JPS6171361A - 抗原性物質の免疫化学的定量的測定方法及び試薬 - Google Patents
抗原性物質の免疫化学的定量的測定方法及び試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、抗原性物質の免疫学的測定方法及び該方法に
とって適当な試薬に関する。
とって適当な試薬に関する。
従来の技術
免疫試験の発達は、放射免疫法（ＲＩＡ）から出発して
、タンパク質及びハプテ／のような抗原性物質測定の感
受性及び選択性を決定的に改善するに至り、特に臨床的
化学試験室では、原めて重要になった。このような方法
の引続く開発によって従来使用されている標識方法〔放
射標識のほかに就中酵素標＠ （ＥＸＡ）が特に重要に
なった〕の普及と並んでまた反応方法の開発も著しく分
化された。すなわち物質相及び不均質相で進行するテス
トが開発されたが、後者の場合にこのような方法の場合
には奇に、被測定抗原性物質（以下略して抗原と称する
）の量に正比例する測定信号が所望される。さらに被検
溶液の成分、特に血清成分による妨害が確実に回避され
る方法管理も所望される。最後に該方法は極めて高い感
受性を有し、特にハプテンの場合にしばしば存在するよ
うなピコモル（Ｐｉｋｏｍｏｌ）範囲でもなお十分に正
確な結果を与えなげればならない。
、タンパク質及びハプテ／のような抗原性物質測定の感
受性及び選択性を決定的に改善するに至り、特に臨床的
化学試験室では、原めて重要になった。このような方法
の引続く開発によって従来使用されている標識方法〔放
射標識のほかに就中酵素標＠ （ＥＸＡ）が特に重要に
なった〕の普及と並んでまた反応方法の開発も著しく分
化された。すなわち物質相及び不均質相で進行するテス
トが開発されたが、後者の場合にこのような方法の場合
には奇に、被測定抗原性物質（以下略して抗原と称する
）の量に正比例する測定信号が所望される。さらに被検
溶液の成分、特に血清成分による妨害が確実に回避され
る方法管理も所望される。最後に該方法は極めて高い感
受性を有し、特にハプテンの場合にしばしば存在するよ
うなピコモル（Ｐｉｋｏｍｏｌ）範囲でもなお十分に正
確な結果を与えなげればならない。
抗体のとり得る結合部位が唯一個しかないために特に難
点を生じるハプテンの場合には、正確に計量された量の
抗ハプテン抗体及び標識ハプテンを、試料中で抗体にお
ける結合に関して被測定ハプテンと競争させるように測
定を行うことはすでに公知である（西独国時許出願公告
４２１５５６５８号）。この方法の場合には成程異種成
分による妨害は除去されうるけれども、競争原理のため
に感受性が小さすぎる。また所ｇｌ ＩＥＭＡ法も公知
であり、この方法の場合にはタンパクＪＸを任意過剰で
存在する４１抗体と反質を用いて分離し、次いで液相で
残存する標識抗体の量を測定することによって行われる
〔２ンセツト（Ｌａｎｃｅｔ） 、１９６８年８月、４
９２〜４９３頁〕。さら１ｃｆｉ独特許出願公告第２７
４３４４４号からは、前記ＩＥＭＡ Ｋの場合に完全抗
体の代りにそのＦａｔ）片を使用してノ）ブテン及びタ
ンパク質を測定することも公知である。これらの方法の
欠点は、異種物質による妨害の起るおそれがあり、標識
抗体又はその断片が正確に計量されなげればならないこ
とである。
点を生じるハプテンの場合には、正確に計量された量の
抗ハプテン抗体及び標識ハプテンを、試料中で抗体にお
ける結合に関して被測定ハプテンと競争させるように測
定を行うことはすでに公知である（西独国時許出願公告
４２１５５６５８号）。この方法の場合には成程異種成
分による妨害は除去されうるけれども、競争原理のため
に感受性が小さすぎる。また所ｇｌ ＩＥＭＡ法も公知
であり、この方法の場合にはタンパクＪＸを任意過剰で
存在する４１抗体と反質を用いて分離し、次いで液相で
残存する標識抗体の量を測定することによって行われる
〔２ンセツト（Ｌａｎｃｅｔ） 、１９６８年８月、４
９２〜４９３頁〕。さら１ｃｆｉ独特許出願公告第２７
４３４４４号からは、前記ＩＥＭＡ Ｋの場合に完全抗
体の代りにそのＦａｔ）片を使用してノ）ブテン及びタ
ンパク質を測定することも公知である。これらの方法の
欠点は、異種物質による妨害の起るおそれがあり、標識
抗体又はその断片が正確に計量されなげればならないこ
とである。
発明の解決しようとする問題点
本発明は、前記欠点をもはや可しない方法において上述
の条件を結合するという課題ｔ−基健にしている。
の条件を結合するという課題ｔ−基健にしている。
特に本発明の課、ｊは、測定の際に関係しないか又は極
めて妨害する可能性のある血清成分を除去し、固相を感
受性の損失なしに洗浄することができかつ感受性の増大
を速成することである。
めて妨害する可能性のある血清成分を除去し、固相を感
受性の損失なしに洗浄することができかつ感受性の増大
を速成することである。
前記課題は本発明により、被測定抗原性物質を、同物質
に対応する標識された第１抗体又はそのＦａｂ又はＦａ
ｂ’片から成る結合体（Ｂｉｎｄｅｒ ）と共に恒温保
持し、反応混合物を固相で存在する被測定抗原性物質又
はその類似物と一緒に特定時間の間恒温保持し、液相を
分離し、場合によっては固相を洗浄しかつ洗浄Ｒｔ−液
相と一緒にすることによって抗原性物質を免疫化学的定
量的に測定する方法において、該液相を、次に結合体又
は結合体と被測定物質とから成る複合体（Ｋｏｍｐｌｅ
ｘ）に対応する、固相で存在する第２抗体と接触させ、
第２抗体が複合体に対応しない場合には交叉反応された
複合体成分とは接触させず、固相を分離し、場合によっ
ては洗浄しかつ固相に結合された標識を測定することを
特徴とする前記方法によって解決される。
に対応する標識された第１抗体又はそのＦａｂ又はＦａ
ｂ’片から成る結合体（Ｂｉｎｄｅｒ ）と共に恒温保
持し、反応混合物を固相で存在する被測定抗原性物質又
はその類似物と一緒に特定時間の間恒温保持し、液相を
分離し、場合によっては固相を洗浄しかつ洗浄Ｒｔ−液
相と一緒にすることによって抗原性物質を免疫化学的定
量的に測定する方法において、該液相を、次に結合体又
は結合体と被測定物質とから成る複合体（Ｋｏｍｐｌｅ
ｘ）に対応する、固相で存在する第２抗体と接触させ、
第２抗体が複合体に対応しない場合には交叉反応された
複合体成分とは接触させず、固相を分離し、場合によっ
ては洗浄しかつ固相に結合された標識を測定することを
特徴とする前記方法によって解決される。
本発明による方法は、２つの別種の固相を用い、従って
液相と固相の分離が２回必要でらるげれども、意外にも
極めて高い精度を有する。
液相と固相の分離が２回必要でらるげれども、意外にも
極めて高い精度を有する。
このような方法の場合には、固体における非特、異性吸
着のために遅延によって有用性を失う不精確さを予想す
るでりろう。このことは、第一番目の固相の分離後の付
加的洗浄段階が液相全希釈することになる場合には、そ
れだけ−４認められる。
着のために遅延によって有用性を失う不精確さを予想す
るでりろう。このことは、第一番目の固相の分離後の付
加的洗浄段階が液相全希釈することになる場合には、そ
れだけ−４認められる。
また本発明による方法は、特に極めて少量のハプテン、
つまりそれ自体非抗原性でるるか、別の抗原性物質と結
合することによって特異的抗体形成を誘起することので
きる物質の測定にとっても適当である。従来ハプテ／は
所謂”サン−ウィッチ”法によっては測定することがで
きなかった、それというのもハプテンはその分子量が小
さいために抗体の取りうる若干の結合部位しか有しない
からである。しかしまた本発明方法は、他の抗原、特に
タンパク質及びアレルゲンの測定にとっても適当である
。
つまりそれ自体非抗原性でるるか、別の抗原性物質と結
合することによって特異的抗体形成を誘起することので
きる物質の測定にとっても適当である。従来ハプテ／は
所謂”サン−ウィッチ”法によっては測定することがで
きなかった、それというのもハプテンはその分子量が小
さいために抗体の取りうる若干の結合部位しか有しない
からである。しかしまた本発明方法は、他の抗原、特に
タンパク質及びアレルゲンの測定にとっても適当である
。
本発明くよる方法で使用される結合体は、上述のように
、被測定抗原性物質に対応するＳ識第１抗体又はそのＦ
ａｂ又はＦａｂ’片から成る。該結合体は不発明の範囲
では、試料中の被測定物質の童に対して任意過剰で使用
してもよい。しかしまた、被測定物質との恒温保持時間
が、固相で存在する被測定物質と反応することのできる
