JPS6247554A - ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定法及びそのためのキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、モノクローナル抗体を用いる免疫化学的測
定法によるヒト上皮細胞成長因子（ｈｕｍａｎＥｐｉｄ
ｅｒｎａｌ　Ｇｒｏｔｍｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　；　ｈ　
Ｅ　Ｇ　Ｆ）の測定法およびそのキットに関する。

〔従来の技術〕

ｈＥＧＦ　（文献１．２〕は、分子量約６０００．５３
個のアミノ酸より構成され、その分子中に３個のジスル
フィド結合を有するポリペプチドである〔文献１５〕。

このｈＥＧＦの生体内における特異的な生理作用は知ら
れていないが、ＥＧＦのりセプター構造が解明〔文献３
〕されて以来、生化学的な研究が進められており、その
ためｈＥＧＦの測定方法の確立が望まれている。

現在までのｈＥＧＦの測定法としては、生物活性を指標
とし行う方法が中心であった。例えば開眼活性を利用し
たもの〔文献４〕、細胞増殖能を利用した方法〔文献５
）　、ＥＧＦリセプター結合能を利用した方法〔文献６
．７〕等がある。しかしながらこれらの測定法はいずれ
も生物学活性を指標とする間接的な測定法であることか
ら測定誤差が大きく、再現性にも問題があり、定量のは
転性に問題を有していた。その上このような測定方法を
行うに際し、その測定操作も一般に複雑であった。従っ
てこのような問題点に対処すべく抗原抗体反応を利用し
た免疫化学的な測定法が開発されるに至った。

例えばｈＥＧＦに対する抗血清を調製し、この抗血清を
用いたラジオイムノアッセイ法によって被検液中のｈＥ
ＧＦを測定する方法〔文献８〕や、同様にｈＥＧＦに対
する抗血清を調製し、この抗血清を用いたエンザイムイ
ムノアッセイ法〔日本薬学会、第１０５回年金（１９８
５）、講演要旨集４Ｈ−ｐＨ）等がある。しかしながら
、これらの方法においては抗血清が使用されており、抗
血清を使用することに起因する種々の問題点が存在する
。例えば抗血清はモノクローナル抗体に比べて一般に抗
体価が低（、これを用いる測定方法の感度は必ずしも十
分ではない。また、抗血清には多数の抗原決定基に対応
する多種類の抗体分子が含まれておりその全体としての
特異性は一般に低い。また１つの抗原決定基に対しても
複数の抗体が存在しヘテロジニアス（ｈｅｔｅｒｏｇｅ
ｎｏｕｓ）である可能性が強い。さらに別の動物固体か
ら同じ性質の抗血清を得ることは実質上不可能であるか
ら、同質の抗血清を多量に得ることはできず、従って高
い信頬性をもって多量の試料を測定することは困難であ
る。また、抗血清を用いて、例えばサンドインチ法のよ
うな、分析対象抗原が有する複数の抗原決定基に対応す
る複数の抗体を用いる測定方法を実施することは不可能
であり、前記文献にはこのような方法は開示されていな
い。

他方、免疫化学的測定法にあっては、測定値を標準曲線
と対比して、標準に用いた分析対象の量をもって測定値
を表現するのがふつうであるので、標準品としては高純
度に精製されたものを用いるのが好ましいが、今までに
高純度（例えば９９％程度以上）に精製されたｈＥＧＦ
を得ることはできなかった。従ってこの点からもｈＥＧ
Ｆの理想的な測定方法は開発されていなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、標準品としての高純度に精製されたｈ
ＥＧＦ、及び品質の安定した標品を十分量入手すること
が可能であり、そしてそれぞれがｈＥＧＦの異る抗原決
定基と高い特異性をもって結合することができる複数の
抗体を用いることによって、高い感度と精度をもってｈ
ＥＧＦを測定する方法、並びにこの測定方法のためのキ
ットを提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の前記の目的は、遺伝子工学的手法を用いて高純
度に精製されたｈＥＧＦの製造が初めて可能となったこ
と（特願昭６０−２２６３０号明細書）、及びこの高純
度のｈＥＧＦを抗原として用いることによりｈＥＧＦの
２つの異る抗原決定基に対応する異るモノクローナル抗
体を製造することが可能になったこと（特願昭６０−１
４８２５４号明細書）を基礎にして達成可能となった。

従ってこの発明は、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的
に測定するためのキットであって、（ａｌヒト上皮細胞
成長因子の第１の抗原決定基と結合することができる第
１のモノクローナル抗体、（ｂ）ヒト上皮細胞成長因子
の第２の抗原決定基と結合することができる標識された
第２のモノクローナル抗体、（ｃ）前記第１のモノクロ
ーナル抗体を固定化することができる固体支持体、及び
（ｄ＋標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞
成長因子を含んで成るキット；ヒト上皮細胞成長因子を
免疫化学的に測定するためのキットであって、ｆａ）ヒ
ト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合すること
ができる第１のモノクローナル抗体を固定化した固体支
持体、（ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基
と結合することができる標識された第２のモノクローナ
ル抗体、及び（ｃ）標準品としての高純度に精製された
ヒト上皮細胞成長因子を含んで成るキット；並びに、ヒ
ト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定方法であって、（
１）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合す
ることができる第１のモノクローナル抗体を固定化した
固体担体と測定対象試料とを接触せしめる段階、（２）
前記段階（１）と同一段階として又は異る段階として、
前記固体担体をヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定
基と結合することができる標識された第２のモノクロー
ナル抗体と接触せしめる段階、及び（３）前記固体担体
上に固定化された第２のモノクローナル抗体の標識又は
固定化されなかった第２のモノクローナル抗体の標識を
測定する段階を含んで成る方法を提供しようとするもの
である。

