似物と免疫学的反応
を起こすことができ、かつ固定化された分析物ないしは
固定化された分析物類似物に結合することによって固定
化されてかり、また、この方法は、標識化された抗体が
標識化１回につき少なくとも４つの結合箇所を分析物な
いしは分析物類似物に対して有することを特徴とする。

〔作用〕

同様に本発明の対象は、上記方法を実施するための試薬
である。

本発明による方法で確実に使用可能な分析物は、殊に抗
原又はハシテンである。測定は定性的に行なうことがで
き、すなわちこれは分析物が試料中に存在しているか否
かを確認するために定性的に行なうことができる。しか
しながら、この測定は定量的にも試料中の分析物の濃度
もしくは量の測定に利用することができる。液体試料は
、有利に水溶液、懸濁液又は乳濁液である。この試料は
、とくに有利に体液又は体液に由来する液体、例えば血
液、血清、血漿もしくは尿である。

（７） 分析物の濃度は、本発明の方法により　１０−９〜１０
　’　ｍｏｌ／　１．有利に１０−８〜１０−６ｍｏｌ
　／　ＩＩの範囲内に決定されることができる。

とシわけ有利なのは、いわゆる高濃縮された分析物の測
定であシ、このようなものとは１０−８ｍｏｌ　／　ｌ
よシ高い濃度範囲内の分析物である。

尿中のこのような分析物の例は、アルブミン又はα１−
ミクログロブリン（α１Ｍ　）である。

分析物類似物とは、分析物に免疫学的に類似している化
合物のことである。類似物は構造的に多少分析物とは異
なるが、分析物に対する抗体によシ認識される。例えば
本発明の範囲内でこのような分析物類似物が使用される
のは可能であシ、この場合、類似物は標識化された抗体
によって分析物そのものよシも強く結合される。

この場合、盲検値、即ち分析物が存在しない状態での測
定値はとりわけ低い。このような分析物／分析物類似物
の組合せの例は次の通シである：豚アルブミン／ヒトア
ルゾミン、猿アルゾミン／ヒトアルゾミン。

（８） 固定化された分析物ないしは分析物類似物は、固相に結
合された分析物ないしは分析物類似物である。結合は、
共有結合、沈降性結合、特定の相互作用による結合又は
吸着性結合であることができる。これらの結合種類のい
ずれもが使用することができるが、但し、分析物ないし
は分析物類似物が大したことのない程度で固相から分離
することが保証される場合である。いずれの結合種類に
ついても公知の方法が当業者の自由な使用に提供されて
いる。固相の種類は、分析物ないしは分析物類似物の結
合種類によって決定される。分析物が共有結合されてい
る場合、例えば、反応性基を有する固相が使用されねば
ならない。特定の相互作用による結合の場合、ビオチン
／ストップタビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖ：１ｉｎ）によ
る結合が有利である。さらに、例えば固相にはストレプ
タビジン含有の被膜が備えられ、かつ上記固相に結合さ
れた分析物ないしは類似物は、ビオチンに結合される。

ストレプタビジンとビオチンによる正に固い結合が生じ
る。固相は、粒子、紙、フリース材料、膜、織物、さら
にキュベツト、微量滴定プレー）　（Ｍｉｋｒｏ−ｔｉ
ｔｅｒｐｌａｔｔｅ）等の形で存在できる。検出方法を
試験ストリツ！上で実施すべき場合には、吸収力のある
フリースが有利である。

標識化された抗体は、本発明による方法の場合、測定す
べき分析物並びに固定化された分析物ないしは分析物類
似物と免疫学的反応を起こすことができる抗体である。

分析物ないしは分析物類似物に対する抗体は、公知の方
法によシ得ることができ、かつ選択することができる。

ポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体を使用す
ることができる場合、モノクローナル抗体が有利である
。