非結合分がなお存在するように短く選定される場合には
、該結合剤をモル過剰で使用することもできる。この際
第１抗体はポリクミン゛（ｐｏｌｙｋｌｏｎａｌ）又は
モノクロン（ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌ）抗体であってよい
。
、被測定抗原性物質に対応するＳ識第１抗体又はそのＦ
ａｂ又はＦａｂ’片から成る。該結合体は不発明の範囲
では、試料中の被測定物質の童に対して任意過剰で使用
してもよい。しかしまた、被測定物質との恒温保持時間
が、固相で存在する被測定物質と反応することのできる
非結合分がなお存在するように短く選定される場合には
、該結合剤をモル過剰で使用することもできる。この際
第１抗体はポリクミン゛（ｐｏｌｙｋｌｏｎａｌ）又は
モノクロン（ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌ）抗体であってよい
。
マーカーとしては、免疫化学的方法で常用されるマーカ
ー、すなわち光学的に測定可能の基又は化合物例えば螢
光性又は着色物質、発色成分等、特に放射性原子及び化
合物、ならびに酵素が適当である。最後のマーカーは、
放射性物質、螢光標識物等に公安な特別な装置なしに単
純に測定可能であるために有利である。標識酵素として
は、有利には酵素免疫検定で常用の酵素、すなわちペル
オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、リゾチ
ーム、リンー／鍍テヒトｅ２）ｌａナーゼ、グルコース
−６−燐酸−デヒドロデナーゼ及びβ−アミツーゼを使
用する。轡に、ペルオキシダーゼ（安定であり、生′成
Ｈ２Ｏ２により有利に測定できるため）及びβ−ガラク
トシダーゼが好ましい。
ー、すなわち光学的に測定可能の基又は化合物例えば螢
光性又は着色物質、発色成分等、特に放射性原子及び化
合物、ならびに酵素が適当である。最後のマーカーは、
放射性物質、螢光標識物等に公安な特別な装置なしに単
純に測定可能であるために有利である。標識酵素として
は、有利には酵素免疫検定で常用の酵素、すなわちペル
オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、リゾチ
ーム、リンー／鍍テヒトｅ２）ｌａナーゼ、グルコース
−６−燐酸−デヒドロデナーゼ及びβ−アミツーゼを使
用する。轡に、ペルオキシダーゼ（安定であり、生′成
Ｈ２Ｏ２により有利に測定できるため）及びβ−ガラク
トシダーゼが好ましい。
本発明の範囲で使用される第１固相は、結合された抗原
又はその類似物を含有する。ここに類似物とは、被測定
物質自体より少なくとも少量であっても第１抗体と交叉
反応する化学的類似物質のことである。抗原は有利には
共有又は吸着結合をもって又は沈殿によって適当な不活
性担体に結合されている。この方法は当業者に周知であ
って、ここに詳細に述べる必要はない。
又はその類似物を含有する。ここに類似物とは、被測定
物質自体より少なくとも少量であっても第１抗体と交叉
反応する化学的類似物質のことである。抗原は有利には
共有又は吸着結合をもって又は沈殿によって適当な不活
性担体に結合されている。この方法は当業者に周知であ
って、ここに詳細に述べる必要はない。
また当該担体材料についても同様なことがいえる。一般
にガラス、プラスチック又は合成又は天然ポリマー例え
ばセルロース、デキストラン、スチロール重合体等が使
用される。イオン交換体及び非特異性吸着剤も使用して
よい。これらの担体材料も同様に当業者には周知である
。固相で存在する抗原は本発明方法の範囲では精密な計
量を要しない。ただ抗原は、試料中の被測定抗原によっ
てすでに結合されていない過剰の結合体を、抗原−抗体
反応によって固定するのに十分でなげればならない。
にガラス、プラスチック又は合成又は天然ポリマー例え
ばセルロース、デキストラン、スチロール重合体等が使
用される。イオン交換体及び非特異性吸着剤も使用して
よい。これらの担体材料も同様に当業者には周知である
。固相で存在する抗原は本発明方法の範囲では精密な計
量を要しない。ただ抗原は、試料中の被測定抗原によっ
てすでに結合されていない過剰の結合体を、抗原−抗体
反応によって固定するのに十分でなげればならない。
また、同様に固相で存在する第２抗体も、上述方法によ
り担体に結合されていてもよい。この第２抗体の場合に
も本発明方法では精密な計量を要しない。第２抗体は、
固相で存在する被測定物質から分離された液相で存在す
る、結合体と被測定物質から成る複合体をサンドウィッ
チ状に固定するのに十分な量で存在すれば十分である。
り担体に結合されていてもよい。この第２抗体の場合に
も本発明方法では精密な計量を要しない。第２抗体は、
固相で存在する被測定物質から分離された液相で存在す
る、結合体と被測定物質から成る複合体をサンドウィッ
チ状に固定するのに十分な量で存在すれば十分である。
この際第２抗体は、第１抗体、そのＦａｂ又はＦａｂ’
又はその標識物質に対応していてもよい。また第２抗体
は、結合体が被測定物質と共に形成する複合体自体に対
応していてもよい。この場合には第２抗体は形成された
複合体におけるマーカーとも第１抗体とも交叉反応して
はならない、つまり第２抗体は結合体と被測定物質との
間の結合に対して特異的でなげればならない。こうして
第２抗体は、液相で存在していて、第１固相によって結
合されなかった抗原−標識結合体の複合体と結合し、か
つ液相の分離及び洗浄後に担体結合標識が測定される。
又はその標識物質に対応していてもよい。また第２抗体
は、結合体が被測定物質と共に形成する複合体自体に対
応していてもよい。この場合には第２抗体は形成された
複合体におけるマーカーとも第１抗体とも交叉反応して
はならない、つまり第２抗体は結合体と被測定物質との
間の結合に対して特異的でなげればならない。こうして
第２抗体は、液相で存在していて、第１固相によって結
合されなかった抗原−標識結合体の複合体と結合し、か
つ液相の分離及び洗浄後に担体結合標識が測定される。
これは、酵素標識の場合には常法により標識酵素の測定
のための液状試薬との接触によって簡単に行われる。マ
ーカーが酵素でない場合には、その測定は同様に当業者
（周知の公知法により行われる。第２抗体はポリクロン
又はモノクロン抗体又はそのＦａｂ／ｉ”ａｂ’片であ
ってよい。
のための液状試薬との接触によって簡単に行われる。マ
ーカーが酵素でない場合には、その測定は同様に当業者
（周知の公知法により行われる。第２抗体はポリクロン
又はモノクロン抗体又はそのＦａｂ／ｉ”ａｂ’片であ
ってよい。
本発明による方法の場合、結合体を被測定物質に対して
過剰又は不足で〃口えるかどうかに応じて、第一番目の
恒温保持の際に、結合体と被測定物質とから成る複合体
、残りの遊離結合体及び場合によっては残りの遊離被測
定物質から成る反応混合物が得られる。後者の場合はぐ
恒温保持が極めて短時間であって、全被測定物質が複合
体に入らず、結合体が過剰に存在する場合に該当する。
過剰又は不足で〃口えるかどうかに応じて、第一番目の
恒温保持の際に、結合体と被測定物質とから成る複合体
、残りの遊離結合体及び場合によっては残りの遊離被測
定物質から成る反応混合物が得られる。後者の場合はぐ
恒温保持が極めて短時間であって、全被測定物質が複合
体に入らず、結合体が過剰に存在する場合に該当する。
第二番目の恒温保持によって前記反応混合物から固相が
分離される、それというのもこの固相には遊離結合体の
みが固定されるが、複合体中に含有された結合体は固定
されないからである。従って相分離が終ると複合体は液
相となりかつこの液相から、固相で存在する第２抗体と
一緒に分離される。第２固°相に固定された複合体は従
って被測定物質に正比例する量の結合体標識を含有する
。次にマーカーの量が測定される。マーカーが例えばβ
−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼのようなｒ＃
素の場合には該酵素の検出は公知で行われる。同様にし
て放射性標識の検出は相応の測定装置により、光学的標
識は光学装置により行われる。
分離される、それというのもこの固相には遊離結合体の
みが固定されるが、複合体中に含有された結合体は固定
されないからである。従って相分離が終ると複合体は液
相となりかつこの液相から、固相で存在する第２抗体と
一緒に分離される。第２固°相に固定された複合体は従
