JPH0467914B2 - - Google Patents

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JPH0467914B2
JPH0467914B2 JP60198711A JP19871185A JPH0467914B2 JP H0467914 B2 JPH0467914 B2 JP H0467914B2 JP 60198711 A JP60198711 A JP 60198711A JP 19871185 A JP19871185 A JP 19871185A JP H0467914 B2 JPH0467914 B2 JP H0467914B2
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conjugate
antibody
solid phase
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fab
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Boehringer Mannheim GmbH
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Publication of JPH0467914B2 publication Critical patent/JPH0467914B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗原性物質の免疫学的測定方法及び
該方法にとつて適当な試薬に関する。
従来の技術 免疫試験の発達は、放射免疫法（RIA）から出
発して、タンパク質及びハプテンのような抗原性
物質測定の感受性及び選択性を決定的に改善する
に至り、特に臨床的化学試験室では極めて重要に
なつた。このような方法の引続く開発によつて従
来使用されている標識方法〔放射標識のほかに就
中酵素標識（EIA）が特に重要になつた〕の普及
と並んでまた反応方法の開発も著しく分化され
た。すなわち均質相及び不均質相で進行するテス
トが開発されたが、後者の場合には一般に必要な
固相と液相の分離が遅延及び希釈の問題を生じる
可能性がある。
このような方法の場合には特に、被測定抗原性
物質（以下略して抗原と称する）の量に正比例す
る測定信号が所望される。さらに被検溶液の成
分、特に血清成分による妨害が確実に回避される
方法管理も所望される。最後に該方法は極めて高
い感受性を有し、特にハプテンの場合にしばしば
存在するようなピコモル（Pikomol）範囲でもな
お十分に正確な結果を与えなければならない。
抗体のとり得る結合部位が唯一個しかないため
に特に難点を生じるハプテンの場合には、正確に
計量された量の抗ハプテン抗体及び標識ハプテン
を、試料中で抗体における結合に関して被測定ハ
プテンと競争させるように測定を行うことはすで
に公知である（西独国特許出願公告第2155658
号）。この方法の場合には成程異種成分による妨
害は除去されうるけれども、競争原理のために感
受性が小さすぎる。また所謂IEMA法も公知であ
り、この方法の場合にはタンパク質を任意過剰で
存在する標識抗体と反応させ、未反応抗体を固相
で存在するタンパク質を用いて分離し、次いで液
相で残存する標識抗体の量を測定することによつ
て行われる〕ランセツト（Lancet）、1968年８
月、492〜493頁〕。さらに西独特許出願公告第
2743444号からは、前記IEMA法の場合に完全抗
体の代りにそのFab片を使用してハプテン及びタ
ンパク質を測定することも公知である。これらの
方法の欠点は、異種物質による妨害の起るおそれ
があり、標識抗体又はその断片が正確に計量され
なければならないことである。
発明の解決しようとする問題点 本発明は、前記欠点をもはや有しない方法にお
いて上述の条件を結合するという課題を基礎にし
ている。
特に本発明の課題は、測定の際に関係しないか
又は極めて妨害する可能性のある血清成分を除去
し、固相を感受性の損失なしに洗浄することがで
きかつ感受性の増大を達成することである。
問題点を解決するための手段 前記課題は本発明により、被測定抗原性物質
を、同物質に対応する標識された第１抗体又はそ
のFab又はFab′片から成る結合体（Binder）と
共に恒温保持し、反応混合物を固相で存在する被
測定抗原性物質又はその類似物と一緒に特定時間
の間恒温保持し、液相を分離し、場合によつては
固相を洗浄しかつ洗浄液を液相と一緒にすること
によつて抗原性物質を免疫化学的定量的に測定す