標識化には、抗体の存在を定量的にか又は定性的に検出
することのできる物質のいずれもが使用されることがで
きる。適当な標識は、例えば酵素、金属、放出もしくは
吸収が光又は放射線によって測定されることのできる基
或いは化学反応もしくは免疫学的反応によってこのよう
な基に変化させることのできる基である。当業者は自由
に標識を選択することができる。標識の条件は、この標
識に抗体の複数の結合箇所を固定することが可能でなけ
ればならないことである。従って、標識は有利に反応性
基、例えばヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基又は
カルボキシル基を有し、この場合、上記の基は抗体と直
接もしくは間接に結合されることができる。

標識として適当な酵素は、例えばヒドロラゼ、例えばβ
−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼ、例えばＰＯ
Ｄである。

金属、特に、極めて微細に分割された粒子状、例えばコ
ロイド状のものは、例えば金を含む。

このような標識は、例えば欧州特許出願公開第０２５８
９６３号明細書に記載されている。

蛍光化合物は、例えばレゾルフィンであシ、色素化合物
は、例えばフイコエリトリン、着色ラテックス粒子及び
着色テルル及びセレノキシドである（欧州特許出願公開
第０２９８３６８号（１１） 明細書）。有利な標識剤は酵素及び金属であり、殊に酵
素である。本発明による方法の標識化された抗体は、技
術的現状に訃いて挙げられる抗体とは矛盾して、少なく
とも４、有利に６〜１２個の結合箇所を分析物ないしは
分析物類似物に対して有する。このような標識化された
抗体を次に標識化された低原子価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅ
ｎｔｅｒ）抗体として記載する。

標識化された低原子価抗体を抗体と標識から得るために
、有利に標識は複数の抗体と反応させられ、この場合、
抗体は（Ｆａｂフラグメント又は工ｇＧのようによシ少
ない結合箇所、例えば１個もしくは２個の結合箇所を有
する。

標識化された低原子価抗体を得るための方法の場合、さ
ｌざまな数の多数の結合箇所を有する標識化された抗体
の混合物もしばしば生じる。

この混合物から、標識化された抗体の混合物を単離する
ことができ、この場合、上記混合物は、一定の結合箇所
数、例えば標識化１回につき４〜７個の結合箇所を有す
る標識化された抗体の（１２） 混合物である。この混合物は、本発明による方法で有利
に使用されることができるが、但し、この混合物が主と
して標識化１回につき少なくとも４つの結合箇所を有す
る標識化された抗体を含有する場合に眠る。

酵素標識化された抗体にとって、５個の工ｇＧ又は１０
個のＦａｂフラグメントの酵素への結合がとくに有利で
ある。

このような標識化された低原子価抗体の製造は公知であ
υ、例えばＥｎｚｙｍｅ工ｍｍｕｎｏａｓｓａｙのキチ
ガワ（Ｋｉｔｉｇａｗａ）担当部分（工ｓｈｉｋａｗａ
。

Ｋｕｗａｉ、　Ｍｉｇｕｉ編：工ｇａｋｕ　５ｈｏｉｎ
　Ｔｏｋｙｏ　／　ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）、８１
〜８９頁）に記載されている。

有利に本発明による方法で固定化された分析物ないしは
分析物類似物と標識化された抗体からの混合物は、上記
成分からの固定化された免疫複合体として使用される。

免疫複合体を含有するこのような固相は、標識化された
抗体を、試験分析物によってこれを追出せる状態で含有
しており、かつ以下では追出しマトリックスとも呼ばれ
る。

製造のために既に固定化された分析物ないしは分析物類
似物と標識化された抗体から免疫学的反応に訃いて１ｍ
ｌｍ比定れた免疫複合体が形成される。

このような追出しマトリックスの別の方法もしくは製造
は、分析物ないしは類似物に対する固相への分析物ない
しは分析物類似物と抗体間の免疫学的沈降反応の実施で
ある。引続き、このマトリックスは標識化された抗体と
反応させられる。このような方法は、例えば欧州特許出
願公開第０３１２９０７号明細書に記載されている。