皿定去犬 一般に免疫化学的測定法には、抗原抗体反応の段階にお
いて、標識抗原と非標識抗原とを競合させるか否かによ
って競合法と非競合法が存在する。

非競合法は測定が比較的化学量論的であって精度が高い
等の特徴を有するが、測定対象である抗原の異る２つの
抗原決定基のそれぞれに対応して特異的に結合する２種
類の抗体を必要とする。本発明は、前記のごとく、この
ような２種類のモノクローナル抗体の製造が可能になっ
たことにより、初めて完成されたものである。また、免
疫化学的測定法は、抗原抗体反応の結果抗原と抗体とが
結合して生じた結合型の部分（ｂｏｕｎｄ　＋　８）と
結合していない遊離型の部分（ｆｒｅｅ、Ｆ）とを物理
的に分離して測定する方式（Ｂ／Ｆ分離法（ヘテロジニ
アスな測定法）〕と、分離せずに測定する方式ＣＢ／Ｆ
非分離法（ホモジニアスな測定法）〕とに大別すること
ができる。この発明の方法は前者の方式に従って実施す
るのが有利である。このような方法として、例えば、い
わゆるサンドインチ法を挙げることができる。この方法
においては、第１図に示すように、ｈ、　Ｅ　Ｇ　Ｆの
第１の抗原決定基に特異的に結合する抗ｈＥＧＦモノク
ローナル抗体（第１抗体）が固体担体上に固定化する。

次に、この固体担体と測定サンプルとを接触せしめるこ
とにより前記第１抗体とｈＥＧＦの第１抗原決定基とが
結合する。次に、この固体担体と、ｈＥＧの第２抗原決
定基に特異的に結合することができる標識された抗ｈＥ
Ｇモノクローナル抗体（第２抗体）とを接触せしめるこ
とにより、第１抗体を介して固体担体に固定化されたｈ
ＥＧＦの第２抗原決定基と第２抗体とを結合せしめる。

上記の方法に代えて、サンプルと第２抗体とを同時に第
１抗体が固定化されている固体担体に接触せしめること
もできる。次に固体担体と液体の反応媒体とを分離し、
固体担体に結合した標識を測定することによりサンプル
中のｈＥＧＦの量を決定することができる。

１１３口」１晶 本発明においては、高純度に精製されたｈＥＧＦを、抗
体産性細胞の調製およびｈＥＧＦ測定のための標準品と
して使用する。ここで「高純度に精製されたＪとは実質
的に単一であるという意味であり、例えば純度約９０％
以上であり、約９５％以上が好ましく、純度９９％程度
以上のものが一層好ましい。このように高純度に精製さ
れたｈＥＧＦを大量に、かつ従来より低コストで製造す
るには、遺伝子工学的手法によりｈＥＧＦ造成したのち
精製する方法、特に本発明者らの共同研究者らにより提
案された方法〔特願昭６０−２２６３０号の明細書参照
〕に従って行うのが好ましい。この方法は下記の行程Ａ
−Ｃよりなることを特徴とする精製ｈＥＧＦの製造方法
である。すなわち（Ａ）（イ）シグナルペプチドをコー
ドする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端直後にｈ
ＥＧＦの構造遺伝子を結合させ得るものを含み、かつ予
定した宿主細胞内で増殖可能なベクターに、ｈＥＧＦを
コードする遺伝子を組込み、（ロ）この組換体によって
ダラム陰性微生物を形質転換させ、（／す得られる形質
転換された微生物を、微生物の増殖過程において対数増
殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘導
がおこるのに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
に付したのち、これを集め、に））ついでこの微生物を
オスモティック・ショック法によって処理することによ
りｈＥＧＦを含む両分を回収し；　（Ｂ）回収されたｈ
ＥＧＦを含む両分をイオン交換クロマトグラフィーに付
したのち、ｈＥＧＦ画分を回収し；そして（ｃ）上記で
回収されたｈＥＧＦを含む百分をさらに高速液体クロマ
トグラフィーに付したのち、ｈＥＧＦ画分を回収する。

モノクローナル 本発明においては、ｈＥＧＦの異る抗原決定基と特異的
に結合する２種類のモノクローナル抗体を必要とする。

このようなモノクローナル抗体の製造方法は次の通りで
ある。まず、■動物を高純度のｈＥＧＦで免疫すること
により抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍細胞と
を融合させることによりハイブリドーマを得、そして■
前記の特徴を有する抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを選択する。そして■このハイブ
リドーマを培養して、■培養物から目的とする抗ｈＥＧ
Ｆモノクローナル抗体を得る。なお、上記の一般的方法
それ自体は公知であり、例えば、特公昭５８−４５４０
７、特開昭５９−１２８３９７号各公報及び文献９に記
載されている。なお、このようなモノクローナル抗体の
具体的な製造方法は参考例１に後記する。