る方法において、該液相を、次に結合体又は結合
体と被測定物質とから成る複合体（Komplex）
の結合部位に特異的に対応する、固相で存在する
第２抗体と接触させ、固相を分離し、場合によつ
ては洗浄しかつ固相に結合された標識を測定する
ことを特徴とする前記方法によつて解決される。
本発明による方法は、２つの別種の固相を用
い、従つて液相と固相の分離が２回必要であるけ
れども、意外にも極めて高い精度を有する。この
ような方法の場合には、固体における非特異性吸
着のために遅延によつて有用性を失う不精確さを
予想するであろう。このことは、第一番目の固相
の分離後の付加的洗浄段階が液相を希釈すること
になる場合には、それだけ一層認められる。
また本発明による方法は、特に極めて少量のハ
プテン、つまりそれ自体非抗原性であるが、別の
抗原性物質と結合することによつて特異的抗体形
成を誘起することのできる物質の測定にとつても
適当である。従来ハプテンは所謂“サンドウイツ
チ”法によつては測定することができなかつた、
それというのもハプテンはその分子量が小さいた
めに抗体の取りうる若干の結合部位しか有しない
からである。しかしまた本発明方法は、他の抗
原、特にタンパク質及びアレルゲンの測定にとつ
ても適当である。
本発明による方法で使用される結合体は、上述
のように、被測定抗原性物質に対応する標識第１
抗体又はそのFab又はFab′片から成る。該結合体
は本発明の範囲では、試料中の被測定物質の量に
対して任意過剰で使用してもよい。しかしまた、
被測定物質との恒温保持時間が、固相で存在する
被測定物質と反応することのできる非結合分がな
お存在するように短く選定される場合には、該結
合剤をモル過剰で使用することもできる。この際
第１抗体はポリクロン（polyklonal）又はモノク
ロン（monoklonal）抗体であつてよい。
マーカーとしては、免疫化学的方法で常用され
るマーカー、すなわち光学的に測定可能の基又は
化合物例えば螢光性又は着色物質、発色成分等、
特に放射性原子及び化合物、ならびに酵素が適当
である。最後のマーカーは、放射性物質、螢光標
識物等に必要な特別な装置なしに単純に測定可能
であるために有利である。標識酵素としては、有
利には酵素免疫検定で常用の酵素、すなわちペル
オキシダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、
カタラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−燐酸−デヒドロゲナーゼ
及びβ−アミラーゼを使用する。特に、ペルオキ
シダーゼ（安定であり、生成H2O2により有利に
測定できるため）及びβ−ガラクトシダーゼが好
ましい。
本発明の範囲で使用される第１固相は、結合さ
れた抗原又はその類似物を含有する。ここに類似
物とは、被測定物質自体より少なくとも少量であ
つても第１抗体と交叉反応する化学的類似物質の
ことである。抗原は有利には共有又は吸着結合を
もつて又は沈殿によつて適当な不活性担体に結合
されている。この方法は当業者に周知であつて、
ここに詳細に述べる必要はない。また当該担体材
料についても同様なことがいえる。一般にガラ
ス、プラスチツク又は合成又は天然ポリマー例え
ばセルロース、デキストラン、スチロール重合体
等が使用される。イオン交換体及び非特異性吸着
剤も使用してよい。これらの担体材料も同様に当
業者には周知である。固相で存在する抗原は本発
明方法の範囲では精密な計量を要しない。ただ抗
原は、試料中の被測定抗原によつてすでに結合さ
れていない過剰の結合体を、抗原−抗体反応によ
つて固定するのに十分でなければならない。
また、同様に固相で存在する第２抗体も、上述
方法により担体に結合されていてもよい。この第
２抗体の場合にも本発明方法では精密な計量を要
しない。第２抗体は、固相で存在する被測定物質
から分離された液相で存在する、結合体と被測定
物質から成る複合体をサンドウイツチ状に固定す
るのに十分な量で存在すれば十分である。この際
第２抗体は、第１抗体、そのFab又はFab′又はそ
の標識物質に対応していてもよい。また第２抗体
は、結合体が被測定物質と共に形成する複合体自
体に対応していてもよい。この場合には第２抗体
は形成された複合体におけるマーカーとも第１抗
体とも交叉反応してはならない、つまり第２抗体
は結合体と被測定物質との間の結合に対して特異
的でなければならない。こうして第２抗体は、液
相で存在していて、第１固相によつて結合されな
かつた抗原−標識結合体の複合体と結合し、かつ