ビオチン／ストップタビジンのように特定の相互作用に
よって分析物ないしは分析物類似物の固定化を行なうべ
き場合、ビオチニル化分析物又はビオチニル化分析物類
似物は、免疫学的反応の際に標識化された抗体と、可溶
性の免疫複合体へと反応させられ、かつさらに、ストレ
プタビゾンで塗布された固相と接触させられることがで
きる。液相の分離後、洗浄工程なしでも追出しマトリッ
クスが得られ、このマトリックスは実際、複合化されず
標識化されなかった抗体ないしは余った標識によってで
はなく不純化されている。しかし、最初の反応の際にビ
オチニル化分析物又は分析物類似物をストレプタビジン
で塗布された固相と接触させることも可能である。

とりわけ成分の次のような量の割合は有利であると証明
された：測定すべき分析物濃度が高いほど、固定化され
た分析物／分析物類似物の量は高くなる。標識化された
抗体の量が分析物ないしは分析物類似物の量に比例させ
て少なく選択された場合、多くの場合に３いてこの方法
は役に立ち難いものとなる。

固定化された分析物ないしは分析物類似物の量は、とく
に１　ｎ、９〜０．１　ｍ９／　マトリックスｃｆｎ２
、ことに０．１μｇ〜１０μｇ／マトリックスｃＩｒＬ
２である。標識化された抗体の量は、１〜１０口口（１
５） ｍＵ　／　マトリックスｃＩｒＬ２、ことに１０〜５０
０ｍＵ　／マトリックスｃＩｒＬ２である。

本発明による方法の実施は、一般に競合的追出し試験に
よって公知の原理と同様にして行なわれるが、しかしな
がら本発明による追出しマトリックスの使用下で行なわ
れる。

この方法は、少量の試料量の測定に好適である。常用の
試験ストリップを用いての検査に適当なのは、とくに試
料容量５μｌ〜ｉ　ｍ／である。

容量は使用されたマトリックスの吸収力に依存している
。有利に試料容量はマトリックスの吸収量を超過しない
。

本発明による方法開始時に、試料一定量は固定化された
分析物もしくは分析物類似物及び標識化された抗体と接
触させられ、一定時間そこに置かれる。この時間の間に
試料中に測定すべき分析物が存在する場合には標識化さ
れた抗体を有する免疫複合体から固定化された分析物も
しくは固定化された分析物類似物の競合的追出しが行な
われる。分析物と標識化された抗体か（１６） ら可溶性の免疫複合体が形成される。よシ多くの分析物
が試料中に存在するほど、よう多くの可溶性の免疫複合
体が形成される。従って、分析物の量を、固相上に残留
している標識化された抗体の量又は液相中に存在してい
る標識化された抗体の量から測定することが可能である
。

このために、液相は固相から少なくとも部分的に分離さ
れている。さらに、両方の相の中ないしは表面の標識の
量が常法で測定される。標識が酵素である場合、相は、
酵素反応に適当な条件下で基質と反応させられる。反応
させた基質の量は、同様に試料中の分析物の量の尺度で
ある。

既知の分析物濃度の試料を用いた本発明による方法を実
施することによって、較正曲線が得られ、この場合、該
曲線からこれまで未知の分析物含有量の試料中の分析物
濃度を、上記の方法によって得られた測定値から読み取
ることができる。

この方法は、種々の変法において実施されることができ
る： １つの実施態様の場合、固定化された分析物ないしは分
析物類似物及び酵素標識化された抗体を含有する試験領
域を有するエツペンドルフの容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ｈｕｅｔｃｈｅｎ）に分析物含有の試料がピペットで入
れられる。例えば５分間の振盪の後、溶液の一部はキュ
ベツトに移され、この場合、該キュベツトには酵素に対
する色原体基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　８ｕ’ｂｓ
ｔｒａｔ）が入っている。