、−びその　　　法 本発明においては、第２モノクローナル抗体に標識を付
す。この標識としては、免疫化学的測定法において常用
されている任意の標識を使用することができ、例えば放
射性同位元素、例えば′３１■、＋２４１１．１４ｃ　
、　’ＩＨ等（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）；酵素
、例えばパーオキシダーゼ（例えば西洋ワサビパーオキ
シダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ等（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ）ｉ螢光
物質、例えばフルオレッセインイソシアネート、ローダ
ミン等（フルオロイムノアッセイ、　Ｆ　Ｉ　Ａ）等を
使用することができる。これらの標識を抗体等の蛋白質
に付加する一般的方法はすでに知られており（例えば、
文献１０〜１４）、それらの方法を本発明の第２モノク
ローナル抗体に適用すればよい。

また、これらの標識の検出方法としては、これらそれぞ
れの標識について常用されている検出方法を用いること
ができる。

例えば、標識として酵素を用いる場合、その基質として
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼに対しては過酸化
水素、アルカリホスファターゼに対してはバラニトロフ
ェノール・リン酸やフェノール・リン酸、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼに対してはオルトニトロフェノール−β−
Ｄ−Ｘガラクトシドが考えられる。

皿体推体 本発明においては、第１モノクローナル抗体を固体担体
に固定化して使用する。このような固体担体として、免
疫化学的測定法において常用されている任意の材質及び
形状の固体担体を使用することができる。材質としては
例えばポリスチレン、ポリカーボネート、アミノアルキ
ルシリルガラス、シリコンゴム等があり、形状としては
マイクロプレート、チューブ、キュベツト、ビーズ、ス
ティツク、ロッド、ディスク等がある。

丈■血■成ゑ 本発明においては、前記の各種の材料の他に種々の試薬
が使用される。例えば、第１抗体を固体担体にコートす
るためにコーティング緩衝液が使用され、この緩衝液と
しては、例えば炭酸緩衝液（ｐＨ９，７〜１０．０）　
、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）等を使用することができるが１、
：れに限定されない。また、分析サンプル中のｈＥＧＦ
の濃度を測定可能な範囲内にするために稀釈用緩衝液が
使用され、この緩衝液としてウシ胎児血清アルブミンを
含有する場合があるＰＢＳ　（、）（実施例１を参照の
こと）生理食塩水、トリス緩衝液等を使用することがで
きる。

さらに、測定実施の各反応段階において固体担体を洗浄
するために洗浄液が使用され、このために例えばＰ　Ｂ
　Ｓ　（−）　−Ｔｗｅｅｎ　ＣＰ　Ｂ　Ｓ　（−）に
Ｔｗｅｅｎ２０を０１０５％濃度に溶解したもの〕を使
用することができる。さらに、標識として酵素を使用す
る場合、使用する酵素の種類に応じて基質溶液が使用さ
れる。この基質として例えば前記したものを使用するこ
とができる。基質溶液を調製するための緩衝液としては
、標識として使用する酵素の種類により異るが、例えば
０．１　Ｍクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、等を使用する
ことができる。

皿定■尖施 第１抗体を固体担体に固定化するためには公知の方法を
用いることができる。例えば、第１抗体を前記のコーテ
ィング緩衝液に０．１〜１００μｇ／ｍ１の濃度に溶解
し、これを固体担体に適用し、そしてＯ℃〜３７℃にて
０．５〜１６時間インキュベートする。次にコーティン
グ溶液を除去し前記の洗浄液で数回洗浄する。

測定に当っては、必要に応じて測定用サンプルを前記の
稀釈用緩衝液により稀釈する。本発明の方法の測定感度
は０．０５〜５０ｎｇ／ｍＪであるから、サンプル中の
ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　ｔｉｌｔ度が１〜１０　ｎｇ／　ｒｒ
ｌとなるように稀釈するのが好ましく、サンプル中のｈ
ＥＧＦ濃度が予測できない場合には複数段階の稀釈液を
調製し、これらを使用するのが好ましい。

次に、必要に応じて上記のように稀釈されたサンプルと
第１抗体が固定化されている固体担体と接触せしめ、イ
ンキュベートする（第１段階）。

このインキュベーションは０℃〜３７℃にて３０〜１２
０分間行うのが好ましい。次にサンプルを除去し、前記
洗浄用液により固体担体を数回洗浄することにより固体
担体に非特異的に付着しているサンプルを除去する。次
に標識された第２抗体の溶液を前記洗浄された固体担体
と接触せしめることにより、第１段階において固定化さ
れたｈＥＧＦの第２抗原決定基と第２抗体とを特異的に
結合せしめる。固体担体と接触せしめる第２抗体の溶液
中の第２抗体の量が固体担体に固定化されたｈＥＧＦＯ
量に比べて過剰となることを条件として、第２抗体溶液
中の第２抗体の濃度及び該溶液の使用量は任意に選択す
ることができる。第２抗体溶液中の第２抗体の濃度は好
ましくは０．５〜５μｇ／ｍρである。

上記の方法に代えて、第１段階と第２段階とを同一段階
として実施することができる。この態様においては必要
に応じて稀釈されている場合があるサンプル溶液と上記
第２抗体溶液とを混合して固体担体に適用するか、又は
これらの溶液のそれぞれを同時に固体担体に適用するこ
とにより行うことができる。この場合、０℃〜３７℃に
て３０〜１２０分間インキュベートするのが好ましい。