って被測定物質に正比例する量の結合体標識を含有する
。次にマーカーの量が測定される。マーカーが例えばβ
−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼのようなｒ＃
素の場合には該酵素の検出は公知で行われる。同様にし
て放射性標識の検出は相応の測定装置により、光学的標
識は光学装置により行われる。
本発明による方法は高い精度を有し、変動係数は、抗原
としてのハプテンを約１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で測定す
る場合一般に５〜１０％である。
としてのハプテンを約１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で測定す
る場合一般に５〜１０％である。
本発明による方法は、抗ｉを含有する被検溶液の他の成
分によって妨害されず、その結果特に血清成分による＠
繁な妨害現象が除去される。
分によって妨害されず、その結果特に血清成分による＠
繁な妨害現象が除去される。
また本発明方法は、使用される種々の成分、すなわち結
合体、固相で存在する抗原及び第２抗体の精密な計量を
要しない。さらに該方法は被測定抗原の現存量に正比例
する測定値を与える。
合体、固相で存在する抗原及び第２抗体の精密な計量を
要しない。さらに該方法は被測定抗原の現存量に正比例
する測定値を与える。
また本発明の対象は、抗原性物質の免疫化学的測定のた
めの試薬であり、その特徴とするところは、 ａ）被測定物質に対応する標識された第１抗体又はその
Ｆａｂ又はＦａｂ’片から成る結合体、ｂ）固相で存在
する抗原 Ｃ）結合体又は結合体と被測定物質から成る複合体に対
応する固相で存在する第２抗体及びｄ）標識物質の測定
系 を含有することである。
めの試薬であり、その特徴とするところは、 ａ）被測定物質に対応する標識された第１抗体又はその
Ｆａｂ又はＦａｂ’片から成る結合体、ｂ）固相で存在
する抗原 Ｃ）結合体又は結合体と被測定物質から成る複合体に対
応する固相で存在する第２抗体及びｄ）標識物質の測定
系 を含有することである。
本発明による試薬は、有利な一実施態様においては、酵
素含有結合体及び同酵素を測定するための系を含有して
いる。
素含有結合体及び同酵素を測定するための系を含有して
いる。
次に実施例により本発明を詳述する。
実施例
例 １
ヒト血清ヤのジゴキシンの測定方法
１、 試薬
ジゴキシンに対応する抗血清の製造：
ジゴキシンと結合される免疫原、すなわちヒト血清アル
ブミンの製造は、Ｙ、Ｐ、パトラ−（Ｂｕｔｌａｒ）
ｊｒ、及びＪ、 Ｐ、チェノ（Ｃｈｅｎ） （Ｐｒｏｃ
。
ブミンの製造は、Ｙ、Ｐ、パトラ−（Ｂｕｔｌａｒ）
ｊｒ、及びＪ、 Ｐ、チェノ（Ｃｈｅｎ） （Ｐｒｏｃ
。
Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｉ−ＵＳ、５１ ＊ ７１
〜７８頁（１９６７））及びＴ、 Ｗ、スミス（Ｓｍｉ
ｔｈ） 、 Ｖ。
〜７８頁（１９６７））及びＴ、 Ｗ、スミス（Ｓｍｉ
ｔｈ） 、 Ｖ。
Ｐ、パトラ−及びに、 Ｅ、 ハーバ−（Ｈａｂｅｒ）
（ビオケミストリー（Ｂｉｏａｈｅｍｉａｔｒｙ）
９ ｔ ３５１〜５５７頁（１９７０）：］によって
詳細に記載されているよ５に行われた。この免疫原を用
いてヒツジを免疫化し、相応する抗血清を作った。
（ビオケミストリー（Ｂｉｏａｈｅｍｉａｔｒｙ）
９ ｔ ３５１〜５５７頁（１９７０）：］によって
詳細に記載されているよ５に行われた。この免疫原を用
いてヒツジを免疫化し、相応する抗血清を作った。
β−がラクトシダーゼに対応する抗血清の製造：β−ガ
ラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイＡ、Ｂｅ５ｔ
、、 Ｎｒ、 ５７００７９ ）を用いてヒツジを免疫
化し、相応する抗血清を作った。
ラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイＡ、Ｂｅ５ｔ
、、 Ｎｒ、 ５７００７９ ）を用いてヒツジを免疫
化し、相応する抗血清を作った。
文献二Ｅ、イシカワＣＸ５ｈ↓ｋａｗａ）、 Ｓ、ヨ
シタケ（Ｙｏｓｉｔａｋｅ） ： ” ｘｙチーム・イ
ムノアセイ（Ｅｎｚｙｍｅ 工ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
″、Ｅ、イシカワ、Ｔ。
シタケ（Ｙｏｓｉｔａｋｅ） ： ” ｘｙチーム・イ
ムノアセイ（Ｅｎｚｙｍｅ 工ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
″、Ｅ、イシカワ、Ｔ。
カワイ（Ｋａｗａｉ） ｔ Ｋｍ ”−ヤイ（Ｍｉｙａ
ｉ） ４！Ｌ医学書院、東京／ニューヨーク（１９５１
）。
ｉ） ４！Ｌ医学書院、東京／ニューヨーク（１９５１
）。
ウサヤＩｇ（）に対応する抗血清の製出：ウテヤ層殺血
清にＮＨ，Ｓｏ、 ｔ １．８ Ｍまで加えた。沈殿物
を、１５ ｍＭ ｍ 酸ナトリウム（Ｐ）（７，０）及
び５０ ｍＭ ＮａＣＪ、から成る緩衝牧中に取り、こ
うして得られた溶夜をＤＥＡＪセルロース上に通過させ
た。工ｇＧｔ−含有するフラクションは凍結乾燥し、免
疫原として使用した。この免疫原を用いてヒツジを免疫
化し、相応する抗血清を得た。
清にＮＨ，Ｓｏ、 ｔ １．８ Ｍまで加えた。沈殿物
を、１５ ｍＭ ｍ 酸ナトリウム（Ｐ）（７，０）及
び５０ ｍＭ ＮａＣＪ、から成る緩衝牧中に取り、こ
うして得られた溶夜をＤＥＡＪセルロース上に通過させ
た。工ｇＧｔ−含有するフラクションは凍結乾燥し、免
疫原として使用した。この免疫原を用いてヒツジを免疫
化し、相応する抗血清を得た。
第１固相の製造：
ウサヤＩｇＧへのジゴキシンの結合：
ウサ＝ｐ工ｇＧを前記のようにして製出した。ジゴキシ
ンをナトリウム−ｍ−過沃禾酸塩で酸化し、ウサヤエｇ
Ｇに結合した。方法及び技術的細部は、ｖ、ｐ、パトラ
−ｊｒ及びＪ、Ｐ、チェ７（Ｐｒｏｃ。
ンをナトリウム−ｍ−過沃禾酸塩で酸化し、ウサヤエｇ
Ｇに結合した。方法及び技術的細部は、ｖ、ｐ、パトラ
−ｊｒ及びＪ、Ｐ、チェ７（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、 ＡＣａｄ、 Ｓｃｉ、 ＴＪｓ、 ５７ｅ
７ （１９６７））及びＴ、 Ｗ、 ２ミス等１：
Ｂｉｏｃｈａｍ、 ９ 、３３１〜６６７貞（１９７
０））によって詳細に記載されている。担体タンパク質
としては上記の両仕様書とは異って血清アルブミンでは
な（、ＤＥＡＥセルロースを介して精製したウサｆ Ｉ
ｇＧを使用した。ジゴキシンで誘導したり丈ギエｇＧを
、べ−リンガ−・マンハイム製″親和性吸着剤、活性化
グルタルジアルデヒド（Ａｆｆｉｎｉｔ、ｆｔ５ａｄｓ
ｏｒｂｓｎｓ 、 Ｇｌｕｔａｒｄｉａｌｄｅｈｙｄ
ａｋｔｉｖｉｅｒｔ）”（Ｂｅｓｔ、、 Ｎｒ、 ６
６５５２５ ）に、同メーカーの作業規定に従い精舎し
た。
７ （１９６７））及びＴ、 Ｗ、 ２ミス等１：
Ｂｉｏｃｈａｍ、 ９ 、３３１〜６６７貞（１９７
０））によって詳細に記載されている。担体タンパク質
としては上記の両仕様書とは異って血清アルブミンでは
な（、ＤＥＡＥセルロースを介して精製したウサｆ Ｉ
ｇＧを使用した。ジゴキシンで誘導したり丈ギエｇＧを
、べ−リンガ−・マンハイム製″親和性吸着剤、活性化
グルタルジアルデヒド（Ａｆｆｉｎｉｔ、ｆｔ５ａｄｓ
ｏｒｂｓｎｓ 、 Ｇｌｕｔａｒｄｉａｌｄｅｈｙｄ
ａｋｔｉｖｉｅｒｔ）”（Ｂｅｓｔ、、 Ｎｒ、 ６
６５５２５ ）に、同メーカーの作業規定に従い精舎し
た。
第２固相の製造：
この製造は、抗β−ガラクトシダーゼＩｇＧフラクショ
ンを、ベーリ／ガーーマンハイム製″親和性吸着剤、活
性化グルタルジアルデヒド”（Ｂｅｓｔ、、 Ｎｒ、
６６５５２５ ）に、同メーカーの作業規定に従い結合
することによって行なう。
ンを、ベーリ／ガーーマンハイム製″親和性吸着剤、活
性化グルタルジアルデヒド”（Ｂｅｓｔ、、 Ｎｒ、
６６５５２５ ）に、同メーカーの作業規定に従い結合
することによって行なう。
前記ＩｇＧフラクションは、相応する抗血清から硫ばア
ンモニウムの沈殿及びＤＥＡＥセルロースによるクロマ
トグラフィーにより得られた。
ンモニウムの沈殿及びＤＥＡＥセルロースによるクロマ
トグラフィーにより得られた。
結合体の製造：
ジゴキシンに対応する抗血清を、硫酸アンモニウム沈殿
及びＤＥＡＥセルロース通過により精製してＩｇＧ ７