色形成速度は、生じた有色生成物が吸光する波長での吸
光度測定によって測定される。

別の実施態様の場合、上記の試験領域を有するキュベツ
トに試料が混入され、この混合物は一定時間、恒温保持
され、液相はキュベツトから除去される。この後に、液
相の残シの完全な除去のための洗浄工程が続くことがで
きる。引続き、標識酵素に対する色原体基質の溶液がキ
ュベツトに入れられる。この方法の場合でも、変色が測
定される。しかしながら、上記の実施態様とは異なシ、
よシ多くの分析物が試料中に存在した場合はど、色変化
はよシ小さい。

とくに有利な実施態様は、第１図のクロマトグラフィー
用ストリップである。ストリップ１は、基礎シート２か
ら構成され、この場合、基礎シート上に吸収フリース３
、追出しマトリックス４及び基質フリース５が吸収性で
相互に結合して取付けられている。ストリップ１は、フ
リースのうち吸収フリース３のみが試料と接触するよう
に試料液体に入れられる。吸収フリースを使用すること
は、とりわけ有利であるが、絶対に必要というわけでは
ない。試料は、吸収フリースから追出しマトリックス４
に吸収される。この追出しマトリックスは、例えば吸収
力のあるフリースであシ、この場合、フリースに分析物
もしくは分析物類似物が固定化されて釦シ、かつこのフ
リースは標識化された抗体を固定化された分析物ないし
は分析物類似物を有する免疫複合体の形で含有する。測
定すべき分析物は、この方法の場合でも固定化された分
析物ないしは分析物類似物を標識化された抗体を有（１
９） する免疫複合体から追出す。このようにして生じた可溶
性の免疫複合体は試料液体と一緒に領域５中に流れ、こ
の場合、この領域には酵素標識に適当な色原体基質が含
浸させた状態で存在する。基質領域５中で、変色が測定
される。必要に応じて追出しマトリックス４と基質領域
の間に緩やかな吸収性の布地が液体の流れを減速させる
ために取付けられることができる。

もう１つの実施態様は、第２図の試験ス）　ＩＪツブ１
０である。

基礎シート１１上に、固定化された分析物ないしは分析
物類似物及び標識化された抗体を含有する追出しマトリ
ックス１２が固定されている。基礎シートに、例えば接
着箇所１３を介して少なくとも部分的に透明で可動のフ
ラップ１４が取シ付けられている。フラップの追出しイ
ルム１５は、フラップがマトリックス１２上に下がるこ
とによう圧せられ、これにより測定（２０） の反応が開始する。この試験ストリップを用いた試験は
、なかんず〈光度的並びに反射性成分を付加的に使用し
た場合には反射光度的に評価されることができる。

本発明による方法は、次のような利点を有し、この利点
とは、盲検値が測定信号と比べて比較的小さいことであ
る。さらに、技術の現状から公知の、使用した標識化さ
れた抗体の不純物を有する競合的追出し試験の場合、結
合しない不純物、例えば余分の標識剤を計算に入れなけ
ればならないことが判明した。この不純物は、例えば技
術現状に３ける固定化された分析物ないしは分析物類似
物と標識化された抗体からの免疫複合体を含有する追出
しマトリックスを試験実施前に洗浄することによう除去
されなければならない。本発明の方法による標識化され
た抗体中の標識剤に対する結合箇所の有利な比によって
、反応した標識剤による不純物が著しく回避される。本
発明による方法の別の利点は、とりわけ少ない工程及び
とシわけ少ないマトリックスを含むことである。これに
よシ浪費的かつ経費集約的並びに時間集約的段階がなく
なる。