次に、抗原に結合していない第２抗体等を除去するため
、前記の洗浄用液によって固体担体を洗浄する。

次に、固体担体上に固定化された標識を定性的又は定量
的に測定する。この測定方法は標識の種類によって異り
、常法に従って行うことができる。

例えば、標識が放射性同位元素である場合、液体シンチ
レーションカウンター、オートガンマ−カウンター等を
用いて放射能を測定する。また、標識が螢光物質である
場合、螢光量を分光光度計を用いて測定する。さらに、
標識が酵素である場合、その酵素の基質溶液を前記固体
担体と接触せしめる。例えば、標識として西洋ワサビパ
ーオキシダーゼを用いる場合、基質としての５ｍＭ過酸
化水素及び発色剤としての２，２′−アジノビス（３−
エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ
と略す）２．５ｍＭを含むＱ、　Ｉ　Ｍクエン酸緩衝液
を用いるのが好ましい。

次に、例えば室温で５〜１５分間インキュベートするこ
とにより酵素反応と発色を行い、反応を停止した後発色
の程度を常法に従って測定する。

測定された標識活性から抗原濃度を知るには、常法に従
って予じめ標準抗原と最終段階での標識活性との関係か
ら検量線を作成しておき、この検量線と被検液の吸光度
とを照合すればよい。

里定尻土二上 本発明の測定用キットは、第１の態様において（ａｌ　
ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの第１の抗原決定基と結合することがで
きる第１のモノクローナル抗体、Ｃｂ）　ｈ　Ｅ　Ｇ　
Ｆの第２の抗原決定基と結合することができる標識され
た第２のモノクローナル抗体、（ｃ１前記第１のモノク
ローナル抗体を固定化することができる固体支持体、及
びｆｄ）標準品としての高純度に精製されたｈＥＧＦを
含んで成り、そして第２の態様においては（ａ）　ｈ　
Ｅ　Ｇ　Ｆの第１の抗原決定基と結合することができる
第１のモノクローナル抗体を固定化した固体支持体、（
ｂｌ　ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの第２の抗原決定基と結合するこ
とができる標識された第２のモノクローナル抗体、及び
（ｃ）標準品としての高純度に精製されたｈＥＧＦを含
んで成る。第２の態様のキットは第１抗体が固定化され
た固定担体を含むのに対して第１のＧｆｆのキットは固
定化されていない第１抗体及び第１抗体を担持しない固
体支持体を含み、第１抗体の固体支持体への固定化はキ
ットの使用者によって行われる。

前記第１抗体（第１の態様の場合）、第２抗体及び標準
品ｈＥＧＦ標品は、固体標品であってもよく、すぐに使
用することができる溶液の形であってもよく又、測定に
際して適当に稀釈して使用する濃厚溶液の形であっても
よい。キットが、これらを溶液の形で含む場合、この溶
液には測定に悪影響を与えない防腐剤を加えることがで
きる。

この発明のキットは、上記のものを含んで成るが、測定
の便宜のために前に記載した他の試薬、例えば稀釈用溶
液、コーティング緩衝液、洗浄用溶液、標識が酵素であ
る場合には酵素基質及び発色試薬等を含むことができる
。しかしながらこれらは、測定者において常法に従って
容易に調製することができ、又は入手することができる
ものである。従ってこれらを含まないキットも本発明の
範囲内のものである。

〔発明の効果〕

本発明は、上記したように、高純度のｈＥＧＦ精製標品
およびこれを抗原として用いることにより調製した異る
抗原決定基に特異的に結合する２種類の抗ｈＥＧＦモノ
クローナル抗体を用いるイムノアンセイ法によるｈＥＧ
Ｆの測定法である。

従って従来用いられていた抗血清の代りにモノクローナ
ル抗体を用いるという点で抗血清を用いた場合の問題点
をすべて解決する。すなわち、非常に改良された測定感
度及び精度をもたらす。また上記の標品は常に安定した
品質を有するから、再現性の高い測定結果をもたらし、
この発明の方法は高い信頬性をもって多量のサンプルを
処理するのに有用である。

また、本発明のｈＥＧＦ測定用キットはこのような測定
法をより簡便に施行するための便利な手段を提供する。

従ってこのような測定法およびキットは、ｈＥＧＦの測
定法を確立するものであるということができ、生物学的
分野へ多大な貢献をなすものであるといえよう。

参考Ｌ　　ｌ　　　体の調−′ ｈＥＧＦとのみ反応する抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体
を以下のようにして調製した。

（１）　　細胞の調製 Ｂａ　１　ｂ／ｃマウスに、遺伝子工学的手法によって
造成し単離されたｈＥＧＦ　（前記特訓６０−２２６３
０号参照）３０μｇを腹腔内投与することにより免疫（
初回免疫）を行い、以後は１０日間の間隔で追加免疫を
１回行った。最終免疫終了後３日目にマウスより牌細胞
を無菌的に摘出し、この細胞をほぐしてＲＰＭＩ−１６
４０培地に懸濁したのち、ナイロンメツシュで濾過する
ことによりマウス牌細胞懸濁液（２Ｘ１０６個／ｍβ）
を調製した。