ラクシミンを得た。パパイン分解（Ｐａｐａｉｎ−８ｐ
ａｌｔｕｎｇ）をＲ，Ｒ，ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）法
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ７３．１１９〜１２６頁（
１９５９）］により行った。未消化ＩｇＧ分子及びＦｃ
片からＦａｂ片を、セファデクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ １００ Ｋよるｒル濾過及びＩ）ＥＡＥセルロー
スによるイオン交換−クロマトグラフィによって、文献
規定（Ｋ、マリノブスキー（Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ ）
及びＷ、マンスキー（Ｍａｎｓｋｉ） ：“メソッヅ・
イン・エンチモロゾ−（Ｍｅｔ、ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｙ
ｍｏｌｏｇｙ）”、Ｊ、Ｊ、ランイン（Ｌａｎｇｏｎｅ
）及びＨ，ファン・バナキス（ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ
） ａ。
及びＤＥＡＥセルロース通過により精製してＩｇＧ ７
ラクシミンを得た。パパイン分解（Ｐａｐａｉｎ−８ｐ
ａｌｔｕｎｇ）をＲ，Ｒ，ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）法
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ７３．１１９〜１２６頁（
１９５９）］により行った。未消化ＩｇＧ分子及びＦｃ
片からＦａｂ片を、セファデクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ １００ Ｋよるｒル濾過及びＩ）ＥＡＥセルロー
スによるイオン交換−クロマトグラフィによって、文献
規定（Ｋ、マリノブスキー（Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ ）
及びＷ、マンスキー（Ｍａｎｓｋｉ） ：“メソッヅ・
イン・エンチモロゾ−（Ｍｅｔ、ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｙ
ｍｏｌｏｇｙ）”、Ｊ、Ｊ、ランイン（Ｌａｎｇｏｎｅ
）及びＨ，ファン・バナキス（ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ
） ａ。
アカデミツク−プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
） 、 Ｖｏｌ。
） 、 Ｖｏｌ。
７３（１９８１）、４１８〜４５９頁〕に従って分離し
た。生じるＦａｂ ７ラクシヨンを第１固相を施したカ
ラム上に供給した。初めの溶離緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナ
トリウム（ｐｉ−１７，２）＋０．９ ＭＮａＣｆであ
った。非特異的の、つまりジゴキシンに対応しないＦａ
ｂ片の溶離後に、１Ｍプロプリオン酸（Ｐｒｏｐｒｉｏ
ｎｓ＆ｕｒｅ）を用いて、ジゴキシンに対応するＦａｂ
片を溶離した。次に溶離ｄを水に対して透析し、限外濾
過によって磯縮しかつ凍結乾燥した。ジゴキシンに対応
するＦａｂ片を、ヘテロ−二官能性試薬であるＮ−（−
ｍ−マレイン−イミド−ベンゾイルオキシ）スクシンイ
ミドＣＭＢＳ）と反応させ、次にＴ、キチワガ（Ｋｉｔ
ｉｗａｇａ）の規定〔“エンチーム・イムノアセイ”、
イシカワ、Ｔ、カワイ、Ｋ、ミャイ編、医学書院、東京
／ニューヨーク（１９８１））に従ってβ−ガラクトシ
ダーゼに結合した。この結合後にＦａｂ−β−ガラクト
シダーゼ結合体を、前記著者達によって記載されている
ようなセファロース（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ） ６ Ｂに
よるデル濾過にかけた。遊離の、つまり未結合のβ−ガ
ラクトシダーゼを含有しないフラクションを使用した。
た。生じるＦａｂ ７ラクシヨンを第１固相を施したカ
ラム上に供給した。初めの溶離緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナ
トリウム（ｐｉ−１７，２）＋０．９ ＭＮａＣｆであ
った。非特異的の、つまりジゴキシンに対応しないＦａ
ｂ片の溶離後に、１Ｍプロプリオン酸（Ｐｒｏｐｒｉｏ
ｎｓ＆ｕｒｅ）を用いて、ジゴキシンに対応するＦａｂ
片を溶離した。次に溶離ｄを水に対して透析し、限外濾
過によって磯縮しかつ凍結乾燥した。ジゴキシンに対応
するＦａｂ片を、ヘテロ−二官能性試薬であるＮ−（−
ｍ−マレイン−イミド−ベンゾイルオキシ）スクシンイ
ミドＣＭＢＳ）と反応させ、次にＴ、キチワガ（Ｋｉｔ
ｉｗａｇａ）の規定〔“エンチーム・イムノアセイ”、
イシカワ、Ｔ、カワイ、Ｋ、ミャイ編、医学書院、東京
／ニューヨーク（１９８１））に従ってβ−ガラクトシ
ダーゼに結合した。この結合後にＦａｂ−β−ガラクト
シダーゼ結合体を、前記著者達によって記載されている
ようなセファロース（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ） ６ Ｂに
よるデル濾過にかけた。遊離の、つまり未結合のβ−ガ
ラクトシダーゼを含有しないフラクションを使用した。
２、ジゴキシンの測定
ヒト血清中のノコ９キシン標準〔ベーリ／ガー・マンハ
イム製エリデーキット（Ｅｌｉｓａ−Ｋｉｔ）から取る
〕を０．９％Ｎａα溶液で１ ： ７．５に希釈した。
イム製エリデーキット（Ｅｌｉｓａ−Ｋｉｔ）から取る
〕を０．９％Ｎａα溶液で１ ： ７．５に希釈した。
希釈した標準２００μｍに、３．７で記載したようにし
て製造した結合体２００μｌ （２０ｍＵ／ｆｎｌ。
て製造した結合体２００μｌ （２０ｍＵ／ｆｎｌ。
オルト−ニドＣ：ｌフェニル−β−Ｄ−が２クトシドを
用いて測定を加えた。結合体は次の緩衝ｇ、：０．１Ｍ
燐酸ナトリウム −７，２ ０，２％ ＮａＣｊ ２ｍＭ ＭｇＣｕ２ １慢ウシ血清アルブミン 中に溶解している。
用いて測定を加えた。結合体は次の緩衝ｇ、：０．１Ｍ
燐酸ナトリウム −７，２ ０，２％ ＮａＣｊ ２ｍＭ ＭｇＣｕ２ １慢ウシ血清アルブミン 中に溶解している。
標準及び結合体を３７℃で正確に５分恒温保持した。次
に第１固相５０μｍを加える。混合物を振盪下にさらに
５分間３７℃で恒温保持する。次にエペンドル７ （Ｅ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機５４／４を用いて１分間遠心
分離した。上澄みから６００μｍを取り、第２固相５０
μｍを加え、振盪下に６７℃で恒温保持する。混合物を
この５分の経過後に遠心分離し、上澄みを粱て、ペレッ
トを上記緩衝液でさらに２回洗浄する。洗浄したペレッ
トに、０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐｉ−１７，２）、０
．９ ％ Ｎａ（Ｊ、 ２ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２から成る
緩衝液中に溶かしたクロロフェノールロート−β−ガラ
クトシド（Ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｏｌｒｏｔ−β−Ｇａｌ
ａｃｔｏａｉｄ） （’Ａ造は西独国特許出願第ｐ３３
４５７４８号参照）の６ｍＭ溶液帆６プを加え、溶液を
懸濁し、振盪下に５分間恒温保持する（６７℃）。次い
で上記のように遠心分離する。上澄みから０．５コを取
り、それから５７５ｎｍで光学濃度を測定する。第１図
はこのようにして得られた較正曲線のグラフを示す。未
希釈血清のジブキシン濃度（Ｘ軸）Ｋ対してそれに相応
する光学濃度（Ｙ軸）がプコットしである。
に第１固相５０μｍを加える。混合物を振盪下にさらに
５分間３７℃で恒温保持する。次にエペンドル７ （Ｅ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機５４／４を用いて１分間遠心
分離した。上澄みから６００μｍを取り、第２固相５０
μｍを加え、振盪下に６７℃で恒温保持する。混合物を
この５分の経過後に遠心分離し、上澄みを粱て、ペレッ
トを上記緩衝液でさらに２回洗浄する。洗浄したペレッ