同様に本発明の対象は、試料中の分析物測定のための本
発明による方法の実施用の試薬であシ、この場合、試薬
は固定化された分析物もしくは固定化された分析物類似
物及び標識化された抗体を含有し、この場合、抗体は測
定すべき分析物並びに固定化された分析物もしくは固定
化された分析物類似物と免疫学的反応を起こすことがで
き、かつ標識化された抗体は標識化１回につき少なくと
も４つの結合箇所を分析物ないしは分析物類似物に対し
て有している。

〔実施例〕

次に、本発明を例につき詳説す、る。

例　　１ アルジミンの測定 １、　追出マトリックスの製造 ０　ヒト血清アルジミン（Ｈ８Ａ）のジスクシニジルス
ベレー）　（ＤＢＳ）によるポリヒト血清アルブミン（
ｐＨ８Ａ）への架橋 ｎ５Ａ１．５Ｊ９を燐酸カリウム緩衝液（２００ｍＭ、
ｐＨは８．０である）３３ｍｌ中に入れ、かつこれを２
時間以内にジオキサ７１ｍ１当りＤＳ８５０■からの溶
液２．５ｍｌを混入した。架橋反応が進行した後、５０
０倍容量の燐酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ１ＰＨ７，２
）に対して透析した。６５０口０ロダルトン以上の分子
量を有する高分子画分（ｐＨ８Ａ）をスペロース６（Ｓ
ｕｐｅｒｏｓｅ　６　）　（ファルマシア社（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）、フライプルク、ドイツ連邦共和国）でｒ
ル濾過によ部分離し、かつ蛋白質１ｍｇ当シサシサッカ
ロースの添加後、凍結乾燥させた。

きさ６×８關及び厚さ０．５ｍのフリース片を、１）Ｈ
８Ａ　３０即／ｌの溶液１５μｌとともに燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，５）１０ｍＭ中に含浸させ、かつ５
０℃で３０分間乾燥させた。

ｃ）　　Ｈ８Ａ及びβ−ガラクトシダーゼに対する抗体
からの接合体 （２３） 接合体１−ＸＩを工ｇＧ　（クローン１（工〜ｌ）又は
２（ＩＶ〜■））ないしはＦａｂ　（クローンろ（■〜
）ａ））からＴ、キチガワの方法（Ｅｎｚｙｍｅ工ｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ、工ｓｈｉｋａｗａ、　Ｋａｗａｉ。

Ｍｉｇｕｉ編；工ｇａｋｕ　Ｅｌｈｏｉｎ　Ｔｏｋｙｏ
　／　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ　９８１．８１〜８９頁）に
よシ製造し、かつそれぞれの場合、スペロース６（Ｓｕ
ｐｅｒｏｓｅ−６Ｒ）−クロマトグラフィーによって分
別した。

■　β−ガラクトシダーゼの分子１個につき工ｇＧ約４
〜７個■　　　　　　　　　　　　　　　　　　２〜５
個■　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１〜２個
■　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４〜７個ｖ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３〜５個■　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２〜６個■　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１〜２個■　β−ガ
ラクトシダーゼの分子１師につきＦａｂフラグメント８
〜１４個 ■　　　　　　　　　　　　　　　　　　６〜１０個Ｘ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４〜８個Ｍ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１〜４個（２４
） ｄ）工ｇＧへのマレイミド基の導入 １）燐酸ナトリウム緩衝液（ｏ−１ｍｏｘ、／７　ｙｐ
Ｈ７，０）　０．５−中の工ｇＧ１．４ｍ４１（９−ろ
ｎｍｏｌ）の溶液へＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の
ろ−マレイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステル０．９１１／１１２）該混合物を３０℃で３
０分間、ｘｐｔし、かつ溶離剤としての燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６−５）　０．１　ｍｏｘ／７を用いてセ
ファデックスＧ−２５（ＩＸ４５ｃＩｒＬ）を用いてク
ロマトグラフィーした。