一方、上記細胞と融合させるマウス腫瘍細胞Ｐ、Ｕ１　
（フロー社）の懸濁液（ＲＰＭＩ−１６４０培地）を常
法に従って調製した。

（２）細胞融合 上記で調製したマウス牌細胞懸濁液とＰｉｌｌ細胞懸濁
液とを、肺細胞とＰ：ＩＵ１細胞との細胞数の比が１０
：１の割合になるように混合したのち遠心し、上清を除
去した。ついで遠心管底部の細胞に約４０％Ｐ　Ｅ　Ｇ
４０００含有ＰＢＳ　（−）溶液１ｍ７！をゆっくり滴
下した。これを４分間、３７℃で静置したのち、ＲＰＭ
Ｉ−’１６４０　（１０％Ｆ　Ｃ，Ｓ含）を添加するこ
とによりＰＥＧを希釈した。ついで遠心して上清を除去
したのち、最終的にＰ、ＵＩ１１１１胞の濃度が１．０
Ｘ１０’個／　ｍ　ＡになるようにＲＰ旧−１６４０（
１０％ＦＣ３含）で希釈後、９６ウエルのプレート１０
０μＥ／ウエルの割合で分注した。なお、このプレート
には予めフィーダー細胞として３週齢以内のＢａ　１　
ｂ／ｃマウスの胸腺細胞を５Ｘ１０５個／ウェルの割合
で１００μβ／ウエルずつ分注しておいた。

（３）ハイブリドーマの選択 上記融合操作の翌日から４日間毎日各ウェルの培地の半
１（１００μｌ）ずつをＨＡＴ培地に交換し、さらに、
１日おきにＨＡＴ培地により培地の交換を行いながら１
０日間培養を行ったのち、上清の分析を行い陽性反応を
示すウェルを６種選択し、ついで、これら６種のウェル
中のコロニーより細胞をとり出し限界希釈法によってク
ローニングし、６種類のハイブリドーマを樹立した。

（４）　　ハイブリドーマの培養および抗体の回収得ら
れた６種類のハイブリドーマを各々ＲＰＭＩ　−１６４
０（１０％ＦＣ３含）培地中、３７℃、５％炭酸ガスの
存在下、炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養
上清から硫安分画法により抗体を回収した。一方、同細
胞をマウス腹腔内に投与し抗体を腹水とし得、これを硫
安分画により粗分画しＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー法にて精製抗体を回収した。なお、これ
ら抗体の特徴づけを行ったところ、第１表に示すような
結果を得た。表中１ｇＧ＋／にの表現は、サブクラスが
ＩｇＧ、でその軽鎖がにであることを示す。

（５）抗体の特異性の確認 前記のモノクローナル抗体の特異性をエライザ（ＥＬＩ
ＳＡ法）によって確認した。

９６ウエルのプレート（ファルコン社）にｈＥＧＦおよ
びマウスＥＧＦ　（ｍＥＧＦ）を各々コーティング緩衝
液を用いて固定化し、さらに対照として抗原を固定化し
ていないウェルが同一系内に存在するプレートを用意し
た。そしてこのプレートを用いてＥＬＩＳＡ法に従って
本発明で得られた抗体の特異性を確認した。なお、その
ときの抗体（ハイブリドーマｌ−２−１１ｃ株、２４−
４株、２４−６株、２４−９株、２４−１１株及び７−
２−３−３株由来）の濃度はＰＢＳ　（−）で各々１．
１５．ｃｚ　ｇ　／　ｍ　ｉに調製して用いた。そのと
きの各ウェルの上清の吸光度ＯＤ４゜。

を第２表に示す。なお、本実験で用いた抗体は、マウス
腹水より裸取し、硫安分画を行ったのちＤＥＡＥ−セル
ロースカラムクロマトグラフィーにより精製したもので
あり、全てＩｇＧ＋／にであり、また抗体濃度も同一で
ある。そして第２表中ＯＤ４゜、の値は全て対照の値を
差し引いたものである。

第２表 （６）抗原決定基の確認 前記のｈＥＧＦとのみ反応する５種類のモノクローナル
抗体の特徴付けを、以下の方法に従ってその抗体が確認
している抗原決定基特異性を調べることによって行った
。

１）１２ＳＴによる抗体の標識 株ｌ−２−１１Ｇより産生され得られた抗体（以下抗体
は産生株基で記載する）１０μｇをＰＢＳ（−）５μｌ
に溶解し、これに０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
　１０　ｕ　ｌにＮａ”’Ｉ（０，５ｍＣ１）を溶解し
たものを加え、さらにクロラミンＴ　（２ｍｇ７ｍｌ！
０．４Ｍリン酸緩衝液（ρ）１７．４）　）の溶液５μ
ｌを加えたのち室温で３０秒混和した。ついで、この混
和液にナトリウムメタビサルフエート２ｍｇ／１ｓ１０
．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）の溶液５０μＡを加
え反応を停止した。ついでこの溶液に０．２％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）　４５０μｌを加えたのちセファデ
ックスＧ２５カラムクロマトグラフイー（Ｎａ１２５■
の溶出は０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で行った）を行い
未反応のＮ　ａ　Ｉ　２５　Ｉと標識化抗体とを分離し
た。そしてここで得られた標識化抗体は２５２８　Ｘ　
１０’ｃｐｍ／μｇであった。