トに、０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐｉ−１７，２）、０
．９ ％ Ｎａ（Ｊ、 ２ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２から成る
緩衝液中に溶かしたクロロフェノールロート−β−ガラ
クトシド（Ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｏｌｒｏｔ−β−Ｇａｌ
ａｃｔｏａｉｄ） （’Ａ造は西独国特許出願第ｐ３３
４５７４８号参照）の６ｍＭ溶液帆６プを加え、溶液を
懸濁し、振盪下に５分間恒温保持する（６７℃）。次い
で上記のように遠心分離する。上澄みから０．５コを取
り、それから５７５ｎｍで光学濃度を測定する。第１図
はこのようにして得られた較正曲線のグラフを示す。未
希釈血清のジブキシン濃度（Ｘ軸）Ｋ対してそれに相応
する光学濃度（Ｙ軸）がプコットしである。
例 ２
クコ９キシンに対応するモノクロン抗体を用いるジゴキ
シンの測定方法 １、 試薬 第２固相及び結合体の製造以外は、例１で使用しかつ製
造したものと同じ試薬を用いる。
シンの測定方法 １、 試薬 第２固相及び結合体の製造以外は、例１で使用しかつ製
造したものと同じ試薬を用いる。
マウスＩｇＧに対応する抗血清の製出：マウス血清にＮ
Ｈ４５ｏ、 ｔ−１，８Ｍまで加えた。
Ｈ４５ｏ、 ｔ−１，８Ｍまで加えた。
沈殿物を１５ｍＭ燐酸ナトリヴム（ｐ）（７，０）及び
５ Ｑ ｍＭ ＮａＣ１から成る緩衝液中に取り、これ
によって得られた溶液を、ＤＥＡＥセルロースを介して
通過させる。ＩｇＧを含有するフラクションを、凍結乾
燥して免疫原として使用した。この免疫原を用いてヒツ
ジを免疫化し、相応の抗血清を作った。
５ Ｑ ｍＭ ＮａＣ１から成る緩衝液中に取り、これ
によって得られた溶液を、ＤＥＡＥセルロースを介して
通過させる。ＩｇＧを含有するフラクションを、凍結乾
燥して免疫原として使用した。この免疫原を用いてヒツ
ジを免疫化し、相応の抗血清を作った。
第２固相の製造：
マウスＩｇＧに対応するヒツジＩｇＧを、１アフイーデ
／ｌ／ （Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ） １０”〔アミコｙ （
Ａｍｉｃｏｎ）］にアミ；ン社の作業規定に従って結合
した。結合条件：燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ）（７，５
、タンパク質濃度８７ｎ９／ＩｒＬｔ）中で４ ’Ｏで
５時間、次に０．１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，０）
の添加下で室温で３時間。
／ｌ／ （Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ） １０”〔アミコｙ （
Ａｍｉｃｏｎ）］にアミ；ン社の作業規定に従って結合
した。結合条件：燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ）（７，５
、タンパク質濃度８７ｎ９／ＩｒＬｔ）中で４ ’Ｏで
５時間、次に０．１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，０）
の添加下で室温で３時間。
結合体の製造：
ジゴキシンに対応するモノクロン抗体を、ケーラー（Ｋ
ｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｌｎ）
の方法（ｇｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ６Ｌ＃
２９２頁（１９７６）］により製造する。ジゴキシンに
対応するモノクロン抗体を含有する腹水を、硫酸アンモ
ニウム沈Ｒ及ヒＤｇＡｇセルロース通過によ０精製して
ＩｇＣｋ７ラクシヨンを製出した。
ｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｌｎ）
の方法（ｇｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ６Ｌ＃
２９２頁（１９７６）］により製造する。ジゴキシンに
対応するモノクロン抗体を含有する腹水を、硫酸アンモ
ニウム沈Ｒ及ヒＤｇＡｇセルロース通過によ０精製して
ＩｇＣｋ７ラクシヨンを製出した。
Ｒ，Ｒ，ポーター（Ｆｏｒｔｅｒ）法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 Ｊ、 ７６＋１１９〜１２６頁（１９５９））によ
りパパイン分解（Ｐａｐａｉｎ−８ｐａｌｔｕｎｇ）
ｆ行った。Ｆａｂ片を、未消化Ｉ＆Ｇ分子及びＦｃ片か
ら、セファデクスＧ１００によるデル濾過及びＤＥＡＥ
セルロースによるイオン交換クロマトグラフィーを用い
て文献規定（Ｋ、マリノブスキー及びマンス牛−二〇メ
ンツヅ・イン・エンチモロゾ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”、Ｊ、 、ｌＴ、ランデン及
びＨ，７アン・バナキス編、アカデミツク・プレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、 ｖｏｌ、 ７３
（１９８１）、４１８〜４５９頁〕に従って分離した。
、 Ｊ、 ７６＋１１９〜１２６頁（１９５９））によ
りパパイン分解（Ｐａｐａｉｎ−８ｐａｌｔｕｎｇ）
ｆ行った。Ｆａｂ片を、未消化Ｉ＆Ｇ分子及びＦｃ片か
ら、セファデクスＧ１００によるデル濾過及びＤＥＡＥ
セルロースによるイオン交換クロマトグラフィーを用い
て文献規定（Ｋ、マリノブスキー及びマンス牛−二〇メ
ンツヅ・イン・エンチモロゾ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”、Ｊ、 、ｌＴ、ランデン及
びＨ，７アン・バナキス編、アカデミツク・プレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、 ｖｏｌ、 ７３
（１９８１）、４１８〜４５９頁〕に従って分離した。
生じるＦａｂ ７ラクシヨンを、前記のようにして製造
した第１固相を充填したカラム上に供給した。初めの溶
離緩衝液は０．１Ｍ燐ｅ！六トリクム（ｐＨ７，２）及
びＱ、９ Ｍ Ｎａ（Ｊでおった。非特異性の、 つま
りジゴキシンに対応しないＦａｂ片の溶離後に、１Ｍプ
ロシリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｓ５Ｉ′ｕｒｅ） ｔ
−用いてジゴキシンに対応するＦａｂ片が溶離された。
した第１固相を充填したカラム上に供給した。初めの溶
離緩衝液は０．１Ｍ燐ｅ！六トリクム（ｐＨ７，２）及
びＱ、９ Ｍ Ｎａ（Ｊでおった。非特異性の、 つま
りジゴキシンに対応しないＦａｂ片の溶離後に、１Ｍプ
ロシリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｓ５Ｉ′ｕｒｅ） ｔ
−用いてジゴキシンに対応するＦａｂ片が溶離された。
溶離液を次に水に対して透析し、限外濾過によって濃縮
しかつ凍結乾燥した。ジゴキシンに対応するＦａｂ片を
、ヘテロニ官能性試薬Ｎ−（−ｍ−マレインーイミＶ−
べ／ジイルオキシ）スクシンイミ）Ｆ （ＭＢＳ）と反
応させ、次にＴ、キチヮｉｆ （Ｋｉｔｉｗａｇａ）の
規定〔”エンチーム・イムノアセイ（Ｅｎｚｙｍｅ 工
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）”；インヵヮ（工ｓｈｉｋａｗ
ａ） 、Ｔ、カワイ（Ｋａｗａｉ）、Ｋ、ミャイ（Ｍｉ
ｙａｉ）編、医学書院、東京／ニューヨーク（１９８１
）、８１〜８９頁〕Ｋ従ってβ−ガラクトシダーゼに結
合した。結合後ＫＦａｂ−β−ガラクトシダーゼ結合体
に、前記著者達が記載しているようにセファロース６Ｂ
にょるデル濾過を施こす。遊離の、つまり未結合β−が
ラクトシダーゼを含有しない７，９クシミンを使用した
０ ２６ ノコ９キシンの測定 ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリ／カー・マンハイ
ムｍｚｖｒ−＋ッ） （Ｅｌｉｓａ−Ｋｉｔ） カら取
る〕を、０．９％ＮａＣＪ溶液で１ ： ７．５に希釈
した。希釈した標準２００μｍに、結合体（前記のよう