液相の分離及び洗浄後に担体結合標識が測定され
る。これは、酵素標識の場合には常法により標識
酵素の測定のための液状試薬との接触によつて簡
単に行われる。マーカーが酵素でない場合には、
その測定は同様に当業者に周知の公知法により行
われる。第２抗体はポリクロン又はモノクロン抗
体又はそのFab／Fab′片であつてよい。
本発明による方法の場合、結合体を被測定物質
に対して過剰又は不足で加えるかどうかに応じ
て、第一番目の恒温保持の際に、結合体と被測定
物質とから成る複合体、残りの遊離結合体及び場
合によつては残りの遊離被測定物質から成る反応
混合物が得られる。後者の場合は、恒温保持が極
めて短時間であつて、全被測定物質が複合体に入
らず、結合体が過剰に存在する場合に該当する。
第二番目の恒温保持によつて前記反応混合物か
ら固相が分離される、それというのもこの固相に
は遊離結合体のみが固定されるが、複合体中に含
有された結合体は固定されないからである。従つ
て相分離が終ると複合体は液相となりかつこの液
相から、固相で存在する第２抗体と一緒に分離さ
れる。第２固相に固定された複合体は従つて被測
定物質に正比例する量の結合体標識を含有する。
次にマーカーの量が測定される。マーカーが例え
ばβ−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼの
ような酵素の場合には該酵素の検出は公知で行わ
れる。同様にして放射性標識の検出は相応の測定
装置により、光学的標識は光学装置により行われ
る。
本発明による方法は高い精度を有し、変動係数
は、抗原としてのハプテンを約1nｇ／mlの濃度
範囲で測定する場合一般に５〜10％である。
本発明による方法は、抗原を含有する被検溶液
の他の成分によつて妨害されず、その結果特に血
清成分による頻繁な妨害現象が除去される。また
本発明方法は、使用される種々の成分、すなわち
結合体、固相で存在する抗原及び第２抗体の精密
な計量を要しない。さらに該方法は被測定抗原の
現存量に正比例する測定値を与える。
また本発明の対象は、前記の抗原性物質の免疫
化学的定量的測定方法を実施するための試薬であ
り、その特徴とするところは、 (a) 被測定物質に対応する標識された第１抗体又
はそのFab又はFab′片から成る結合体、 (b) 固相で存在する抗原 (c) 結合体又は結合体と被測定物質から成る複合
体の結合部位に特異的に対応する固相で存在す
る第２抗体及び (d) 標識物質の測定系 を含有することである。
本発明による試薬は、有利な一実施態様におい
ては、酵素含有結合体及び同酵素を測定するため
の系を含有している。
次に実施例により本発明を詳述する。
実施例 例 １ ヒト血清中のジゴキシンの測定方法 １ 試薬 ジゴキシンに対応する抗血清の製造： ジゴキシンと結合される免疫原、すなわちヒ
ト血清アルブミンの製造は、V.P.バトラー
（Butler）jr.及びJ.P.チエン（Chen）〔Proc.
Nat.Acad.Sci.US、51、71〜78頁（1967）〕及
びT.W.スミス（Smith）、V.P.バトラー及びE.
E.ハーバー（Haber）〔ビオケミストリー
（Biochemistry）９、331〜337頁（1970）〕に
よつて詳細に記載されているように行われた。
この免疫原を用いてヒツジを免疫化し、相応す
る抗血清を作つた。
β−ガラクトシダーゼに対応する抗血清の製
造： β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム、Best.Nr.570079）を用いてヒツジを免
疫化し、相応する抗血清を作つた。
文献：E.イシカワ（Ishikawa）、S.ヨシタケ
（Yositake）：“エンチーム・イムノアセイ
（Enzyme Immunoassay）”、E.イシカワ、T.
カワイ（Kawai）、K.ミヤイ（Miyai）編、医
学書院、東京／ニユーヨーク（1951）。
ウサギIgGに対応する抗血清の製出： ウサギ屠殺血清にNH4SO4を1.8Mまで加え
た。沈殿物を、15ｍＭ燐酸ナトリウム（PH7.0）
及び50ｍＭ NaClから成る緩衝液中に取り、
こうして得られた溶液をDEAEセルロース上に
通過させた。IgGを含有するフラクシヨンは凍
結乾燥し、免疫原として使用した。この免疫原
を用いてヒツジを免疫化し、相応する抗血清を
得た。
第１固相の製造： ウサギIgGへのジゴキシンの結合： ウサギIgGを前記のようにして製出した。ジ
ゴキシンをナトリウム−ｍ−過沃素酸塩で酸化
し、ウサギIgGに結合した。方法及び技術的細
部は、V.P.バトラーjr及びJ.P.チエン〔Proc.