ｉｉ　）競合反応を用いた抗体の特異性の確認ｈＥＧＦ
のみを固定化した各ウェルが切断可能な９６ウエルプレ
ート（グイナテック社）を用意し、各ウェルにＩｔＪ標
識化ｌ−２−１１Ｇ抗体２０μｍ　（１４６６００ｃｐ
ｍ、　　５．８ｎｇ抗体蛋白量）を加えたのち、各抗体
ｌ−２−１１Ｇ、２４−４．２４−６．２４−９および
２４−１１を重量比で上記標識化抗体に対して０．０１
．　０．１　　、０．２　　、０．５　　、１．２　．
５　　、１０，２０および１００となるように混和し、
各ウェルの最終容量が５０μｌとなるように０．２％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで調整した。ついでこのプレートを室温で
１５時間放置したのち、ｐＢｓ（−）−Ｔ賀ｅｅｎで２
回洗浄を行った。ついで各々のウェル中の１２５１の放
射活性をオートガンマ−カウンターで測定した。その結
果を第２図及び第３図に示す。なお、これらの図中Ｔは
反応系に放射性標識抗体のみを添加した時に抗原と結合
している放射性標識抗体のＣｐＨ１であり、そしてＢは
上記放射性標識抗体を含む系に非放射性抗体を添加（す
なわち、被検液を添加）したときの、抗原と結合してい
る放射性標識抗体のｃｐｍである。

この結果より、上記で得られた５種の抗体は大きく２つ
のグループに分けられた。すなわち１つは１．−２−１
１Ｇ抗体と性質の似た抗体２４−４とのグループ、もう
１つはｌ−２−１１Ｇ抗体とあまり競合性を示さない抗
体２４−６　、２４−９および２４−１１のグループで
ある。

参　例、２　高純度ｈＥＧＦの調１ 本発明で用いる高純度ｈＥＧＦは次の方法により製造し
た。

形質転換された微生物Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　
１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ　１５２２）を培養し、培養菌
体を集めてオスモティック上清を調製し、ＤＥＡＥ−Ｔ
ＯＹＯＰＥＡＲＬ　６５０Ｍを用いるイオン交換クロマ
トグラフィー、及びＨＣＬ　８０３０システムを用いる
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

こうして精製したｈＥＧＦ製品の純度を、常法であるポ
リアクリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体クロ
マトグラフィーにより決定した。

これらの結果より、純度は９９％以上であることがわか
った。そのときの電気泳動の結果は第４図に、示す通り
であった。なお、第４図中（イ）は電気泳動のゲルを模
写したものであり、矢印（Ｏ＝）がｈＥＧＦのバンドを
示し、また（０）はデンシトメトリーである。

次に、上記の標品をアミノ酸分析機ＨＬＣ−８２５ＡＡ
（東洋曹達）を用いてアミノ酸分析を行ったところアミ
ノ酸組成が文献値と完全に一致した。また、−次構造の
決定を文献・（１６）の方法に従って行い、さらに二次
構造の決定を行った。以上の結果、本発明で使用したｈ
ＥＧＦの一次構造及び二次構造は、１９７５年にグレゴ
リ−が提唱〔文献（２）　）　したもののそれと完全に
一致した。

実施例１゜ 本発明の方法を行うにあたりＡ０分析用プレート、およ
びＢ、酵素標識抗体を用意した。

Ａ、′−枦用プレートの１１１＋ ９６ウエルのプレート（ヌンク社）の各ウェルごとにコ
ーティング緩衝液（１００ｍ　Ｍ　ＮａＨＣＯ＋、５０
　ｍＭ　ＮａｚＣＯｓ　、ｐＨ９，７〜１０）に溶解し
た抗体（２４−１１）　（１０ｕ　ｇ／ｍｌ　）を５０
１ｔｌｌずつ各ウェルに分注し、室温で２時間放置後Ｐ
　Ｂ　Ｓ　（−）　−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。

ついでＰＢＳ　（−）（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）含有〕を加え２時間放置した後、ＰＢＳ　（）−Ｔ
ｗｅｅｎでさらに洗浄を行うことにより分析用プレート
を調製した。

ここでＰＢＳ　＜−）は、塩化ナトリウム８．０ｇ、リ
ン酸二水素カリウム（無水）’　０．２　ｇ、リン酸−
水素ナトリウム（無水）　１．１５ｇ、塩化カリウム０
．２ｇを混合し１０００ｍ　ｌにしたものである（ｐＨ
７゜４）。

また、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）−Ｔｗｅｅｎは、上記ＰＢＳ
（−）にＴｗｅｅｎ　２０　（０，５ｍｌ　／　Ｉｌ）
を添加したものである。