にして製造）２００μｘ Ｃ２０ｍＴｌ／”ｓオルト−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドでｄｌｌ定）ｔ
−加えた。同結合体は次の緩衝液：０．１Ｍ＃改ナトリ
ウムＣｐＪ（７，２）Ｑ、２Ｎａ（Ｊ ２ ｍＭ ＭｇＣ１゜ １％ウシ血清アルデミン 中に溶解している。
しかつ凍結乾燥した。ジゴキシンに対応するＦａｂ片を
、ヘテロニ官能性試薬Ｎ−（−ｍ−マレインーイミＶ−
べ／ジイルオキシ）スクシンイミ）Ｆ （ＭＢＳ）と反
応させ、次にＴ、キチヮｉｆ （Ｋｉｔｉｗａｇａ）の
規定〔”エンチーム・イムノアセイ（Ｅｎｚｙｍｅ 工
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）”；インヵヮ（工ｓｈｉｋａｗ
ａ） 、Ｔ、カワイ（Ｋａｗａｉ）、Ｋ、ミャイ（Ｍｉ
ｙａｉ）編、医学書院、東京／ニューヨーク（１９８１
）、８１〜８９頁〕Ｋ従ってβ−ガラクトシダーゼに結
合した。結合後ＫＦａｂ−β−ガラクトシダーゼ結合体
に、前記著者達が記載しているようにセファロース６Ｂ
にょるデル濾過を施こす。遊離の、つまり未結合β−が
ラクトシダーゼを含有しない７，９クシミンを使用した
０ ２６ ノコ９キシンの測定 ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリ／カー・マンハイ
ムｍｚｖｒ−＋ッ） （Ｅｌｉｓａ−Ｋｉｔ） カら取
る〕を、０．９％ＮａＣＪ溶液で１ ： ７．５に希釈
した。希釈した標準２００μｍに、結合体（前記のよう
にして製造）２００μｘ Ｃ２０ｍＴｌ／”ｓオルト−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドでｄｌｌ定）ｔ
−加えた。同結合体は次の緩衝液：０．１Ｍ＃改ナトリ
ウムＣｐＪ（７，２）Ｑ、２Ｎａ（Ｊ ２ ｍＭ ＭｇＣ１゜ １％ウシ血清アルデミン 中に溶解している。
標準及び結合体を６７゛Ｃで正確に５分間恒温保持する
。次に第１固相５０μｌを加える。混合物をさらに５分
間振盪下に６７℃で恒温保持する。次にエペンドルフ（
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機５４／４を用いて１分間遠
心分離する。上澄みから３００μｌを取出し、第２固相
５０μ工を加えかつ振盪下に６７℃で恒温保持する。こ
の５分の経過後に混合物を遠心分離し、上澄みを棄て、
ペレットを上記緩衝液を用いてさらに２回洗浄する。洗
浄したペレットに、０．１Ｍ燐酸ナト リ ウ ム
（ｐＨ７，２） 、 ０，９ ％ Ｎ
ａ（Ｊ 、 ２ ｍＭ ＭｌＩＣ１２から
成る緩衝液中に溶かしたクロルフェノールロート−β−
ガラクトシドの６ｍＭ溶液０．６ｍｌを加え、溶液を懸
濁し、振盪下に５分間恒温保持する（３７’Ｏ）、上澄
みから［］、５ｍを取り、それから５７８ ｎｍで光学
濃度を測定する。第２図はこのようにして得られた較正
曲線のグラフである。未希釈血清のジゴキシン鏝度（Ｘ
軸）に対して、それに相応する光学濃度（Ｙ＠）がプロ
ットしておる。
。次に第１固相５０μｌを加える。混合物をさらに５分
間振盪下に６７℃で恒温保持する。次にエペンドルフ（
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機５４／４を用いて１分間遠
心分離する。上澄みから３００μｌを取出し、第２固相
５０μ工を加えかつ振盪下に６７℃で恒温保持する。こ
の５分の経過後に混合物を遠心分離し、上澄みを棄て、
ペレットを上記緩衝液を用いてさらに２回洗浄する。洗
浄したペレットに、０．１Ｍ燐酸ナト リ ウ ム
（ｐＨ７，２） 、 ０，９ ％ Ｎ
ａ（Ｊ 、 ２ ｍＭ ＭｌＩＣ１２から
成る緩衝液中に溶かしたクロルフェノールロート−β−
ガラクトシドの６ｍＭ溶液０．６ｍｌを加え、溶液を懸
濁し、振盪下に５分間恒温保持する（３７’Ｏ）、上澄
みから［］、５ｍを取り、それから５７８ ｎｍで光学
濃度を測定する。第２図はこのようにして得られた較正
曲線のグラフである。未希釈血清のジゴキシン鏝度（Ｘ
軸）に対して、それに相応する光学濃度（Ｙ＠）がプロ
ットしておる。
例 ６
第１固相としてジゴキシン類似物を使用してジゴキシン
を測定： １、 試薬 試薬及び第２固相の種類及び製造は例１と同様であるが
、但し第１固相、ウサギエｇＣ）へのジギトキシンの結
合は異なる。
を測定： １、 試薬 試薬及び第２固相の種類及び製造は例１と同様であるが
、但し第１固相、ウサギエｇＣ）へのジギトキシンの結
合は異なる。
クチャｘｇａを前記のようにして夷出し、ナトリウム−
メタ−過沃素酸塩で酸化し、ウサギＩｇＧに結合した。
メタ−過沃素酸塩で酸化し、ウサギＩｇＧに結合した。
この方法及び技術的細目は、ｖ、 ｐ、パトラ−（Ｂｕ
ｔｌｅｒ） ｊｒ及びＪ、 Ｐ、テエン（Ｃｈｅｎ）Ｃ
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ 、 ５
７ 。
ｔｌｅｒ） ｊｒ及びＪ、 Ｐ、テエン（Ｃｈｅｎ）Ｃ
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ 、 ５
７ 。
７頁（１９６７））及びＴ、 Ｗ、スミス（Ｓｍｉｔｈ
）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９ 、 ３３１〜３３７頁（
１９７０））によって詳細に記載されている。担体タン
パク質としては、これらの両規定とは異なり、血清アル
ブミンではな（、ＤＢ、化セルロースにより精製したウ
サヤ馳Ｇを使用した。
）等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９ 、 ３３１〜３３７頁（
１９７０））によって詳細に記載されている。担体タン
パク質としては、これらの両規定とは異なり、血清アル
ブミンではな（、ＤＢ、化セルロースにより精製したウ
サヤ馳Ｇを使用した。
ジブキシン５Ｉダで誘導されたフサヤニｇＧを０．１Ｍ
燐酸ナトリウム（ｐＨ７，２） ＋ ０．９ ％ Ｎａ
ＣＪの緩衝液５ｄ中に溶かす。このものに、ウサギＩｇ
Ｇ （約１００Ｔｎ９）Ｋ対応するヒツジＩｇＧ （硫
酸アンモニウム分別及びＤＥＡＥセルロースクロマトグ
ラフィーによりｆｆ裂） ｔ−同じ緩衝液に爵かした溶
液を加える。沈殿物が形成されるが、このものを室温で
約１時間放置する。次に沈殿物を遠心外４随し、次、い
で同じ緩衝液１０ゴ中で再懸濁する。この遠心分離及び
再懸濁の工程を４回反復する。次に沈殿物を上記緩衝放
１０Ｍ中に取る。
燐酸ナトリウム（ｐＨ７，２） ＋ ０．９ ％ Ｎａ
ＣＪの緩衝液５ｄ中に溶かす。このものに、ウサギＩｇ
Ｇ （約１００Ｔｎ９）Ｋ対応するヒツジＩｇＧ （硫
酸アンモニウム分別及びＤＥＡＥセルロースクロマトグ
ラフィーによりｆｆ裂） ｔ−同じ緩衝液に爵かした溶
液を加える。沈殿物が形成されるが、このものを室温で
約１時間放置する。次に沈殿物を遠心外４随し、次、い
で同じ緩衝液１０ゴ中で再懸濁する。この遠心分離及び
再懸濁の工程を４回反復する。次に沈殿物を上記緩衝放
１０Ｍ中に取る。
２、ノコ９キシンの測定
ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリンガー・マンハイ
ム製エリデーキット（ＥｌｉＳａ−Ｋｉｔ）から取る、
Ｂｅ５ｔ、 Ｎｒ、 １９９６５６ ）を、０．９％Ｎ
ａＣＪ溶液で１ ： ７．５に希釈した。この希釈標準
２００μｍに、３．７で記載したようにして製造した結
合体（２０ｍＵ／Ｍ、オルトーニトロフェニ〃−β−Ｄ
−ガ２クトシドで測定）２００μｍを加えた。結合体は
次の緩衝液中に溶解している： ０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，２）０．２％ＮａＣ
ｊ ２ｍＭ ＭｇＣｕ２ １チウシ血清アルデミン。
ム製エリデーキット（ＥｌｉＳａ−Ｋｉｔ）から取る、
Ｂｅ５ｔ、 Ｎｒ、 １９９６５６ ）を、０．９％Ｎ
ａＣＪ溶液で１ ： ７．５に希釈した。この希釈標準
２００μｍに、３．７で記載したようにして製造した結
合体（２０ｍＵ／Ｍ、オルトーニトロフェニ〃−β−Ｄ
−ガ２クトシドで測定）２００μｍを加えた。結合体は
次の緩衝液中に溶解している： ０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，２）０．２％ＮａＣ
ｊ ２ｍＭ ＭｇＣｕ２ １チウシ血清アルデミン。
標準及び結合体ｔ−６７℃で正確に５分恒温保持する。