ｅ）β−ガラクトシダーゼを含有する接合体１）マレイ
ミド基エｇＧ　１．２５　ｍｇ　（８，３ｍｍｏｌ）を
含有する燐酸ナトリウム緩衝液（０，１ｍｏｌ／ｌ　；
　ｐＨ６，５）　１．４　ｍｌ中にβ−ガラクトシダー
ゼ（凍結乾燥させた）　１．５ｍ９（２，８ｍｍｏ１　
）を溶解させた。工ｇＧ及び酵素の最ろ）該溶液を次の
組成の溶離剤を含有するセファロース６Ｂ（１，５Ｘ４
５ｃｍのカラム）で分離した： 燐酸ナトリウム（ｐＨ６，５）　Ｉ　Ｑ　ｍｍｏ７Ｊ塩
化ナトリウム　　　　　０．１　　ｍｏｘ／７塩化マグ
ネシウム　　　　　ｉ　ｍｍｏｌ／Ａ！アジ化ナトリウ
ム　　　　　　１　１１／ＩＪ４）溶出液吸収を２８０
關で読み取った。

５）該溶出液を吸収プロフィールによシプル中で分別し
た。

６）プールのβ−ガラクトシダーゼ−活性度を測定した
。

上記方法は、Ｊ、■ｍｍｕｎｏａｓｅａｙ　４　（３）
　、　２０９〜２３７（１９Ｂ５）のＥ、イシカワ （工ｓｈｉｋａｗａ）担当部分にも１把賦されている。

ｆ）追出しマトリックス 牛アルゾミン０．５％を含有するＨＥＰＩｎＳ−緩衝液
（ｐＨ７，５）　０．Ｉ　Ｍ中のＣ）の接合体（４Ｕ／
ｒｎｌ）の溶液１５工１１　ｆ：ｂ）、のフリース上に
滴下した。引続き、フリースを乾燥させた。

ｇ）盲検値及び測定範囲の測定 ６Ｘ８ｍｍ大のｆ）のフリース２枚のステープルを Ａ）ヒト血清アルブミン（ＵＳＡ）　Ｏ”９’ＩＢ）　
　　　　　　　　　　　　、Ｉ　ＤＯｍ９／１１を含有
する緩衝溶液（燐酸塩５０　ｍｍｏｖ＃ｐＨ７，５）５
５工ｌで含浸させた。５分後、液体をマ）　ＩＪソック
スら遠心分離した。液体にクロロフェノールレッド−β
−ガラクトシドで測定した。

測定値Ａ）から盲検値、即ち、分析物が存在しない場合
にも見せかけの信号を出す値が生じた。

Ｂ）についての測定値は、分析物１ｏ。

■／ＩＪに対する信号値に相応した。

盲検値に対する信号値からの係数は、試験の達成可能な
正確度に対する尺度である。

第１表は、各接合体混合物１〜ＸＩに対する（２７） 盲検値（Ａ）、 測定値（Ｂ）及び係数Ｂ　／　Ａを再 現する。

第１表 最多の結合箇所を有する標識化された抗体を用いて最良
の正確度を達成できたことは歴然としている。

（２８） ２、　アルブミン測定のための較正曲線の記録ポリエス
テル５０％／リンタース（Ｌｉｎｔｅｒｓ）５０％の大
きさ６×８間かつ厚さ０−５ｍｎのフリース片を燐酸塩
緩衝液（ｐＨ７，２５）　０−０１ｍｍｏｌ、／／中の
ｐＨ８Ａ　５　Ｄないし１０［ＩＴｎ９／Ａの溶液１５
　ＩＡで含浸し、かつ乾燥させた。その後、フリースを
それぞれＨＥＰＦｉＳ−緩衝液（１００ｍｍｏｌ、ｐＨ
７，５）及びＵＳＡ　Ｑ、５％中の標識化された抗体Ｉ
４　Ｕ　／　ｒｎｌの溶液１５μｌで含浸し、かつ乾燥
させた。