Nat.Acad.Sci.US、57、７（1967）〕及びT.W.
スミス等〔Biochem.9、331〜337頁（1970）〕
によつて詳細に記載されている。担体タンパク
質としては上記の両仕様書とは異つて血清アル
ブミンではなく、DEAEセルロースを介して精
製したウサギIgGを使用した。ジゴキシンで誘
導したウサギIgGを、ベーリンガー・マンハイ
ム製“親和性吸着剤、活性化グルタルジアルデ
ヒド（Affinita″ts adsorbens、
Glutardialdehyd aktiviert）”（Best.
Nr.665525）に、同メーカーの作業規定に従い
結合した。
第２固相の製造： この製造は、抗β−ガラクトシダーゼIgGフ
ラクシヨンを、ベーリンガー・マンハイム製
“親和性吸着剤、活性化グルタルジアルデヒド”
（Best.Nr.665525）に、同メーカーの作業規定
に従い結合することによつて行なう。前記IgG
フラクシヨンは、相応する抗血清から硫酸アン
モニウムの沈殿及びDEAEセルロースによるク
ロマトグラフイーにより得られた。
結合体の製造： ジゴキシンに対応する抗血清を、硫酸アンモ
ニウム沈殿及びDEAEセルロース通過により精
製してIgGフラクシヨンを得た。パパイン分解
（Papain−Spaltung）をR.R.ポーター
（Porter）法〔Biochem.J.73、119〜126頁
（1959）〕により行つた。未消化IgG分子及びFc
片からFab片を、セフアデクス（Sephadex）
G100によるゲル濾過及びDEAEセルロースに
よるイオン交換−クロマトグラフイによつて、
文献規定〔K.マリノブスキー（Malinowski）
及びW.マンスキー（Manski）：“メソツヅ・イ
ン・エンチモロジー（Methods in
Enymology）”、J.J.ランゴン（Langone）及び
H.フアン・バナキス（van Vunakis）編、ア
カデミツク・プレス（Academic Press）、
Vol.73（1981）、418〜459頁〕に従つて分離し
た。生じるFabフラクシヨンを第１固相を施し
たカラム上に供給した。初めの溶離緩衝液は
0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）＋0.9M NaClで
あつた。非特異的の、つまりジゴキシンに対応
しないFab片の溶離後に、1Mプロプリオン酸
（Proprionsa″ure）を用いて、ジゴキシンに対
応するFab片を溶離した。次に溶離液を水に対
して透析し、限外濾過によつて濃縮しかつ凍結
乾燥した。ジゴキシンに対応するFab片を、ヘ
テロ−二官能性試薬であるＮ−（−ｍ−マレイ
ン−イミド−ベンゾイルオキシ）スクシンイミ
ド（MBS）と反応させ、次にT.キチワガ
（Kitiwaga）の規定〔“エンチーム・イムノア
セイ”、イシカワ、T.カワイ、K.ミヤイ編、医
学書院、東京／ニユーヨーク（1981）〕に従つ
てβ−ガラクトシダーゼに結合した。この結合
後にEab−β−ガラクトシダーゼ結合体を、前
記著者達によつて記載されているようなセフア
ロース（Sepharose）6Bによるゲル濾過にかけ
た。遊離の、つまり未結合のβ−ガラクトシダ
ーゼを含有しないフラクシヨンを使用した。
２ ジゴキシンの測定 ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリンガ
ー・マンハイム製エリザーキツト（Elisa−
Kit）から取る〕を0.9％NaCl溶液で１：7.5に
希釈した。
希釈した標準200μlに、3.7で記載したように
して製造した結合体200μl（20ｍＵ／ml、オルト
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドを用
いて測定を加えた。結合体は次の緩衝液： 0.1M燐酸ナトリウム PH7.2 0.2％NaCl 2mM MgCl2 １％ウシ血清アルブミン 中に溶解している。
標準及び結合体を37℃で正確に５分恒温保持
した。次に第１固相50μlを加える。混合物を振
盪下にさらに５分間37℃で恒温保持する。次に
エペンドルフ（Eppendorf）遠心機54／４を用
いて１分間遠心分離した。上澄みから300μlを
取り、第２固相50μlを加え、振盪下に37℃で恒
温保持する。混合物をこの５分の経過後に遠心
分離し、上澄みを棄て、ペレツトを上記緩衝援
でさらに２回洗浄する。洗浄したペレツトに、