次いで第１固相５０μｍを加える。混合物を振盪下にさ
らに５分３７℃で恒温保持する。次にエペンドル７遠心
機５４／４を用いて１分間遠心＋ｉを行う。上置みかう
３００μｍｔ−取り、第２固相５０μｍを加え、振盪下
に３７゛Ｃで恒温保持する。混合物をこの５分の経過後
に遠心分離し、上澄みを棄て、ペレットを前記緩衝液で
さらに２回洗浄する。０．１Ｍ燐酸ナトリウム（声７．
２）、０−９ ％ Ｎａ（Ｊ、 ２ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２
から成る緩衝液に溶かしたクコルフェノールロートーβ
−がラクトンげの６ｍＭ溶液０．６ｒｎｌを刃口え、害
液を懸濁し、振盪下に５分恒温保持する（６７″Ｃ）。
らに５分３７℃で恒温保持する。次にエペンドル７遠心
機５４／４を用いて１分間遠心＋ｉを行う。上置みかう
３００μｍｔ−取り、第２固相５０μｍを加え、振盪下
に３７゛Ｃで恒温保持する。混合物をこの５分の経過後
に遠心分離し、上澄みを棄て、ペレットを前記緩衝液で
さらに２回洗浄する。０．１Ｍ燐酸ナトリウム（声７．
２）、０−９ ％ Ｎａ（Ｊ、 ２ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２
から成る緩衝液に溶かしたクコルフェノールロートーβ
−がラクトンげの６ｍＭ溶液０．６ｒｎｌを刃口え、害
液を懸濁し、振盪下に５分恒温保持する（６７″Ｃ）。
次いで上記のように遠心分離する。上澄みからｏ、ｓＭ
ｔ−＝す、それから光学浸度を５７８ ｎｍで測定する
。第３図は、このようにして得られた較正曲線のグラフ
である。未希釈血清のジゴキシン濃度（Ｘ軸）に対して
それに相応する光学液度（Ｙ軸）がプロットしである。
ｔ−＝す、それから光学浸度を５７８ ｎｍで測定する
。第３図は、このようにして得られた較正曲線のグラフ
である。未希釈血清のジゴキシン濃度（Ｘ軸）に対して
それに相応する光学液度（Ｙ軸）がプロットしである。
第１図、第２図及び第６図は血清中のジゴキシン濃度と
相応する光学濃度との関係を示すグラフである。 Ｎ＝ ５ ＦＩＧ、２ Ｙ ＦＩＧ、３
相応する光学濃度との関係を示すグラフである。 Ｎ＝ ５ ＦＩＧ、２ Ｙ ＦＩＧ、３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、被測定抗原性物質を、同物質に対応する標識された
第１抗体又はそのＦａｂ又はＦａｂ′片から成る結合体
と一緒に恒温保持し、反応混合物を固相で存在する被測
定抗原性物質又はその類似物と一緒に特定時間の間恒温
保持し、液相を分離し、場合によっては固相を洗浄しか
つ洗浄液を液相と一緒にすることによって抗原性物質を
免疫化学的定量的に測定するに当り該液相を、次に前記
結合体又は結合体と被測定抗原性物質とから成る複合体
に対応する固相で存在する第２抗体と接触させ、第２抗
体が複合体に対応しない場合には交叉反応された複合体
の成分と接触させず、固相を分離し、場合によっては洗
浄しかつ固相に結合された標識を測定することを特徴と
する抗原性物質の免疫化学的定量的測定方法。 ２、抗原性物質としてハプテンを使用する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、マーカーとして酵素を使用する特許請求の範囲第１
項又は第２項記載の方法。 ４、固体担体に結合された、固相で存在する抗原性物質
を使用する特許請求の範囲第１項から第３項までのいず
れか１項記載の方法。 ５、抗原性物質が担体に共有的に、吸着的に又は沈殿に
よって結合されている特許請求の範囲第４項記載の方法
。 ６、固体担体に結合された第２抗体を使用する特許請求
の範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法
。 ７、第２抗体が担体に共有的に、吸着的に又は沈殿によ
って結合されている特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、結合体を、試料中に存在する被測定物質に対して過
剰に使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、結合体の量及び試料と一緒の恒温保持の時間を、最
初の恒温保持後になお遊離結合体が存在するように相互
に調整する特許請求の範囲第１項から第７項までのいず
れか１項記載の方法。 １０、結合体がモノクロン抗体又はそのＦａｂ／Ｆａｂ
′片を含む特許請求の範囲第１項から第９項までのいず
れか１項記載の方法。 １１、第２抗体がモノクロン又はそのＦａｂ／Ｆａｂ′
である特許請求の範囲第１項から第１０項までのいずれ
か１項記載の方法。 １２、抗原性物質の免疫化学的測定試薬において、ａ）
被測定物質に対応する標識された第１抗体又はそのＦａ
ｂ又はＦａｂ′片から成る結合体、ｂ）固相で存在する
抗原、 ｃ）結合体又は結合体と被測定物質から成る複合体に対
応する、固相で存在する第２抗 体、 ｄ）標識物質を測定するための系 を、含有することを特徴とする前記試薬。 １３、結合体が標識物質として酵素を含む特許請求の範
囲第１２項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3433652.4 | 1984-09-13 | ||
| DE19843433652 DE3433652A1 (de) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | Immunchemisches messverfahren fuer haptene und proteine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6171361A true JPS6171361A (ja) | 1986-04-12 |
| JPH0467914B2 JPH0467914B2 (ja) | 1992-10-29 |
Family
ID=6245328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60198711A Granted JPS6171361A (ja) | 1984-09-13 | 1985-09-10 | 抗原性物質の免疫化学的定量的測定方法及び試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670383A (ja) |
| EP (1) | EP0174652B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6171361A (ja) |
| AT (1) | ATE51449T1 (ja) |
| CA (1) | CA1256025A (ja) |
| DE (2) | DE3433652A1 (ja) |
| ES (1) | ES8605104A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007503831A (ja) * | 2003-09-02 | 2007-03-01 | エル． ロートン、ロバート | 可溶性検体の検出および増幅 |
| JP2009508695A (ja) * | 2005-09-16 | 2009-03-05 | パスクワーレ カタルファーモ， | 研磨体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8408193D0 (en) * | 1984-03-30 | 1984-05-10 | Cambridge Patent Dev | Antibodies |
| GB2161165A (en) * | 1984-06-12 | 1986-01-08 | Cambridge Patent Dev | Secondary antibodies |
| WO1987007147A1 (en) * | 1986-05-28 | 1987-12-03 | Murex Corporation | Method for producing monoclonal antibodies to an immunogenic antibody-antigen conjunction |
| US5223441A (en) * | 1986-10-09 | 1993-06-29 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Receptors for immune complexes |