このようにして得られた両フリースＢ及びＣは、アルブ
ミン測定に適当である。フリースの較正曲線の記録のた
めにフリースをＵＳＡ　Ｑ■／ＩＩ、　　１０１ｎ９／
　１３．　５０ｉｙ／　ｌないしは１００１ｎ９／ｌ含
有の試料で含浸した。５分後、液体をフリースから遠心
分離によって分離し、かっこのフリースにクロロフェノ
ールレッド−β−ガラクトシド（ＣＰＲＧ）　５　ｍｍ
ｏｌ／Ａ’を添加した。吸光度増加分Ｅ（ｍ８７分）を
ｇ）の場合と同様に光度的に測定した。

フリースＢ及びＣに対する較正曲線は、第３図に示され
ている。曲線■は、ｐＨ８Ａ５０〃η／ｌで含浸させた
フリースＢについての吸光度曲線を表わし、かつ曲線■
は、ｐＨ８Ａ　１００　＋１１９／　１２で含浸させた
フリースＣで得られた。

３、　未知のアルブミン含有量の測定 アルブミン測定のために、フリースＢもしくはＣに未知
の分析物含有量の試料２５μｌを添加し、５分後、試料
液体を除去し、該フリースにＣＰＲＧを添加し、かつ同
様に吸光度増加分Ｅを測定した。得られた値から、較正
曲線を用いてアルブミン含有量を推定することができた
。

例　　２ α１−ミクログロブリンの測定 追出しマトリックスの製造 ａ）熱Ｒ８Ａ−ストレプタビジンを塗布したフリースの
製造 熱凝集させたＵＳＡ　（以下熱−ＵＳＡと呼称する）を
次の方法で得た：　ＵＳＡ　１　ｇを、燐酸カリウム溶
液５０ｍｍ０１１０Ｑ　ｍｌ中にｐＨ７，０で溶解させ
、７０℃に加熱し、かつこの温度で弱い攪拌下で４時間
維持した。この溶液を冷却し、濾過しかつ濃度５０１に
／／ｍｌに調整した。引続き、３０倍の容量の２回蒸留
した水に対して透析した。

ストレプタビジンと熱−ＲＢＡの接合体の製造：ストレ
プトミセス　アビジニイ（ａｖｉｄｉｎｉｉ）から得ら
れたストレプタビジンをマレイミドヘキサメイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシニ□ドを反応させ、かつこの方法でマ
レイミド基を有するストレプタビジンを得た。熱−ＲＢ
ＡをＳ−アセチルメルカプト琥珀酸アンヒドリドと反応
させ、かつ引続き、保護されたＳＨ基をヒドロキシルア
ミンの添加によって遊離した。さらに、マレイミド基を
有するストレプタビジンを、ＳＨ基を有する熱−ＲＢＡ
と、所望の接合体の形成下に混合させた。

ス ポリエステル５ロ さ６×８山かつ厚さ０．５（ホ）のフリース片を、燐酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５　）　１　０　ｍＭ中の
熱−（３１） ＲＢＡ−ストレプタビジン２　０　０　＃！り／ｌの溶
液１５μｌで含浸させ、かつ５０℃で３０分間、乾燥さ
せた。

ｂ）　　モノクローナル抗体のビオチニル化についての
方法（　Ｐｅｔｅｒｓ，　Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ，　５
ｃｈｕｌｚｅ　：Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ　Ａｎｔｉｋ
ｏｅｒｐｅｒ，　Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ　ｕｎｄＯｈ
ａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ　；　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ出版社１９８５による）と同様のビオチニル化α１−
ミクロクロプリン製造。

Ｃ）α１Ｍの方向を向いたモノクローナルＡＫとβ−ガ
ラクトシダーゼからの接合体。

接合体を、Ｅｎｚｙｍｅ工ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（　
Ｉｓｈｉｋａｗａ。

Ｋｕｗａｉ，　Ｍｉｇｕｉ編；　Ｉｇａｋｕ　５ｈｏｉ
ｎ　Ｔｏｋｙｏ　／　ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）　８
　１　〜８　９頁）中のＴ．キチガワ（Ｋｉｔｉｇａｗ
ａ）の方法によシ得て、かつスペロース（Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ　　）　６−クロマトグラフィーでゾールＩ及び■
に分別した。