Ｂ、酵素標識ｒ体の調製 抗ｈＥＧＦＦモノクローナル抗体ｌ−２−１１Ｇ（１，
５ｍｇ）を１ｍ／のＰ　Ｂ　Ｓ　（−）に溶解し、つい
で２００μｌの１ｍＭ　５ＰＤＰ　　（Ｎ−サクシンイ
ジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート〕のエ
タノール溶液を攪拌しながら添加し、室温で３０分間反
応を行った。放置後セファデックス”Ｇ−２５カラムク
ロマトグラフイーを用い未反応の５ＰＤＰと抗体とを分
離した。そして所望抗体画分（３ｍｊｌりを集めた〔な
お、所望画分の溶出は０．１　Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍ
　ＣＨ：＋Ｃ００Ｎａ（ｐＨ４，５）で行った〕。つい
でこの画分に最終濃度が５０ｍＭとなるようにＤＴＴ　
（ジチオスレイトール）を添加し、室温で２０分間放置
後、再度セファデックス”Ｇ−２５カラムクロマトグラ
フイーによって抗体とＤＴＴとの分離を行い抗体画分（
約３ｍ１）を得た（溶出液は上記と同じ）（ＤＴＴ処理
抗体溶液）。

一方、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＰＯ）（０，５ｍ
ｇ）を１ｍＩ！のＰＢＳ（−）に溶解し、これに２５０
μｌの１　ｍＭ　５ＰＤＰエタノール溶液を撹拌しなが
ら添加し、室温で３０分間反応後、セファデックス”Ｇ
−２５カラクロマトグラフイーを行い５ＰＤＰと抗体と
の分離を行いＰＯ画分を得た（約３ｍ／）。

ついでこれ（３ｍ７りとＤＴＴ処理抗体溶液（３ｍｌ）
とを混合したのち室温で一夜放置することにより酵素標
識化抗体（第２抗体）を得た。

なお、この酵素標識抗体の活性の確認は、以下のように
して行った。すなわち、Ａの分析用プレートに酵素標識
抗体をＰＢＳ（−）で１００’、２００゜４００．８０
０．１６００，３２００，６４００．１２８００．２５
６００倍希釈溶液とし、２５μｌ／ウエルずつ添加後２
時間放置した。ついでＰＢＳ　（−）　−Ｔ碑ｅｅｎで
５回洗浄したのち、酵素活性測定のために基質として０
．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，２）にＡＢＴＳ　（
２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン）
−６−スルホン酸）２．５ｍＭと過酸化水素水５ｍＭと
を熔解したものを使用直前に調製し、これを１００μｌ
／ウエルの割合で注入後室温で５〜１５分間反応を行っ
た。ついで反応を停止（２ｍＭアジ化ナトリウムを１０
０μＩ！／ウエルで添加）したのちタイターチック・マ
ルチスキャン８　（フロー社）でＯＤ　４゜５を測定し
た。

そしてこの結果より、実施例における酵素標識化抗体の
濃度を４００倍希釈のものとしたくなお、決定基準はＯ
Ｄが２以上でかつバックグラウンドがほぼ０であるもの
とした）。

施例２ヒト尿中のｈＥＧＦの測 分析用プレー）Ａに人尿（０，２％牛血清アルブミン含
有ＰＢＳ　（−）で１０倍希釈、２０倍希釈したもの各
々）を２５μｌ／ウエルの割合で添加したのち室温で２
時間放置した。ついでこれをＰＢＳ　（）−Ｔｗｅｅｎ
で３回洗浄したのちＰＯ標識抗体を２５μｌ／ウエルの
割合で添加し、室温で２時間放置した。そして再びＰＢ
Ｓ　（）　−Ｔｗｅｅｎで洗浄を行ったのち、酵素の基
質を加え反応後、ＯＤ４゜、を測定した（前記実施例１
参照）。また、人尿（上記）の２０倍希釈したものにｈ
　Ｅ　Ｇ　Ｆ　濃度がｌｎｇ／ｍβ濃くなるように標準
のｈ　ＥＧＦを添加したものの分析を分析用プレー）Ａ
を用い上記と同様にして行った。

なおここでは、ｈＥＧＦの標準品を用いて標準曲線を予
め作成しておいた（第６図）。そしてこのときの結果を
第３表に示す。

第３表 段階的測定法において１０倍希釈、２０倍希釈した検体
から得られた測定値とｈＥＧＦ添加回収率の測定値とが
、妥当な相関関係を示し、このことは本検出法が、実用
的に利用し得ることを示すものである。

叉施■盈 上記実施例１で分析用プレートに被検液と酵素標識抗体
とを同時に加えたこと以外は同様に行った。ここで用い
た標準曲線を第７図に、また、測定結果を第４表に示す
。

＊、＊＊は第３表と同じ １段階測定法において、１０倍希釈、２０倍希釈した検
体から得られた測定値と、ｈＥＧＦ添加回収率の測定値
とが、妥当な相関関係を示し、このことは本検出法が、
実用的と利用し得ることを示すものである。

実施例４ 次の要素からなるキットを作成した。

キットＡ （ａ）　ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの第１モノクローナル抗体５０
ＩＪｇ：凍結乾燥物／１プレ一ト分。

（ｂｌ　ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの第２の抗原決定基と結合する
ことができる抗体１．５　ｍ　ｇを１．５　ｍ　ｇの西
洋ワサビパーオキシダーゼで標識した抗体ＩＱ、＋ＪＪ
を凍結乾燥したちの／１プレート分（使用時に０．２Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ　（−）で溶解し、４ｍｌとする）。

（ｃ１前記第１モノクローナル抗体を固定化することが
できる９６Ｆヌンク一イムノプレート１枚。

（ｄ）標準品としての高純度に精製されたｈＥＧＦ１ｐ
ｇ／ｍｌ　　（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−））１００μ
ｌの凍結乾燥物（ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　０．１μｇ）〔使用
時この全量を５００　μβの水で溶解しく０．２　ｐ　
ｇ／ｍ／！　）この液を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（
−）で希釈して標準液とする〕。