0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）、0.9％NaCl、２
ｍＭ MgCl2から成る緩衝液中に溶かしたクロ
ロフエノールロート−β−ガラクトシド
（Chlorphenolrot−β−Galactosid）（製造は西
独国特許出願第P3345748号参照）の６ｍＭ溶
液0.6mlを加え、溶液を懸濁し、振盪下に５分
間恒温保持する（37℃）。次いで上記のように
遠心分離する。上澄みから0.5mlを取り、それ
から578nｍで光学濃度を測定する。第１図は
このようにして得られた較正曲線のグラフを示
す。未希釈血清のジゴキシン濃度（Ｘ軸）に対
してそれに相応する光学濃度（Ｙ軸）がプロツ
トしてある。
例 ２ ジゴキシンに対応するモノクロン抗体を用いる
ジゴキシンの測定方法 １ 試薬 第２固相及び結合体の製造以外は、例１で使
用しかつ製造したものと同じ試薬を用いる。
マウスIgGに対応する抗血清の製出： マウス血清にNH4SO4を1.8Mまで加えた。
沈殿物を15ｍＭ燐酸ナトリウム（PH7.0）及び
50ｍＭ NaClから成る緩衝液中に取り、これ
によつて得られた溶液を、DEAEセルロースを
介して通過させる。IgGを含有するフラクシヨ
ンを、凍結乾燥して免疫原として使用した。こ
の免疫原を用いてヒツジを免疫化し、相応の抗
血清を作つた。
第２固相の製造： マウスIgGに対応するヒツジIgGを、“アフイ
ーゲル（Affi−Gel）10”〔アミコン
（Amicon）〕にアミコン社の作業規定に従つて
結合した。結合条件：燐酸ナトリウム緩衝液
（PH7.5、タンパク質濃度８mg／ml）中で４℃で
５時間、次に0.1Mエタノールアミン（PH8.0）
の添加下で室温で３時間。
結合体の製造： ジゴキシンに対応するモノクロン抗体を、ケ
ーラー（Ko″hler）及びミルシユタイン
（Milsteln）の方法〔Eur.J.Immunol.６、292頁
（1976）〕により製造する。ジゴキシンに対応す
るモノクロン抗体を含有する腹水を、硫酸アン
モニウム沈殿及びDEAEセルロース通過により
精製してIgGフラクシヨンを製出した。R.R.ポ
ーター（Porter）法〔Biochim.J.73、119〜126
頁（1959）〕によりパパイン分解（Papain−
Spaltung）を行つた。Fab片を、未消化IgG分
子及びFc片から、セフアデクスG100によるゲ
ル濾過及びDEAEセルロースによるイオン交換
クロマトグラフイーを用いて文献規定〔K.マ
リノブスキー及びマンスキー：“メソツヅ・イ
ン・エンチモロジー（Methods in、
Enzymology）”、J.J・ランゴン及びH.フア
ン・バナキス編、アカデミツク・プレス
（Academic Press）、Vol.73（1981）、418〜459
頁〕に従つて分離した。生じるFabフラクシヨ
ンを、前記のようにして製造した第１固相を充
填したカラム上に供給した。初めの溶離緩衝液
は0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）及び0.9M
NaClであつた。非特異性の、つまりジゴキシ
ンに対応しないFab片の溶離後に、1Mプロプ
リオン酸（Proprionsa″ure）を用いてジゴキ
シンに対応するFab片が溶離された。溶離液を
次に水に対して透析し、限外濾過によつて濃縮
しかつ凍結乾燥した。ジゴキシンに対応する
Fab片を、ヘテロニ官能性試薬Ｎ−（−ｍ−マ
レイン−イミド−ベンゾイルオキシ）スクシン
イミド（MBS）と反応させ、次にT.キチワガ
（Kitiwaga）の規定〔“エンチーム・イムノア
セイ（Enzyme Immunoassay）；イシカワ
（Ishikawa）、T.カワイ（Kawai）、K.ミヤイ
（Miyai）編、医学書院、東京／ニユーヨーク
（1981）、81〜89頁〕に従つてβ−ガラクトシダ
ーゼに結合した。結合後にFab−β−ガラクト
シダーゼ結合体に、前記著者達が記載している
ようにセフアロース6Bによるゲル濾過を施こ
す。遊離の、つまり未結合β−ガラクトシダー
ゼを含有しないフラクシヨンを使用した。
２ ジゴキシンの測定 ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリンガ
ー・マンハイム製エリザーキツト（Elisa−
Kit）から取る〕を、0.9％NaCl溶液で１：7.5
に希釈した。希釈した標準200μlに、結合体