プールＩ　βーガラクトシダーゼ１個当シ工ｇＧ約３〜
７個 ゾール■　β−ガラクトシダーゼ１イ固当シ（３２） 工ｇＧ約１〜３個 ｄ）追出しマトリックス 燐酸塩緩衝液（　ｐＨ　７．５　）　１　０　ｍｍｏ７
Ｊ中のビオチニル化αｌ−ミクログロブリン５０１！／
Ｊの溶液１５μｌをａ）のフリース上に滴下した。

引続き、このフリースを乾燥させた。その後、フリース
上にＲＢＡ　３．５％を含有するＨＥＰＥＳ−緩衝液（
　ｐＨ　７−５　）　０．１　ｍｏｘ／Ｊ中の接合体Ｉ
（７リースＤ）　４　Ｕ　／　ｍｌないしは接合体■（
フリースＥ）の溶液１５μｌを滴下した。

例１の場合と同様に、試料 Ａ　ａＩＭ　　　口■／ｌ Ｂ　α１Ｍ　　１００■／ｌ を用いた測定の場合の盲検値Ａないしは信号値Ｂを測定
した（第２表を参照のこと）。

この表にかいても、盲検値は、標識化された抗体の減少
する結合箇所数にともない過剰な割合で上昇することが
判明する。

較正曲線の記録及び試料のα１ミクログロブリンの未知
含有量の測定は、例１と同様にして行なった。

【図面の簡単な説明】

第１図はクロマトグラフィー用ストリップの縦断面図、
第２図はフラップ付試験ストリッグの縦断面図、かつ第
３図はアルジミン測定のための較正曲線を示す線図であ
る。 手 続 補 書（自発） 平成 ８月３１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料液体を、固定化された分析物もしくは固定化さ
   れた分析物類似物及び標識化された抗体と接触させ、こ
   の場合、この抗体は測定すべき分析物並びに固定化され
   た分析物もしくは固定化された分析物類似物と免疫学的
   反応を起こすことができ、かつ固定化された分析物ない
   しは固定化された分析物類似物に結合することによつて
   固定化しており、液体試料中で分析物を測定する方法に
   おいて、標識化された抗体が標識化１回につき少なくと
   も４つの結合箇所を分析物ないしは分析物類似物に対し
   て有することを特徴とする、分析物測定のための方法。 ２、試料中の分析物は高濃縮された分析物である請求項
   １記載の方法。 ３、固定化された分析物もしくは固定化された分析物類
   似物を含有しかつ測定すべき分析物並びに固定化された
   分析物もしくは固定化された分析物類似物と免疫学的反
   応を起こすことができる標識化された抗体を含有する試
   料中で分析物を検出するための試薬において、標識化さ
   れた抗体が標識化１回につき少なくとも４つの結合箇所
   を分析物ないしは分析物類似物に対して有することを特
   徴とする試料中の分析物検出のための試薬。 ４、固定化された分析物又は固定化された分析物類似物
   がストレプタビジン／ビオチン相互作用によつてフリー
   スに結合している請求項３記載の試薬。 ５、固定化された分析物もしくは固定化された分析物類
   似物を含有しかつ分析物並びに分析物類似物と免疫学的
   反応を起こすことができる、前記分析物に結合した標識
   化された抗体を含有する吸収力のあるフリースと、標識
   化された抗体の量を測定することができるフリースとを
   有する液体試料中で分析物の存在又は分析物の量を検出
   するための試験ストリップにおいて、標識化された抗体
   が標識化１回につき少なくとも４つの結合箇所を分析物
   ないしは分析物類似物に対して有することを特徴とする
   、分析物検出のための試験ストリップ。