| DE3705686C2 (de) * | 1987-02-23 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern |
| CA1326814C (en) * | 1987-08-11 | 1994-02-08 | Eiji Ishikawa | Method of high sensitivity immunoassay |
| US5236849A (en) * | 1987-08-11 | 1993-08-17 | Eiji Ishikawa | Method of high sensitivity immunoassay |
| US5468651A (en) * | 1987-11-28 | 1995-11-21 | Cambridge Patent Developments Limited | Method for determining haptens, use of method and components useful in method |
| US6287793B1 (en) | 1988-08-19 | 2001-09-11 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostic methods for alzheimer's disease |
| US5445936A (en) * | 1993-09-15 | 1995-08-29 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for non-competitive binding assays |
| DE4418513A1 (de) * | 1994-05-27 | 1995-11-30 | Bayer Ag | Immuntest zum Nachweis hochmolekularer Antigene |
| US5817527A (en) * | 1995-11-06 | 1998-10-06 | Chiron Diagnostics Corporation | Conjugation of ligand to immobilized protein in organic solvent |
| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| JPH11153599A (ja) * | 1997-11-21 | 1999-06-08 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定方法 |
| CA2455793A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-02-27 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Method and apparatus for rapid determination of ligand-protein binding using charcoal adsorption |
| FI20085579A0 (fi) * | 2008-06-12 | 2008-06-12 | Valtion Teknillinen | Kannabiskäytön toteaminen |
| DE102008049601A1 (de) * | 2008-09-30 | 2010-04-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Antikörper zur Bestimmung des Prothrombin-Fragments F2/F1+2 in einem homogenen Immunoassay |
| CN111138381B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-05-31 | 国家海洋环境监测中心 | 一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3720760A (en) * | 1968-09-06 | 1973-03-13 | Pharmacia Ab | Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples |
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US4048298A (en) * | 1975-02-25 | 1977-09-13 | Rohm And Haas Company | Solid phase double-antibody radioimmunoassay procedure |
| US4056608A (en) * | 1976-04-08 | 1977-11-01 | Syva Company | Cardiac glycoside or aglycone assays |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
-
1984
- 1984-09-13 DE DE19843433652 patent/DE3433652A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-09-09 ES ES546794A patent/ES8605104A1/es not_active Expired
- 1985-09-09 CA CA000490280A patent/CA1256025A/en not_active Expired
- 1985-09-10 JP JP60198711A patent/JPS6171361A/ja active Granted
- 1985-09-11 DE DE8585111492T patent/DE3576854D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-11 EP EP85111492A patent/EP0174652B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-11 AT AT85111492T patent/ATE51449T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-09-13 US US06/775,596 patent/US4670383A/en not_active Expired - Lifetime
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| JP2012010712A (ja) * | 2003-09-02 | 2012-01-19 | Restalyst Pte Ltd | 可溶性検体の検出および増幅 |
| US9181579B2 (en) | 2003-09-02 | 2015-11-10 | Restalyst Pte Ltd | Soluble analyte detection and amplification |
| JP2009508695A (ja) * | 2005-09-16 | 2009-03-05 | パスクワーレ カタルファーモ， | 研磨体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0174652A3 (en) | 1987-07-01 |
| US4670383A (en) | 1987-06-02 |
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| DE3433652A1 (de) | 1986-03-20 |
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| JPH0467914B2 (ja) | 1992-10-29 |
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| CA1256025A (en) | 1989-06-20 |
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