（前記のようにして製造）200μl（20ｍＵ／ml、
オルト−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ドで測定）を加えた。同結合体は次の緩衝液： 0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2） 0.2NaCl ２ｍＭ MgCl2 １％ウシ血清アルブミン 中に溶解している。
標準及び結合体を37℃で正確に５分間恒温保
持する。次に第１固相50μlを加える。混合物を
さらに５分間振盪下に37℃で恒温保持する。次
にエペンドルフ（Eppendorf）遠心機54／４を
用いて１分間遠心分離した。上澄みから300μl
を取出し、第２固相50μlを加えかつ振盪下に37
℃で恒温保持する。この５分の経過後に混合物
を遠心分離し、上澄みを棄て、ペレツトを上記
緩衝援を用いてさらに２回洗浄する。洗浄した
ペレツトに、0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）、
0.9％NaCl、２ｍＭ MgCl2から成る緩衝液中
に溶かしたクロルフエノールロート−β−ガラ
クトシドの６ｍＭ溶液0.6mlを加え、溶液を懸
濁し、振盪下に５分間恒温保持する（37℃）。
上澄みから0.5mlを取り、それから578nｍで光
学濃度を測定する。第２図はこのようにして得
られた較正曲線のグラフである。未希釈血清の
ジゴキシン濃度（Ｘ軸）に対して、それに相応
する光学濃度（Ｙ軸）がプロツトしてある。
例 ３ 第１固相としてジゴキシン類似物を使用してジ
ゴキシンを測定： １ 試薬 試薬及び第２固相の種類及び製造は列１と同
様であるが、但し第１固相、ウサギIgGへのジ
ギトキシンの結合は異なる。
ウサギIgGを前記のようにして製出し、ナト
リウム−メタ−過沃素酸塩で酸化し、ウサギ
IgGに結合した。この方法及び技術的細目は、
V.P.バトラー（Butler）jr及びJ.P.チエン
（Chen）〔Proc.Nat.Acad.Sci.US、57、７頁
（1967）〕及びT.W.スミス（Smith）等
（Biochem.9、331〜337頁（1970）〕によつて詳
細に記載されている。担体タンパク質として
は、これらの両規定とは異なり、血清アルブミ
ンではなく、DEAEセルロースにより精製した
ウサギIgGを使用した。
ジゴキシン５mgで誘導されたウサギIgGを
0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）＋0.9％NaClの緩
衝液５ml中に溶かす。このものに、ウサギIgG
（約100mg）に対応するヒツジIgG（硫酸アンモ
ニウム分別及びDEAEセルロースクロマトグラ
フイーにより精製）を同じ緩衝液に溶かした溶
液を加える。沈殿物が形成されるが、このもの
を室温で約１時間放置する。次に沈殿物を遠心
分離し、次いで同じ緩衝液10ml中で再懸濁す
る。この遠心分離及び再懸濁の工程を４回反復
する。次に沈殿物を上記緩衝液10ml中に取る。
２ ジゴキシンの測定 ヒト血清中のジゴキシン標準〔ベーリンガ
ー・マンハイム製エリザ−キツト（Elisa−
Kit）から取る、Best.Nr.199656〕を、0.9％
NaCl溶液で１：7.5に希釈した。この希釈標準
200μlに、3.7で記載したようにして製造した結
合体（20ｍＵ／ml、オルト−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトシドで測定）200μlを加えた。
結合体は次の緩衝液中に溶解している： 0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2） 0.2％NaCl ２ｍＭ MgCl2 １％ウシ血清アルブミン。
標準及び結合体を37℃で正確に５分恒温保持
する。次いで第１固相50μlを加える。混合物を
振盪下にさらに５分37℃で恒温保持する。次に
エペンドルフ遠心機54／４を用いて１分間遠心
分離を行う。上澄みから300μlを取り、第２固
相50μlを加え、振盪下に37℃で恒温保持する。
混合物をこの５分の経過後に遠心分離し、上澄
みを棄て、ペレツトを前記緩衝援でさらに２回
洗浄する。0.1M燐酸ナトリウム（PH7.2）、0.9
％NaCl、２ｍＭ MgCl2から成る緩衝液中に
溶かしたクロルフエノールロート−β−ガラク
トシドの６ｍＭ溶液0.6mlを加え、溶液を懸濁