その他の試薬（場合によってはキットに含める）（ｅ）
第１モノクローナル抗体プレートへの固定化液：　０．
１　Ｍ　ＮａＨＣＯｔ、５０　ｍＭ　ＮａｚＣＯ：＋（
ｐＨ９，７〜１０．０）　５　ｍｌｌ　。

（ｆ）第２抗体の希釈液及びサンプル希釈液＝０．２％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−）　２０ｒｒＷ！の凍結乾燥物
（使用時に蒸留水２Ｑｍｊ！で溶かして使用）。

（ｇ）発色基質：　１０ｍｇＡＢＴＳ　（粉末）／１プ
レート分 （ｈ）発色基質溶解液：　　（ｐＨ４，４）　　１０ｍ
ｌの凍結乾燥物（使用時に１０ｍ１の蒸留水で溶かし使
用す・る）。

（１）反応停止液：２ｍＭアジ化ナトリウム液１０ｍ１
゜ （ｊ）ブロッキング液：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−）
３Ｑｍｌを凍結乾燥したもの（使用時に蒸留水３０ｍ／
で溶かして使用）。

化）洗浄液：　０．０５％Ｔｗｅｅ−２０含有ＰＢＳ　
（−）　１４０ｍｌ 注）Ｈ２０□：現地調達。

キットＢ （ａｌ　ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの第１の抗原結定基と結合する
ことができる第１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｔ
ｌコーティング緩衝液）を５０μβづつ９６Ｆヌンクー
イムノプレートの各つ耳ルに分注し、室温で２時間反応
させた後、洗浄液で３回洗浄し、１％ＢＡＳ含有ＰＢＳ
　（−）３００μｌ／ウエルで分注して、室温で２時間
反応させた後、再度洗浄液で３回洗浄したもの。

（ｂｌキットＡの（ｂ）と同様 （ｃ）キットＡの＋ｄ）と同様。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）ｆｄ
ｌキットＡの（ｅ）と同様。

（ｅｌキットＡの（ｆｌと同様。

（ｆ）キットＡの（幻と同様。

（ｇｌキットＡの（ｈｌと同様。

（ｈｌキットＡの（１１と同様。

（１）キットＡの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／　ＰＢ
Ｓ（−）８０ｍ　ｌ注）Ｈ２０□：現地調達。

引用文献 １）プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ。

ユナイティド・ステイク・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７２．１
３１７（１９７５）。

２）ネイチ＋　　　（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５７．３２
５（１９７５）。

３）　同上　　（〃　）、３旦、　４１４（１９８４）
。

４）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ２０、２
６７（１９７６）。

６）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）＋　２５０．４２９
７（１９７５）。

７）同上　、　２５７．３０５３（１９８２）。

８）ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジ
ー・アンド・メタボリズム（Ｊ、Ｃｌ１ｎｉｃ。

９）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メンズ（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、３９，２８５
〜３０８（１９８０）。

１０）ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド
・サイトケミストリー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏ。

Ｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、　２２．１０８４
　（１９７４）。

１１）イム／ケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｏｒ　　＋鉦、　４３（１９６３）。

１２）　　同上　　、　８．８７Ｈ１９７１）。

１３）ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）、　７８．２３５（１９７５）。

１４）フルオレッセイント　アンティボデイメソズ（Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）アカデミツク・プレス刊。

１５）代謝、１７．５１（１９８０）。

１６）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２５６．７９９０−
７９９７（１９８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｈＥＧＦ測定法の模式図の１例である
。 第２図及び第３図はこの発明に使用するモノクローナル
抗体の抗原決定基特異性を説明するグラフである。 第４図はこの発明において使用した抗原ｈＥＧＦの純度
を電気泳動により決定した結果であり、図中（イ）は電
気泳動のゲルを模写したものであり、（０）はそのデン
シトメトリーである。 第５図はこの発明において使用した抗原ｈＥＧＦの高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す。 第６図及び第７図は、本発明の測定を行ったときの標準
曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的に測定するため
   のキットであって、 （ａ）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１のモノクローナル抗体； （ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基と結合
   することができる標識された第２のモノクローナル抗体
   ； （ｃ）前記第１のモノクローナル抗体を固定化すること
   ができる固体支持体；及び （ｄ）標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞
   成長因子； を含んで成るキット。 ２、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的に測定するため
   のキットであって、 （ａ）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１のモノクローナル抗体を固定化し
   た固体支持体； （ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基と結合
   することができる標識された第２のモノクローナル抗体
   ；及び （ｃ）標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞
   成長因子； を含んで成るキット。 ３、ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定方法であっ
   て、 （１）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１のモノクローナル抗体を固定化し
   た固体担体と測定対象試料とを接触せしめる段階； （２）前記段階（１）と同一段階として又は異る段階と
   して、前記固体担体をヒト上皮細胞成長因子の第２の抗
   原決定基と結合することができる標識された第２のモノ
   クローナル抗体と接触せしめる段階；及び （３）前記固定担体上に固定化された第２のモノクロー
   ナル抗体の標識又は固定化されなかった第２のモノクロ
   ーナル抗体の標識を測定する段階； を含んで成る方法。