し、振盪下に５分間恒温保持する（37℃）。次
いで上記のように遠心分離する。上澄みから
0.5mlを取り、それから光学濃度を578nｍで測
定する。第３図は、このようにして得られた較
正曲線のグラフである。未希釈血清のジゴキシ
ン濃度（Ｘ軸）に対してそれに相応する光学濃
度（Ｙ軸）がプロツトしてある。
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図及び第３図は血清中のジゴキシ
ン濃度と相応する光学濃度との関係を示すグラフ
である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 被測定抗原性物質を、同物質に対応する標識
    された第１抗体又はそのFab又はFab′片から成る
    結合体と一緒に恒温保持し、反応混合物を固相で
    存在する被測定抗原性物質又はその類似物と一緒
    に特定時間の間恒温保持し、液相を分離し、場合
    によつては固相を洗浄しかつ洗浄液を液相と一緒
    にすることによつて抗原性物質を免疫化学的定量
    的に測定するに当り該液相を、次に前記結合体又
    は結合体と被測定抗原性物質とから成る複合体の
    結合部位に特異的に対応する固相で存在する第２
    抗体と接触させ、固相を分離し、場合によつては
    洗浄しかつ固相に結合された標識を測定すること
    特徴とする抗原性物質の免疫化学的定量的方法。 ２ 抗原性物質としてハプテンを使用する特許請
    求の範囲第１項記載の方法。 ３ マーカーとして酵素を使用する特許請求の範
    囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ 固体担体に結合された、固相で存在する抗原
    性物質を使用する特許請求の範囲第１項から第３
    項までのいずれか１項記載の方法。 ５ 抗原性物質が担体に共有的に、吸着的に又は
    沈殿によつて結合されている特許請求の範囲第４
    項記載の方法。 ６ 固体担体に結合された第２抗体を使用する特
    許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか１
    項記載の方法。 ７ 第２抗体が担体に共有的に、吸着的に又は沈
    殿によつて結合されている特許請求の範囲第６項
    記載の方法。 ８ 結合体を、試料中に存在する被測定物質に対
    して過剰に使用する特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 ９ 結合体の量及び試料と一緒の恒温保持の時間
    を、最初の恒温保持後になお遊離結合体が存在す
    るように相互に調整する特許請求の範囲第１項か
    ら第７項までのいずれか１項記載の方法。 １０ 結合体がモノクロン抗体又はそのFab／
    Fab′片を含む特許請求の範囲第１項から第９項
    までのいずれか１項記載の方法。 １１ 第２抗体がモノクロン又はそのFab／
    Fab′である特許請求の範囲第１項から第１０項
    までのいずれか１項記載の方法。 １２ 被測定抗原性物質を、同物質に対応する標
    識された第１抗体又はそのFab又はFab′片から成
    る結合体と一緒に恒温保持し、反応混合物を固相
    で存在する被測定抗原性物質又はその類似物と一
    緒に特定時間の間恒温保持し、次に液相を前記結
    合体又は結合体と被測定抗原性物質とから成る複
    合体の結合部位に特異的に対応する固相で存在す
    る第２抗体と接触させ、固相を分離し、場合によ
    つては洗浄しかつ固相に結合された標識を測定す
    ることから成る抗原性物質の免疫化学的定量的測
    定方法を実施するための試薬において、 (a) 被測定物質に対応する標識された第１抗体又
    はそのFab又は／Fab′片から成る結合体、 (b) 固相で存在する抗原、 (c) 結合体又は結合体と被測定物質から成る複合
    体の結合部位に特異的に対応する、固相で存在
    する第２抗体、 (d) 標識物質を測定するための系、 を含有することを特徴とする前記試薬。 １３ 結合体が標識物質として酵素を含む特許請
    求の範囲第１２項記載の試薬。
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